基于抗体靶向的凤眼莲多糖及其在制备抗alv-j药物中的应用
阅读说明：本技术 基于抗体靶向的凤眼莲多糖及其在制备抗alv-j药物中的应用 (Eichhornia crassipes polysaccharide based on antibody targeting and application of eichhornia crassipes polysaccharide in preparation of anti-ALV-J drugs ) 是由 刘建柱 李克鑫 王振峰 刘丙艳 潘云鑫 邢仁增 于 2021-07-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于抗体靶向的凤眼莲多糖及其在制备抗ALV-J药物中的应用,属于抗病毒药物技术领域,本发明首次发现凤眼莲多糖对J亚型禽白血病病毒具有较好的抑制活性,可以开发成抗病毒药物。为进一步提高凤眼莲多糖的抗病毒效果,本发明将凤眼莲多糖进行抗体修饰,构建了基于抗体靶向的凤眼莲多糖复合物。本发明所构建的凤眼莲多糖复合物能够增强凤眼莲多糖的抗ALV-J活性,降低生物体毒副作用。(The invention discloses an antibody-targeting-based eichhornia crassipes polysaccharide and application thereof in preparation of an anti-ALV-J medicament, belongs to the technical field of antiviral medicaments, and finds that the eichhornia crassipes polysaccharide has good inhibitory activity on J subtype avian leukemia viruses for the first time and can be developed into an antiviral medicament. In order to further improve the antiviral effect of the eichhornia crassipes polysaccharide, the invention modifies the eichhornia crassipes polysaccharide by using an antibody, and constructs an antibody-targeting eichhornia crassipes polysaccharide compound. The eichhornia crassipes polysaccharide compound constructed by the invention can enhance the ALV-J resistance activity of the eichhornia crassipes polysaccharide and reduce the toxic and side effects of organisms.)
技术领域
本发明涉及抗病毒药物技术领域，具体涉及一种基于抗体靶向的凤眼莲多糖及其在制备抗ALV-J药物中的应用。
背景技术
凤眼莲(Eichhornia crassipes)属雨久花科、凤眼莲属，俗名水葫芦，为漂浮生恶性杂草，主要以克隆生长的方式迅速在水体中繁衍、滋生。目前凤眼莲的主要用途是利用其对污水的净化，凤眼莲活体对水体中重金属有较强的去除作用，以及用作饲料、造纸的原料等。
多糖是凤眼莲的活性成分之一，但目前对于凤眼莲多糖的研究报道相对较少。王成梅利用碱提法分别从凤眼莲的茎和叶中提取出多糖，并对其进行分离、纯化，利用凤眼莲多糖吸水性的特点而制备出一种新型的高吸水性树脂(“凤眼莲多糖的提取、分离及结构分析”，福建农林大学硕士学位论文)。刘蒙稣采用超声波提取法提取凤眼莲多糖，并将凤眼莲多糖与长链脂肪醇通过直接苷化法合成系列C10-、C12-、C14-APG，其具有优异的乳化性与低泡性能(“基于凤眼莲多糖提取物制备烷基多苷及其表面性能研究”，东华大学硕士学位论文)。余陈君达等从凤眼莲叶片和茎部分别提取多糖，研究其免疫生物活性，从免疫功能低下的小鼠免疫功能恢复实验得出其具有提高免疫功能的作用且不影响体重(“凤眼莲多糖的提取及部分性质”，生物技术，第17卷第2期，2007年4月)。抗病毒虽然是多糖的生物活性之一，但不同来源、不同单糖组成的多糖，其生物学活性表现也各不相同，目前还未见有凤眼莲多糖在抗病毒方面的报道。
ALV-J是某种ALV和鸡的内源性反转录病毒的EAV科的囊膜样遗传序列间的遗传重组形成的，既具有其他ALV亚群病毒的一些特征，又有明显不同。ALV-J是一种新的外源性禽白血病病毒(Payne et al.,1992)。ALV-J可以感染多种品种鸡，引起感染鸡的免疫抑制和肿瘤，甚至死亡。其亚临床感染造成的鸡群生产性能降低和继发感染等也给养禽业造成重大损失。由于ALV-J基因序列的复杂性及其抗原变异性，目前仍缺乏有效的疫苗和药物。
而且，病毒和动物细胞均不具有细胞壁，在开发抗病毒药物时无法像抗菌药物一样针对细胞壁作为靶点进行研究，导致大部分抗病毒药物不能完全识别作用对象，难以避免对动物细胞产生毒性(Elsayed et al.,2020；赵西太等,2017)。因此，如何提高药物在动物体内抗病毒活性，同时减小对动物本身的毒性是抗病毒药物研究开发需要考虑的重要问题(Clercq，2010)。
在抗病毒药物研究中，除通过改变药物结构这一途径提高药效降低毒副作用外，通过选择合适的剂型和给药途径来降低其生物毒性，提高抗病毒效果(Sudeep et al.,2019；Pizzorno et al.,2019)，同样是科研工作者密切关注的方向。
抗原抗体结合是生物医学的重要研究领域，基于抗体靶向的抗肿瘤药物治疗是当前生物医学的热点研究方向(颜家耀等,2021)，但基于抗体对病毒亲和作用的抗病毒药物研究报道目前依然较少(Zhu et al.,2019)。通过抗体对病毒抗原的特异性识别和亲和作用，设计基于抗体对病毒靶向的药物制剂，对于提高药物向特定组织和细胞的选择性递送，增加药物在病毒聚集区的浓度，减少在其它组织的分布，从而在降低药物对正常组织细胞毒副作用的同时，提高药物的抗病毒效果，将具有重要的科学意义和研究价值。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种基于抗体靶向的凤眼莲多糖及其在制备抗ALV-J药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供凤眼莲多糖在制备抗ALV-J药物中的应用。
本发明的第二方面，提供一种基于抗体靶向的凤眼莲多糖复合物，由如下方法制备而成：
(1)将壳聚糖溶于醋酸溶液中，调节pH至4.5-5.5，离心除去未溶杂质，分离得到上清液；向上清液中加入ALV-J单克隆抗体、碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，持续搅拌反应1.5-2.5h；向反应后的溶液中加入乙醇沉淀反应产物，分离沉淀，干燥，制备得到抗体壳聚糖复合物(Ab-CS)；
(2)将抗体壳聚糖复合物溶解配成1-3mg/ml的水溶液，向水溶液中逐滴加入凤眼莲多糖溶液，持续搅拌30-60min，得到第一溶液；在搅拌条件下将三聚磷酸钠溶液逐滴加入到第一溶液中，继续搅拌20-40min，再加入表面活性剂，继续搅拌60-90min，离心，分离沉淀，即制备得到基于抗体靶向的凤眼莲多糖复合物。
优选的，步骤(1)中，所述醋酸溶液的质量浓度为1％；壳聚糖与醋酸溶液加入量的比为2.2mg：1ml。
优选的，步骤(1)中，壳聚糖与ALV-J单克隆抗体加入量的比为2.2mg：20μL。
优选的，步骤(2)中，所述凤眼莲多糖溶液的浓度为600μg/mL；凤眼莲多糖的加入量为壳聚糖重量的20％。
优选的，步骤(2)中，所述三聚磷酸钠溶液的浓度为4mg/mL；三聚磷酸钠与壳聚糖加入的重量比为1:8。
优选的，步骤(2)中，所述表面活性剂为泊洛沙姆。
上述方法制备的基于抗体靶向的凤眼莲多糖复合物，其平均粒径为290nm，PDI＝0.27，表明整体纳米粒粒径均匀，离散度较小。
本发明的第三方面，提供基于抗体靶向的凤眼莲多糖复合物在制备靶向抗病毒药物中的应用。
优选的，所述靶向抗病毒药物为靶向抗ALV-J药物。
本发明的有益效果：
(1)本发明首次发现凤眼莲多糖对J亚型禽白血病病毒(ALV-J)具有较好的抑制活性，可以开发成抗病毒药物。
(2)为进一步提高凤眼莲多糖的抗病毒效果，本发明将凤眼莲多糖进行抗体修饰，构建了基于抗体靶向的凤眼莲多糖复合物。本发明所构建的凤眼莲多糖复合物能够增强凤眼莲多糖的抗ALV-J活性，降低生物体毒副作用。
附图说明
图1：Ab-CS复合物合成示意图。
图2：CS及Ab-CS复合物凝胶色谱流出曲线图。
图3：抗体、壳聚糖及物Ab-CS复合物红外光谱图(A)及局部放大图(B)。
图4：Ab-CS-ECPs NPs TEM图。
图5：Ab-CS-ECPs NPs粒径分布图。
图6：Ab-CS-ECPs与CS-ECPs DDS粒径、包封率及载药量比较；图中，NPs表示未偶联抗体的纳米药物(CS-ECPs)；Ab-NPs表示偶联抗体的纳米药物(Ab-CS-ECPs)。
图7：Ab-CS-ECPs NPs与CS-ECPs的体外释放比较；图中，NPs表示未偶联抗体的纳米药物(CS-ECPs)；Ab-NPs表示偶联抗体的纳米药物(Ab-CS-ECPs)。
图8：Ab-CS-ECPsDDS细胞毒性结果。
图9：体外荧光标记实验；(A)感染ALV-J的DF-1细胞与Ab-CS-FITC共孵育；(B)正常DF-1细胞与Ab-CS-FITC共孵育；(C)荧光强度统计结果。
图10：纳米药物抑制鸡体内各器官ALV-J复制研究。
图11：ELISA方法检测Ab-CS-ECPs的体外抗病毒活性。
图12：纳米药物对鸡体内ALV-J复制的影响。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中，部分试剂与耗材的来源如下：
1日龄雏鸡购自东岳种禽有限公司；ALV-J单克隆抗体JE9(秦爱建,2001)，由山东农业大学提供；公众自本专利申请日之日起20年内可从申请人处获得ALV-J单克隆抗体JE9以用于重复本试验。
实施例1：凤眼莲多糖的提取、纯化
将冷冻干燥后的凤眼莲茎和叶粉碎过100目筛，加入10重量倍的水浸泡过夜，然后在90℃的条件下浸提3h，过滤，将滤液浓缩至相对密度为1.05-1.15(50℃测)，离心除去杂质，得到浸提液；向浸提液中加入体积浓度为95％的乙醇，边加边搅拌，使乙醇的终浓度为70％，静置，离心，分离沉淀，沉淀于60℃干燥，制备得到ECPs70；向分离沉淀后的上清液中加入体积浓度为95％的乙醇，边加边搅拌，使乙醇的终浓度为50％，静置，离心，分离沉淀，沉淀于60℃干燥，制备得到ECPs50；将ECPs70和ECPs50混合均匀，加水溶解，用0.3mol/L的NaOH调pH值至中性；按照体积比1:1的比例加入3％的三氯乙酸除蛋白，静止数小时，离心弃沉淀。浓缩除蛋白后用95％乙醇洗涤，再浓缩，冻干得粗多糖样品。将粗多糖样品使用透析袋透析3天，得到凤眼莲多糖(ECPs)。
实施例2：基于抗体靶向的凤眼莲多糖复合物的制备及表征
1.凤眼莲多糖复合物的制备：
(1)抗体壳聚糖复合物(Ab-CS)的制备：
向1ml质量浓度为1％的醋酸溶液中加入2.2mg壳聚糖，室温下搅拌至完全溶解，用10％NaOH溶液调pH值至5，4000r/min低速离心3min去除未溶杂质，取上清液至烧杯中，加入JE9单克隆抗体20μL，磁力搅拌15min，再加入催化剂EDC 0.1ml和NHS0.11ml，活化单抗羧基并与壳聚糖的氨基进行缩合反应，持续搅拌2h。向反应溶液中加入10倍量乙醇沉淀反应产物Ab-CS，离心弃掉上清液中的副产物，沉淀加乙醇重悬并离心洗涤2次，冻干备用。
(2)基于抗体靶向的凤眼莲多糖复合物(Ab-CS-ECPsNPs)的制备：
将步骤(1)制备的Ab-CS溶解配成2mg/mL的水溶液，逐滴加入实施例1制备的凤眼莲多糖溶液(600μg/mL)，凤眼莲多糖的加入量为壳聚糖重量的20％，持续磁力搅拌30min，使凤眼莲多糖与壳聚糖吸附自组装，得到第一溶液。500r/min室温磁力搅拌下，将4mg/mL三聚磷酸钠溶液逐滴加入第一溶液中(三聚磷酸钠与壳聚糖的重量比为1:8)，继续搅拌30min，再加入1％P188溶液(将1gP188溶于100ml的水中)，第一溶液与1％P188溶液的体积比为1:0.5，继续搅拌1h。4℃条件下12000r/min离心30min，弃掉上清液，分离沉淀，干燥，即制备得到基于抗体靶向的凤眼莲多糖复合物(Ab-CS-ECPsNPs)。
除不加凤眼莲多糖外，同法制备偶联抗体的空白纳米药物(Ab-CS NPs)。
除不加JE9单抗外，同法制备未偶联抗体的壳聚糖-凤眼莲多糖纳米药物(CS-ECPsNPs)。
2.凤眼莲多糖复合物(Ab-CS-ECPsNPs)的理化表征：
2.1红外光谱表征：
分别取ALV-J单克隆抗体JE9(Ab)、壳聚糖(CS)、Ab-CS复合物冻干粉2mg，与KBr粉末混合压片，在波数400～4000cm-1内用红外光谱仪扫描红外吸收图谱。
本发明通过两步反应合成Ab-CS复合物(图1)。首先，抗体中的-COOH与EDC发生结合，形成不稳定的中间体，再与NHS发生反应形成稳定的活化状态，最后再与壳聚糖上的-NH2发生结合，形成稳定的O＝C-NH结构。为避免活性中间体Ⅰ与抗体自身的-NH2发生结合，实验所用壳聚糖的量远远大于抗体，并且在反应前先将抗体与壳聚糖混合再进行活化，从而减少了抗体与抗体接触导致自身缩合的现象。同时，为防止副产物Ⅱ的干扰，实验采用乙醇沉淀纯化反应产物Ab-CS。
为鉴定抗体是否与壳聚糖反应生成了Ab-CS复合物，我们采用葡聚糖凝胶分子排阻色谱对反应产物进行分离，结果如图2所示，相对于反应前第15洗脱管处壳聚糖的色谱峰，反应后混合产物在第7洗脱管处有一小色谱峰，表明抗体与壳聚糖结合生成了分子量更大的Ab-CS复合物。同时与第15洗脱管处的壳聚糖吸收峰相比，Ab-CS复合物的吸收峰所占比例非常之小。表明在此反应中壳聚糖过量，参与反应的壳聚糖比例较小，从而既保证抗体能够完全反应，又避免了抗体的自聚现象。
通过葡聚糖凝胶分子排阻色谱分离反应产物Ab-CS复合物，采用红外光谱考察Ab-CS复合物的结构，结果如图3所示，抗体与壳聚糖结合生成Ab-CS复合物后，抗体在3300cm-1波数区羧基O-H振动吸收峰消失，同时在1690cm-1波数区羧基C＝O振动吸收峰减弱，与1675cm-1波数区酰胺基C＝O振动吸收重合，表明通过抗体上面的羧基与壳聚糖的氨基缩合生成酰胺键将抗体与壳聚糖结合生成Ab-CS复合物。
2.2透射电镜(TEM)表征：
为考察连接抗体后凤眼莲多糖的形态及分散性，将制备的基于抗体靶向的凤眼莲多糖复合物(Ab-CS-ECPsNPs)加水重新分散得到Ab-CS-ECPsNPs混悬液。取少量新鲜制备的Ab-CS-ECPsNPs混悬液滴于电镜制样用铜网上，经2％磷钨酸溶液负染晾干后，置于TEM下分析。
本发明所制备的凤眼莲多糖复合物(Ab-CS-ECPsNPs)的透射电镜图如图4所示。纳米粒形态圆整，粒径分布较为均匀，互不粘连、分散性良好。
2.3粒径及分布表征：
取适量Ab-CS-ECPs NPs混悬液，用水稀释后，采用马尔文动态激光粒度分析仪测定纳米粒粒径和PDI。
结果如图5所示，所制备的Ab-CS-ECPs NPs粒径分布为单峰正态分布，粒径分布区域较窄，平均粒径为290nm，PDI＝0.27，表明整体纳米粒粒径均匀，离散度较小。
2.4包封率及载药量测定：
取Ab-CS-ECPs NPs 4℃离心上清液0.5mL，DEAE-52柱分离，苯酚-硫酸法测定游离凤眼莲多糖含量，采用间接法计算载药纳米药物的包封率。同时，取Ab-CS-ECPs NPs冻干粉适量，加入1mol/L的HCl溶液，破坏壳聚糖纳米粒结构释放凤眼莲多糖，采用DEAE-52柱分离测定测定游离多糖含量，计算纳米药物的载药量。
对比接抗体前后所制备纳米药物的粒径、包封率及载药量，结果如图6所示，接抗体后所制备的Ab-CS-ECPsNPs粒径稍有增加，包封率和载药量轻微下降，但均无显著性差异，表明壳聚糖接入抗体后，对纳米药物的粒径、包封率及载药量没有明显影响。
2.5体外释放试验：
为考察连接抗体对药物释放行为的影响，分别精密移取Ab-CS-ECPs NPs和CS-ECPs NPs各10mL，分散于20mL pH 7.4的等渗PBS溶液中，60r/min置于恒温振荡器中37℃恒温振荡，分别于0、0.5、l、2、4、6、8、12、24和48h取样，每次取1mL，采用DEAE-52柱分离，苯酚硫酸法测定释放凤眼莲多糖量，计算载药纳米药物的释放率。
结果如图7所示。Ab-CS-ECPs NPs在最初的12h为突释阶段，此阶段迅速释放，然后进入缓释阶段，两者在120h内的总释放量和各个时间点的释放度没有显著性差异(P>0.05)，表明连接抗体后纳米药物的释放行为没有受到影响，仍然具有较好的缓释效果。
试验例1：凤眼莲多糖复合物(Ab-CS-ECPsNPs)毒理研究
为了考察Ab-CS-ECPsNPs对体外培养DF-1细胞是否具有细胞毒性作用，分别使用不同浓度的抗体纳米药物(以凤眼莲多糖计浓度为400、200、100、50、25μg/mL)和空白抗体纳米药物(Ab-CS)的DMEM培养基培养DF-1细胞，使用CCK-8检测不同浓度药物对DF-1细胞活性的影响。
其细胞存活率结果如图8所示。结果表明，当凤眼莲多糖终浓度在25～400μg/mL浓度范围内，细胞的生存状况良好，存活率均在90％以上，说明无论是空白Ab-CS纳米粒或者是载药纳米药物在不高于400μg/mL浓度下，对体外培养DF-1细胞没有明显的细胞毒性作用。
试验例2：凤眼莲多糖复合物(Ab-CS-ECPsNPs)体内外ALV-J靶向试验
1.Ab-CS-ECPsNPs细胞靶向研究
为考察Ab-CS-ECPsNPs是否对ALV-J保持亲和作用，用FITC代替凤眼莲多糖，将FITC包裹于Ab-CSNPs中，制备得到Ab-CS-FITC NPs，与接种ALV-J的DF-1细胞共培养，研究不同时间，抗体纳米药物中FITC在细胞内荧光信号强度情况。具体操作如下：将细胞悬液接种于底部铺有细胞爬片的24孔细胞板，待2h后在其中一个板上加入103TCID50的ALV-J病毒液，将细胞板置于37℃5％CO2培养箱中培养；待DF-1细胞贴壁生长至50％，加入Ab-CS-FITCNPs与DF-1细胞共孵育。分别于孵育后1、12、48h取细胞爬片，置荧光显微镜下观察荧光强度，同法用未感染ALV-J的DF-1细胞做对照实验。
结果如图9所示，在共孵育的48h内，A、B组细胞均保持明亮的荧光信号，这表明壳聚糖纳米粒连接抗体后在细胞仍然保持良好的缓释效果，但在共孵育的第1和12h，感染ALV-J的DF-1细胞荧光强度明显高于正常DF-1细胞(图9A，B)。
同时收集所培养DF-1细胞加入1mol/L的HCl溶液，破坏细胞和壳聚糖纳米粒结构释放FITC，采用荧光光谱法测定进入FITC的荧光强度，结果如图9C所示，在前12h，感染ALV-J的DF-1细胞中FITC的荧光强度显著高于正常DF-1细胞(P<0.01)，显示Ab-CS-FITCNPs进入感染ALV-J的DF-1细胞后，由于抗体与病毒的亲和作用，减弱了纳米药物从细胞离开的程度，从而使其进入细胞的速度和在细胞内的浓度均明显提高，从侧面反映了Ab-CS-ECPsNPs对ALV-J的靶向性。
2.Ab-CS-ECPsNPs体内靶器官抑制ALV-J复制研究
取18日龄健康雏鸡6只和ALV-J染毒雏鸡18只，按照表1随机分为4组，每组6只，肌肉注射药物，分别于注射后7d剖杀，摘取肝、肾、胸腺、脾脏及法氏囊，提取病毒RNA，反转录成cDNA后，通过相对荧光定量PCR测定各器官中的病毒拷贝数，考察药物对靶器官中ALV-J复制的抑制效果。
表1：体内靶器官抑制ALV-J复制分组
实验结果如图10所示，相比于ALV-J阳性对照组，CS-ECPs和Ab-CS-ECPs组中ALV-J复制量均显著下降，表明Ab-CS-ECPsNPs和CS-ECPsNPs对ALV-J复制均有一定抑制作用，但相对CS-ECPs组，Ab-CS-ECPs组中5个器官ALV-J下降更明显，显示Ab-CS-ECPs NPs具有更优的抑制效果，表明Ab-CS-ECPs NPs在体内不仅具有分布靶向性，更因为靶向分布增加了药物在病毒区的浓度，增加了其对ALV-J抑制作用，显示出更好的抗病毒效果。
试验例3：凤眼莲多糖复合物(Ab-CS-ECPsNPs)体内外抗病毒活性研究
1.Ab-CS-ECPsNPs体外抗病毒活性表征
为考察Ab-CS-ECPsNPs是否提高了抗ALV-J的活性，将Ab-CS-ECPsNPs与接种ALV-J的DF-1细胞共孵育，研究不同时间，Ab-CS-ECPs NPs对细胞内ALV-J的抑制情况。实验分组如表2所示，将细胞悬液接种于6孔细胞板中，待长到60％时加入100μL 103TCID50病毒液，2h后加入用1％FBS细胞维持液配制的各浓度药物，随后放置于培养箱中37℃培养，连续6天每天取细胞上清进行p27检测，研究在药物的作用下ALV-J在DF-1细胞上的释放行为。
表2：体外抗病毒活性试验分组信息
注：Ab-CS组为纳米药物中剂量组所需Ab-CS的浓度。
通过DF-1细胞上清中的p27抗原检测考察体外抗病毒活性试验结果如图11所示。Ab-CS组与ALV-J对照组相比，p27释放没有显著差别，表明所采用的JE9抗体因浓度过低，无法有效抑制ALV-J复制。CS-ECPs-中和Ab-CS-ECPs-低、中剂量组均可以有效抑制p27释放，Ab-CS-ECPs-低，短时间内抑制p27释放的能力高于CS-ECPs-中，表明CS-ECPs连接抗体后，更容易进入细胞从而有效抑制ALV-J复制，这与荧光标记的结论一致。但随着时间延长，细胞内凤眼莲多糖消耗，Ab-CS-ECPs-低的优势减弱，抑制p27释放的能力低于CS-ECPs-中，但Ab-CS-ECPs-中抑制p27释放的效果一直保持显著，表明抗体可显著增强纳米药物靶向进入病毒细胞并提高药物的抗病毒能力。
2.Ab-CS-ECPsNPs体内抗病毒活性
2.1ALV-J体内感染模型建立及分组
90只1日龄雏鸡，随机分为5组，严格饲养管理。每组18只，1日龄时通过腹腔注射0.1mL104TCID50病毒悬液，分别于3和11日龄时肌肉注射给予含不同剂量药物的PBS注射液0.4mL，具体分组及给药信息如表3所示，严格隔离饲养，连续饲养6周。自7日龄起每周监测各组鸡只体重，并采集泄殖腔棉拭子。分别于7日龄(1w)、21日龄(3w)、42日龄(6w)分三批剖杀，观察大体剖检及组织病理学变化；同时，摘取肝脏、肾脏、胸腺、脾脏、法氏囊等器官，用福尔马林固定制备组织切片用于病理分析。
表3：体内抗病毒活性试验分组信息
2.2泄殖腔排毒监测
1日龄雏鸡进行病毒接种后，自7日龄起每周监测各组鸡只体重，每组随机选取3只雏鸡采集泄殖腔棉拭子，连续6周。将采集的泄殖腔棉拭子置于2mL离心管中，加入抗原稀释液1mL于-20℃反复冻融两次，低速离心后取上清，用ELISA方法检测其中ALV-J p27抗原监测感染鸡排毒情况，按照IDEXX公司的Avian Leukosis Virus p27 Antigen Test Kit说明书进行具体操作。
结果发现，正常对照组鸡群在6周内一直无排毒现象，表明各组鸡群在饲养过程中不存在交叉传染现象，接毒对照组鸡群在第2周出现明显的排毒现象并持续提高，Ab-CS空白对照组与接毒组没有显著性差别。CS-ECPs组和Ab-CS-ECPs组排毒剂量均明显降低，Ab-CS-ECPs组抑制排毒效果更明显(P<0.05)。
2.3血浆病毒载量检测
每次剖杀时采集血浆，提取病毒RNA，反转录成cDNA后，以β-actin作为内参，通过相对荧光定量PCR检测ALV-J的拷贝数，从转录水平考察Ab-CS-ECPs NPs体内抗ALV-J的活性。
结果如图12所示，与ALV-J组相比，Ab-CS组ALV-J的病毒载量轻微下降但没有显著差别。CS-ECPs组由于纳米药物的缓释作用，7日龄的抑制效果并不明显，在21日龄可显著抑制ALV-J的复制(P<0.05)，但到42日龄病毒拷贝数再次升高，表明抑制作用减弱。与CS-ECPs组相比，Ab-CS-ECPs组显示出持续稳定地抑制ALV-J复制的作用，其抑制ALV-J复制与时间几乎无相关性，表明Ab-CS-ECPs组药物进入细胞后，由于抗体对病毒的亲和作用，药物可在病毒靶向细胞内聚集并持续释放，从而显示出较好的抑制效果。同时，由于药物与病毒的亲和作用，使得药物进入细胞后减弱了再次扩散返回血液循环的几率，从而使得药物在体内可以较长时间维持有效作用浓度，显示出长时间的抗病毒效果。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
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