阅读说明：本技术 一种基于硅量子点、荧光素标记的dna、剪切酶的汞离子荧光检测方法 (Mercury ion fluorescence detection method based on silicon quantum dots, fluorescein labeled DNA and shear enzyme ) 是由 由天艳 李文佳 刘�东 李玉叶 于 2020-05-08 设计创作，主要内容包括：本发明属于荧光生物检测技术领域,公开了一种基于硅量子点、荧光素标记的DNA、剪切酶的汞离子荧光检测方法。本发明中,我们利用硅量子点带正电并可以猝灭荧光素(Rox)的荧光信号的性质,将可以与汞离子特异性结合成双链的DNA连接在Rox上,结合exonuclease III酶剪切双链DNA,达到信号放大的目的,实现了对汞离子的高灵敏检测。本发明提出的基于硅量子点、荧光素标记的DNA、剪切酶的汞离子荧光检测方法对汞离子检测的线性范围宽(2×10<Sup>-11</Sup>–1×10<Sup>-</Sup><Sup>8</Sup>mol/L),检测限低(6.67×10<Sup>-12</Sup>mol/L),并且具有良好的选择性。通过标准加入法,对镇江古运河水和农田土壤中的汞离子进行分析,获得了满意的回收率。具有良好的实际应用前景。(The invention belongs to the technical field of fluorescence biological detection, and discloses a mercury ion fluorescence detection method based on silicon quantum dots, fluorescein labeled DNA and a shear enzyme.A DNA capable of being specifically combined with mercury ions into a double-chain is connected to Rox by utilizing the property that the silicon quantum dots are positively charged and can quench a fluorescence signal of the fluorescein (Rox), and the double-chain DNA is sheared by combining exonuclease III enzyme to achieve the purpose of signal amplification and realize high-sensitivity detection of mercury ions.A mercury ion fluorescence detection method based on the silicon quantum dots, the fluorescein labeled DNA and the shear enzyme, which is provided by the invention, has a wide linear range for mercury ion detection (2 × 10) ‑11 –1×10 ‑ 8 mol/L), low detection limit (6.67 × 10) ‑12 mol/L) and has good selectivity. The mercury ions in the ancient canal water and farmland soil of Zhenjiang were analyzed by a standard addition method to obtain the waterThe recovery rate is satisfactory. Has good practical application prospect.)

一种基于硅量子点、荧光素标记的DNA、剪切酶的汞离子荧光 检测方法

技术领域

本发明属于荧光生物检测技术领域，具体涉及一种基于硅量子点、荧光素标记的DNA、剪切酶的汞离子荧光检测方法。

背景技术

汞(Hg²⁺)污染多年来一直被认为是一个重要的世界性问题，因为它在低浓度下仍具有很高的毒性，并且可以在人体中产生生物累积效应。因此，痕量Hg²⁺的检测十分必要。荧光法由于分析速度快、成本效益好、操作方便等优点，已被广泛应用于汞离子(Hg²⁺)的检测。为了避免其它潜在物质的干扰，科研工作者利用Hg²⁺与胸腺嘧啶碱基之间的配位相互作用来提高检测的选择性，具体来说，胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(T-T)在DNA双链中的错配会吸引水溶液中的Hg²⁺与胸腺嘧啶(T)配对形成稳定的胸腺嘧啶-Hg²⁺-胸腺嘧啶(T-Hg²⁺-T)DNA双链。

为了提高荧光传感器对Hg²⁺检测的灵敏度，杂交链式反应(HCR)、滚动圆扩增(RCA)和酶辅助扩增等扩增策略被广泛应用于Hg²⁺检测中。其中，酶辅助扩增策略主要采用外切酶III(ExoIII)能有效地降解dsDNA的平末端和5’-突出末端，而对ssDNA或dsDNA的3’-突出末端的活性较低的性质。由于其不需要特定的识别序列而成为信号放大策略的理想候选。

发明内容

本发明旨在发展一种基于硅量子点、荧光素标记的DNA、剪切酶的汞离子荧光检测方法。具体通过如下技术方案实现：利用硅量子点带正电并可以猝灭荧光素(Rox)的荧光信号的性质，将可以与汞离子特异性结合成双链的DNA连接在Rox(Rox-DNA)上，无汞离子存在时，硅量子点通过静电吸附猝灭Rox的荧光信号；当汞离子存在时，Rox-DNA通过T-Hg²⁺-T结构形成双链结构，Exo III剪切双链DNA，释放Rox和Hg²⁺达到信号放大的目的，实现了对汞离子的高灵敏检测。

一种基于硅量子点、荧光素标记的DNA、剪切酶的汞离子荧光检测方法，包括如下步骤：

(1)将制备的SiQDs溶液与Rox-DNA溶液加入到一定体积的Tris-HCl溶液中，并在特定温度下孵育一定时间；

(2)向步骤(1)制备混合溶液中加入已知浓度的Hg²⁺溶液混合，并在特定温度下孵育一定时间；

(3)向步骤(2)制备混合溶液中加入ExoIII溶液混合，在特定温度下作用一段时间，然后在高温下灭活ExoIII，待混合液冷却后用荧光分光光度计在室温下分别检测溶液在414nm和607nm处的荧光强度I₄₁₄和I₆₀₇，得出荧光强度I₆₀₇/I₄₁₄比值与汞离子浓度对数的标准曲线；

(4)按照步骤(1)～(3)的操作，将上述已知浓度的Hg²⁺溶液用待测的Hg²⁺溶液替换，用荧光分光光度计在室温下分别检测溶液在414nm和607nm处的荧光强度I₄₁₄和I₆₀₇，计算此时I₆₀₇/I₄₁₄比值并代入步骤(3)中的标准曲线，得出待测溶液中汞离子的浓度。

步骤(1)中，合成SiQDs的具体方法为：将6.665mL 60mM的还原剂L-谷胱甘肽(L-GSH)和13.135mL去离子水加入100mL烧杯中，通入氮气10min后，加入0.2mL硅源N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺(DAMO)，继续通氮气10min，得到混合溶液。将装有混合溶液的烧杯放入美的家用微波炉中，在微波功率为700W的条件下，微波反应8min，得到棕黄色固体。向烧杯中加10mL去离子水溶解得到的固体物质，接着将溶液转移到离心管中放入离心机离心10min，离心过程的离心速率为10000rpm，取上清液，转移到透析袋透析处理24h。提纯后的量子点溶液经冷冻干燥、研磨得到略带黄色的硅量子点粉末，置于4℃下保存。所述透析袋的截留分子量为1000。

步骤(1)中，SiQDs溶液浓度为0.5mg/mL，Rox-DNA溶液的浓度为1μM，SiQDs溶液，Rox-DNA溶液及Tris-HCl的体积比为10：10：53；孵育条件为：37℃下孵育15min。

步骤(2)中，Hg²⁺溶液的浓度为2×10^-11–1×10^-8mol/L；SiQDs溶液：Hg²⁺溶液体积比5：2；孵育条件为：37℃下孵育40min。

步骤(3)中，ExoIII溶液的浓度为2U/μL，SiQDs溶液：ExoIII溶液体积比10：3；37℃下孵育65min；ExoIII在80℃下放置10min灭活。

步骤(3)、(4)中，所述荧光分光光度计的激发波长分别设置为350nm和550nm，激发狭缝宽度为3nm，发射狭缝宽度为3nm。

所述的Tris-HCl浓度均为10mM，pH＝7.0，10mM MgCl₂。

本发明的有益效果：

(1)本发明应用酶剪切放大策略实现荧光检测方法的信号放大；

(2)本发明引入富含T碱基的DNA，与Hg²⁺结合形成T-Hg²⁺-T双链结构实现对Hg²⁺的特异性检测；

(3)所提出的检测方法对Hg²⁺表现出令人满意的分析性能，检测限低6.67×10^{- 12}mol/L(S/N＝3)，线性范围宽2×10^-11–1×10^-8mol/L。

附图说明

图1是本发明荧光方法用于检测汞离子的原理示意图。

图2是SiQDs的荧光激发和发射光谱图。

图3A是SiQDs、Rox-DNA和SiQDs+Rox-DNA的Zeta电势图；B是本发明荧光方法可行性分析中不同溶液的荧光光谱图。

图4A是不同浓度Hg²⁺标准溶液存在时溶液的荧光光谱图；B是Hg²⁺浓度对数与荧光强度比值间的线性关系图。

图5是各种干扰物存在时溶液的荧光比值变化图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：

该检测方法的检测过程如图1所示，基本原理是：

首先合成了SiQDs，其最大激发波长为350nm，最大发射波长为414nm，如图2所示。硅量子点带正电与带负电的Rox-DNA通过静电作用相吸附(如图3A所示)，并猝灭荧光素(Rox)的荧光信号，当汞离子存在时，Rox-DNA通过T-Hg²⁺-T结构形成双链结构，Exo III剪切双链DNA，释放Rox和Hg²⁺达到信号放大的目的，实现了对汞离子的高灵敏检测。

该检测方法的可行性分析如下：

为了进一步验证方案的可行性，对SiQDs溶液和Rox-DNA溶液中加入各种物质前后的荧光变化情况进行考察。如图3B所示，SiQDs在414nm处有强荧光信号，Rox-DNA在607nm处有强荧光信号；当两者混合后，SiQDs在414nm处的荧光信号强度不变，Rox-DNA在607nm处的荧光信号会被SiQDs猝灭；单独加入汞离子，Rox-DNA在607nm处的荧光信号不会恢复，当继续加入Exo III后，Exo III剪切双链DNA，释放Rox，导致Rox在607nm处的荧光信号得到恢复。证明本发明的方法可用于汞离子的检测。

实施例1

(1)将制备的SiQDs配制成0.5mg/mL溶液待用；

(2)将50μL步骤(1)SiQDs溶液和50μL Rox-DNA(1μM)的溶液加入到265μLTris-HCl溶液中，37℃下孵育15min；

(3)向步骤(2)制备的若干份混合溶液中分别加入20μL的Hg²⁺标准溶液，浓度分别为2×10^-11、5×10^-11、1×10^-10、3×10^-10、5×10^-10、1×10^-9、3×10^-9、5×10^-9、1×10^-8mol/L，在37℃下孵育40min；

(4)向步骤(3)制备混合溶液中加入15μL ExoIII(2U/μL)溶液混合，在37℃下孵育65min。然后在80℃下放置10min使ExoIII灭活。

(5)待混合液冷却后用荧光分光光度计在室温下分别检测溶液在414nm和607nm处的荧光强度，所得的谱图如图4A所示；同时获得荧光强度I₆₀₇/I₄₁₄比值与汞离子浓度对数的标准曲线如图4B所示；线性方程为：I₆₀₇/I₄₁₄＝0.64128Log C_Hg2++7.50114，相关系数R²＝0.99504，检测限为6.67×10^-12mol/L(S/N＝3)，线性范围2×10^-11–1×10^-8mol/L。

(6)按照步骤(1)～(5)的操作，将上述已知浓度的Hg²⁺溶液用待测的Hg²⁺溶液替换，用荧光分光光度计在室温下分别检测溶液在414nm和607nm处的荧光强度，计算I₆₀₇/I₄₁₄比值为1.49569，代入步骤(5)中的标准曲线，得出待测溶液中汞离子的浓度为4.31735×10^-10mol/L。

其中，所述荧光分光光度计的激发波长分别设置为350nm和550nm，激发狭缝宽度为3nm，发射狭缝宽度为3nm。

所述的Tris-HCl浓度均为10mM，pH＝7.0，10mM MgCl₂。

Hg²⁺检测选择性的考察：

为了研究本发明检测Hg²⁺的特异性，对Hg²⁺和其它金属离子进行检测。具体步骤如下：在1.5mL离心管中，将50μL(0.5mg/mL)SiQDs溶液和50μL Rox-DNA(1μM)溶液加入到265μL Tris-HCl溶液中，37℃下孵育15min；然后分别加入20μL Hg²⁺(浓度为5×10^-10mol/L)或K⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Pb²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Cd²⁺和所有金属离子的混合溶液(其它金属离子浓度均为5×10^-8mol/L)，在37℃下孵育40min；最后加入15μL ExoIII(2U/μL)溶液混合，在37℃下孵育65min。然后在80℃下放置10min使ExoIII灭活。待混合液冷却后用荧光分光光度计在室温下分别检测溶液在414nm和607nm处的荧光强度。如图5所示，K⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Pb²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Cd²⁺对荧光强度I₆₀₇/I₄₁₄比值基本无影响，只有加入Hg²⁺会使荧光强度I₆₀₇/I₄₁₄比值明显降低。以上结果说明该荧光传感方法可以实现Hg²⁺的特异性检测。

其中，所述荧光分光光度计的激发波长分别设置为350nm和550nm，激发狭缝宽度为3nm，发射狭缝宽度为3nm。