阅读说明：本技术 基于实时数字pcr检测人端粒绝对长度的方法及试剂盒 (Method and kit for detecting absolute length of human telomere based on real-time digital PCR ) 是由 沈燕龙 景奉香 吴东平 颜进取 于 2020-06-11 设计创作，主要内容包括：本申请提供了基于实时数字PCR检测人端粒绝对长度的方法,包括制备标准品、合成特异性扩增引物和探针引物、标准品实时数字PCR检测、待测样品实时数字PCR检测、计算端粒的绝对长度等步骤。本申请所提供的基于实时数字PCR检测人端粒绝对长度的方法对样本要求低,既能检测单个染色体端粒的绝对长度,又能提供端粒长度分布,专用于短端粒检测。并且,本申请通过加入特定染色体基因的扩增引物和探针,可以得到特定染色体端粒绝对长度,操作快捷、简便、经济、高效。(The application provides a method for detecting the absolute length of human telomeres based on real-time digital PCR, which comprises the steps of preparing a standard substance, synthesizing a specific amplification primer and a probe primer, detecting the real-time digital PCR of the standard substance, detecting a sample to be detected by the real-time digital PCR, calculating the absolute length of the telomeres and the like. The method for detecting the absolute length of the human telomere based on the real-time digital PCR has low requirements on samples, can detect the absolute length of the telomere of a single chromosome, can provide telomere length distribution, and is specially used for short telomere detection. In addition, the absolute length of the telomere of the specific chromosome can be obtained by adding the amplification primer and the probe of the specific chromosome gene, and the method is quick, simple, convenient, economic and efficient to operate.)

基于实时数字PCR检测人端粒绝对长度的方法及试剂盒

技术领域

本申请涉及数字PCR技术领域，尤其涉及一种基于实时数字PCR检测人端粒绝对长度的方法及试剂盒。

背景技术

人细胞中的端粒长度可以从很短(例如小于500bp)到很长(例如大于20kbp)变化。Kimura等人描述了端粒长度分(NatureProtoc.,2010,5(9):1596-607)。端粒长度分布的一个量度是短端粒百分比，例如长度小于1kb、小于2kb或小于3kb的端粒的百分比。举例来说，可以测试样本以确定短端粒是否占端粒总数的15％以上、20％以上、25％以上或30％以上。最新研究表明，短端粒的分数可能比平均端粒长度更好地与健康量度相关联。端粒丰度的量度和这些量度的变化速率指示健康、病理状态的风险或存在以及对药物的响应性，可以使来自样本的细胞的端粒丰度的量度或这些量度的变化速率与端粒疾病或药物响应性等进行关联。

现有技术中，DNA印记(SB)法作为“金标准”被广泛应用于端粒长度的检测，其具有高分辨率和高精确度。但式，SB法需要大量完整无断裂的DNA样品，实验周期长达5-7天，需要丰富经验和操作技能。SB法检测的是细胞整体水平的端粒长度，包括端粒和亚端粒序列的长度，不能反映单个染色体的实际长度。而且，SB法的测量结果易受样品保存环境、消化时间、电泳条件等多种因素影响。

Q-PCR与SB法有很好的一致性，对样品的要求较低，且操作快捷、简便、经济、高效；但所得结果是端粒的相对长度而不是绝对长度，对短端粒不能测量。Q-FISH要求活细胞或固定的组织切片，且操作耗时。Flow-FISH可以同时处理大量样品，但要求细胞完整，包含细胞核，整个实验至少需要16小时，测量结果仅提示整个细胞群TL变化的均值，不能区分单个端粒长度。SERS法首次将光学原理与杂交理论相结合，省去了样品预处理、电泳和PCR过程，具有操作简便、准确率和敏感度高的优点；但目前仅限于在金、银、铜三种金属和少数极不常用的碱金属(如锂、钠等)的依托下进行实验，实验结果的重复性以及与金标准的比较还有待进一步探索。

发明内容

鉴于背景技术中存在的问题，本发明提供了一种基于实时数字PCR检测人端粒绝对长度的方法及试剂盒。

为了达到上述目的，本申请的第一方面所提供的基于实时数字PCR检测人端粒绝对长度的方法，至少包括如下步骤：

(1)制备标准品：

合成包含人源的单拷贝基因A和已知(TTAGGG)拷贝数m的端粒序列B为核心序列双链DNA，通过TA克隆连接到PMD19-T载体上，再进行克隆，测序验证序列，并测定质粒溶液浓度，得到PMD19-T-A&B质粒，作为端粒检测核酸标准品；

(2)合成特异性扩增引物和探针：

根据A基因和B基因序列，设计合成端粒检测特异性扩增引物和特异性探针、A基因特异性扩增引物和特异性探针；

其中，所述端粒检测特异性扩增引物的正向引物包含5’端不属于端粒序列的特异性序列并标记淬灭基团以及多种、均匀间隔的与端粒重复序列不配对序列；

所述端粒检测特异性扩增引物的反向引物包括多种、均匀间隔的与端粒重复序列不配对序列，并与所述正向引物不形成二聚体；

所述端粒检测特异性探针序列与所述端粒检测正向引物的特异性序列、或所述端粒检测反向引物的特异性序列互补，在所述端粒检测特异性探针序列3’端加入封闭基团阻止其延伸，5’端标记报告基团；

(3)标准品实时数字PCR检测：

进行实时数字PCR检测标准品中A基因和B基因的扩增过程，记录：标准品中A基因在扩增达到阈值线时的荧光强度和扩增循环数、标准品中B基因在扩增达到阈值线时的荧光强度和扩增循环数；

(4)待测样品实时数字PCR检测：

采集待测样品，进行实时数字PCR检测待测样本中A基因和B基因的扩增过程，记录待测样品中A基因在扩增达到阈值线时的荧光强度和扩增循环数、测样品中B基因在扩增达到阈值线时的荧光强度和扩增循环数；

(5)计算端粒的绝对长度：

I、待测样本中含A基因染色体端粒的绝对长度L_b：

其中，

为待测样品双阳性孔中B基因在扩增达到阈值线时的扩增产物的量，即为待测样本双阳性孔中B基因在扩增达到阈值线时的荧光强度；

为标准品中B基因在扩增达到阈值线时的扩增产物的量，即为标准品中B基因在扩增达到阈值线时的荧光强度；

X_B’为标准品中B基因原模板数m；

Ct_b为待测样品双阳性孔中B基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数；

Ct_B’为标准品中B基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数；

Y_Cta为待测样品双阳性孔中A基因在扩增达到阈值线时的扩增产物的量，即为标准品中A基因在扩增达到阈值线时的荧光强度；

Y_CtA’为标准品中A基因在扩增达到阈值线时的扩增产物的量，即为标准品中A基因在扩增达到阈值线时的荧光强度；

X_A’为标准品中A基因原模板数；

Ct_a为待测样品双阳性孔中A基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数；

Ct_A’为标准品中A基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数；

6为人端粒基因(TTAGGG)6个碱基长度基数；

II、待测样本中不含A基因染色体端粒的绝对长度L_Bn：

其中，

为待测样品单阳性孔中B基因在扩增达到阈值线时的扩增产物的量；

为待测样品双阳性孔中含A基因染色体的B基因在扩增达到阈值线时，扩增产物的平均量，即：其中，n为待测样品双阳性孔的数目；为待测样品双阳性孔中含A基因染色体的B基因平均长度，即：

其中，n为待测样品双阳性孔的数目；

为标准品中B基因在扩增达到阈值线时的扩增产物的量，即为标准品中B基因在扩增达到阈值线时的荧光强度；

X_B’为标准品中B基因原模板数m；

Ct_B’为标准品中B基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数；

Ct_Bn为待测样品单阳性孔中B基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数；

为待测样本双阳性孔中含A基因染色体的B基因在扩增达到阈值线时的平均扩增循环数，即：其中，n为待测样品双阳性孔的数目；

Y_Cta为待测样品双阳性孔中A基因在扩增达到阈值线时的扩增产物的量，即为标准品中A基因在扩增达到阈值线时的荧光强度；

Y_CtA’为标准品中A基因在扩增达到阈值线时，扩增产物的量，可取其荧光信号值；

X_A’为标准品中A基因原模板数；

Ct_a为待测样品双阳性孔中A基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数；

Ct_A’为标准品中A基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数。

优选地，本发明所提供的基于实时数字PCR检测人端粒绝对长度的方法中，所述端粒检测正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述端粒检测反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述端粒检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

优选地，所述端粒检测特异性扩增引物的正向引物的5’端标记淬灭基团；所述端粒检测特异性探针序列5’端标记报告基团，3’端加入封闭基团。

优选地，所述A基因为ACTB基因。

优选地，本发明所提供的基于实时数字PCR检测人端粒绝对长度的方法中，当所述A基因为ACTB基因时，ACTB基因正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；ACTB基因反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；设计合成的ACTB基因探针引物的核苷酸序列如SEQID NO：6所示。

优选地，所述ACTB基因特异性扩增引物的正向引物的5’端标记淬灭基团；所述ACTB基因特异性探针序列5’端标记报告基团，3’端加入封闭基团。

优选地，所述标准品和待测样品进行实时数字PCR检测的PCR反应体系组成为：10×dPCR Buffer Mix 3.5μl，上、下游引物各1μl，探针引物1μl，基因组DNA1.5μl，加水至35μl。

优选地，所述标准品和待测样品进行实时数字PCR检测的扩增反应条件为：90℃预变性10min后进入PCR循环，95℃20s，60℃40s，45个循环。

本发明还提供一种基于实时数字PCR检测人端粒绝对长度的试剂盒，其包括：

SEQ ID NO：1所示的端粒检测正向引物；SEQ ID NO：2所示的端粒检测反向引物；SEQ ID NO：3所示的端粒检测探针；

SEQ ID NO：4所示的ACTB基因正向引物；SEQ ID NO：5所示的ACTB基因反向引物；SEQ ID NO：6所示的ACTB基因探针。

优选地，所述端粒检测特异性扩增引物的正向引物的5’端标记淬灭基团；所述端粒检测特异性探针序列5’端标记报告基团，3’端加入封闭基团；所述ACTB基因特异性扩增引物的正向引物的5’端标记淬灭基团；所述ACTB基因特异性探针序列5’端标记报告基团，3’端加入封闭基团。

相对于现有技术，本发明所提供的技术方案至少具有如下有益的效果：

传统PCR通常采用两个寡核苷酸引物退火到目标扩增子的反义互补链，每个引物都允许聚合酶向另一个引物的方向延伸，对于重复DNA序列(如端粒重复序列)来说，PCR将面临一种大的挑战，因为与重复序列反向链互补的引物将会互相结合，形成二聚体。

而本发明的采用探针方法可避开端粒重复序列，减少探针与模板、引物及扩增产物形成二聚体和错配现象。在本发明的PCR过程中：解链温度下，探针引物，正向引物，反向引物，DNA模板均呈游离状态；温度下降时，探针引物优先和正向引物5’端特异性结合形成复合物，由于正向引物5’端含淬灭基团，探针引物的报告基团不发光；温度进一步下降时，正向引物复合物和反向引物与DNA模板链结合；达到延伸温度时，DNA聚合酶开始工作，当接触探针引物时将探针引物水解报告基团脱离，体系开始有荧光信号，被机器检测并记录。下一轮PCR开始，前一轮未被水解的探针重新与正向引物结合或与新的DNA链结合，当DNA聚合酶再次将探针引物水解，体系荧光信号再次增强。直至探针引物全部水解或循环结束。

因此，本申请所提供的基于实时数字PCR检测人端粒绝对长度的方法对样本要求低，既能检测单个染色体端粒的绝对长度，又能提供端粒长度分布，专用于短端粒检测。并且，本申请通过加入特定染色体基因的扩增引物和探针，可以得到特定染色体端粒绝对长度，操作快捷、简便、经济、高效。

附图说明

图1是实施例2中的标准品PMD19-T-A&B质粒示意图；

图2是实施例2种的实时数字PCR端粒扩增示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本申请。应理解，这些具体实施方式仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。

实施例1

本实施例公开了根据本申请的基于实时数字PCR技术检测人端粒绝对长度的计算方法。

(1)公式Ⅰ推导

基础公式：

Y_n＝X*(1+E)ⁿ (1-1)

其中，Y_n为第n个循环后扩增产物的量，可取其荧光信号值；X为原模板数；E为扩增效率；n为扩增循环数。

在扩增达到阈值线时，此时，n＝Ct，于是，扩增产物的量为：

Y_Ct＝X*(1+E)^Ct (1-2)

Y_Ct为荧光信号达到阈值线强度时扩增产物的量，取其荧光信号值。

A基因在扩增达到阈值线时，A基因扩增产物的量为：

其中，Y_CtA为A基因在扩增达到阈值线时，扩增产物的量，可取其荧光信号值；X_A为A基因原模板数；E_A为A基因的扩增效率；Ct_A为A基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数。

B基因在扩增达到阈值线时，B基因扩增产物的量为：

其中，Y_CtB为B基因在扩增达到阈值线时，扩增产物的量，可取其荧光信号值；X_B为B基因原模板数；E_B为B基因的扩增效率；Ct_B为B基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数。

式(1-3)除以式(1-4)得到：

变形后为：

式(1-6)两边同时取对数，得：

由于Y_CtA和Y_CtB，X_A和X_B，Ct_A和Ct_B为数据测得的已知结果，可以简化式(1-7)为：

Y＝aX+b (1-8)

其中Y为log(1+E_B)；X为log(1+E_A)；a为b为

Y_CtA和Y_CtB有确切值取决于：1、探针中所使用的报告荧光染料；2、影响探针荧光特性的序列；3、探针水解的效率；4、荧光阈值的设定。

式(1-8)可以说明在同一反应体系中A基因和B基因的一个扩增关系。

(2)公式Ⅱ推导

基础公式：

Y_n＝X*(1+E)ⁿ (2-1)

其中，Y_n为第n个循环后扩增产物的量，可取其荧光信号值；X为原模板数；E为扩增效率；n为扩增循环数。

在扩增达到阈值线时，此时，n＝Ct，于是，扩增产物的量为：

Y_Ct＝X*(1+E)^Ct (2-2)

Y_Ct为荧光信号达到阈值线强度时扩增产物的量，取其荧光信号值。

待测样本中含A基因荧光信号的孔，A基因在扩增达到阈值线时，A基因扩增产物的量为

其中，Y_Cta为待测样本中A基因在扩增达到阈值线时，扩增产物的量，可取其荧光信号值；X_a待测样本中为A基因原模板数；E_a为A基因的扩增效率，同一扩增体系E_a扩增效率与E_A一致，以下统一用E_A表示；Ct_a待测样本中为A基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数。

标准品中，A基因在扩增达到阈值线时，A基因扩增产物的量为：

其中，Y_CtA’为标准品中A基因在扩增达到阈值线时，扩增产物的量，可取其荧光信号值；X_A’为标准品中A基因原模板数；E_A为A基因的扩增效率，同一扩增体系E_A扩增效率一致；CtA’为标准品中A基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数。

式(2-3)除以式(2-4)得到：

式(2-5)两边同时取对数并变形后，得：

由于Y_Cta和Y_CtA’，X_a和X_A’，Ct_a和Ct_A’为数据测得的已知结果，可以简化式(2-6)为：

log X_a＝R (2-7)

其中，R为

同一芯片中E_A扩增效率相同，故R为一常数，变形式(2-8)，得：

X_a＝10^R (2-8)

X_a为待测样本中含A基因染色体的实际拷贝数。

由于待测样本的X_a和标准品的X_A’均为单拷贝,故校准系数α为：

可作为B基因的校准系数。

由式(2-5)同理，可得

其中，Y_Ctb为待测样本中为单拷贝B基因在扩增达到阈值线时，扩增产物的量；Y_CtB’为标准品中B基因在扩增达到阈值线时，扩增产物的量；X_b为待测样品中B基因原模板数；X_B’为标准品中B基因原模板数；E_b为B基因的扩增效率，同一扩增体系E_b扩增效率与E_B一致，以下统一用E_B表示；Ct_b为待测样品中B基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数；Ct_B’为标准品中B基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数。

变形后：

再乘以校准系数α和基数6，即为：

待测样本中含A基因染色体端粒的绝对长度：

(3)公式Ⅲ推导

基础公式：

Y_n＝X*(1+E)ⁿ (3-1)

其中，Y_n为第n个循环后扩增产物的量，可取其荧光信号值；X为原模板数；E为扩增效率；n为扩增循环数。

在扩增达到阈值线时，此时，n＝Ct，于是，扩增产物的量为：

Y_Ct＝X*(1+E)^Ct (3-1)

Y_Ct为荧光信号达到阈值线强度时扩增产物的量，取其荧光信号值。

待测样本中不含A基因信号的孔中，B基因在扩增达到阈值线时，B基因扩增产物的量为：

其中，n为不同的单阳性孔(n＝1、2、3……),Y_CtBn为待测样本单阳性孔中B基因在扩增达到阈值线时，扩增产物的量；X_Bn待测样本单阳性孔中B基因原模板数；E_B为B基因的扩增效率，同一扩增体系E_B扩增效率一致；Ct_Bn待测样本单阳性孔中B基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数。

待测样本中含A基因信号的孔中，B基因在扩增达到阈值线时，B基因扩增产物的量为：

其中，

为所有待测样本中含A基因染色体的B基因在扩增达到阈值线时，扩增产物的平均量；

为所有待测样本中含A基因染色体的B基因原平均模板数，在公式(2-11)可得；E_B为B基因的扩增效率，同一扩增体系E_B扩增效率一致；为所有待测样本中含A基因染色体的B基因在扩增达到阈值线时的平均扩增循环数。

式(3-3)除以式(3-4)得到：

其中，为待测样本中为单阳性孔中B基因在扩增达到阈值线时，扩增产物的量；为待测样本中含A基因染色体的B基因在扩增达到阈值线时，扩增产物的平均量；X_Bn为待测样本中为单阳性孔中B基因原模板数；为待测样本中含A基因染色体的B基因原平均模板数；E_B为B基因的扩增效率，同一扩增体系E_B扩增效率一致；Ct_Bn为待测样品单阳性孔中B基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数；为待测样本中含A基因染色体的B基因在扩增达到阈值线时的平均扩增循环数。

变形后：

再乘以校准系数α和基数6，即为：

待测样本中不含A基因染色体端粒的绝对长度：

实施例2

本实施例为基于实时数字PCR技术检测端粒绝对长度的一个示例。

一、实验样本：

合成包含人源单拷贝基因ATCB和(TTAGGG)₁₀ ¹的端粒序列的质粒P1；合成包含人源单拷贝基因ATCB和(TTAGGG)₁₀ ²的端粒序列的质粒P2；合成包含人源单拷贝基因ATCB和(TTAGGG)₁₀ ³的端粒序列的质粒P3；合成包含人源单拷贝基因ATCB和(TTAGGG)₁₀ ⁴的端粒序列的质粒P4。

合成包含人源的单拷贝基因ATCB和已知(TTAGGG)₃₀的端粒序列B为核心序列双链DNA，通过TA克隆连接到PMD19-T载体上，再进行克隆，测序验证序列，并测定质粒溶液浓度，得到PMD19-T-A&B质粒，作为端粒检测核酸标准品；

二、实验步骤：

1、采用磁珠法提取质粒DNA，并定量质粒溶液浓度。

2、合成端粒检测特异性扩增引物和特异性探针：

正向引物：

5’-(淬灭基团)-AATCCGTCGAGCAGAGTTAG[GGTTAG]₄-3’

反向引物：

5’-GCGCGG[CTTACC]₃CTAACC-3’

探针：

5’-(报告基团)-TTAGGCAGCTCGTCTCAATC-(封闭基团)-3’

上述淬灭基团可以选自：TAMRA、Dabcyl、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、MGB、Eclipse等。上述报告基团可以选自：FAM、HEX、TET、ROX、CY3、CY5、CY5.5、VIC、JOE、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 750等。上述封闭基团可以选自：2',3'-双脱氧核苷酸、核糖核苷酸残基、2',3'SH核苷酸或2'-O-PO3核苷酸等。

3、设计合成ACTB基因特异性扩增引物和特异性探针：

正向引物：

5’-(淬灭基团)-TCATAACATCAATAGAGGATCCTGGCGGCCTAAGGACT-3’

反向引物：

5’-ATCATCCATGGTGAGCTGCG-3’

探针引物：

5’-(报告基团)-AGTATTGTAGTTATCTCCTA-(封闭基团)-3’

上述淬灭基团可以选自：TAMRA、Dabcyl、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、MGB、Eclipse等。上述报告基团可以选自：FAM、HEX、TET、ROX、CY3、CY5、CY5.5、VIC、JOE、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 750等。上述封闭基团可以选自：2',3'-双脱氧核苷酸、核糖核苷酸残基、2',3'SH核苷酸或2'-O-PO3核苷酸等。

4、在实时数字PCR仪上进行如下检测步骤：

4.1按照以下配方制备实时数字PCR反应液(推荐数字PCR反应体系，1个反应)：

组分及体积：10×dPCR Buffer 3.5μL；酶1.0μL；引物和探针2.8μL；检测模板1.0～17.5μL；总体积：用无核酶水补至30～35μL。

将上述反应液混合均匀，涡旋混匀30秒，瞬时离心将反应液收集于管底后置于冰上待用。

4.2按照以下比例制备油相混合液(1个反应)：

组分及用量:油相A30μL；油相B10μL；总计40μL。

按上述配方将反应油相混合后，涡旋混匀30s，瞬时离心除去气泡，并将液体收集于管底，置于冰上待用(注：混合后的油相混合液在30min以内使用)。

5、实时数字PCR测定端粒长度

本实施例可使用实时数字PCR系统(例如且不限于：富鲁达/Fluidigm的Bio-Mark^TM基因分析系统)进行测定。

按照数字PCR进样仪使用操作说明书的要求，开启芯片进样程序，完成芯片进样。

将芯片置于实时数字PCR仪的芯片槽内，进行热循环反应，37℃10分钟；55℃10分钟；95℃10分钟；95℃20秒，60℃20秒，45个循环；25℃保温。在每一个循环的60℃保温结束后，收集芯片中的荧光信号，根据各种荧光信号的变化情况，计算得到端粒的绝对长度。

三、实验数据与计算

经实时数字PCR检测得到的数据，如下表1所示：

表1

利用本发明的公式计算端粒的绝对长度：

I、待测样本中含A基因染色体端粒的绝对长度L_b：

其中，

为待测样品双阳性孔中B基因在扩增达到阈值线时的扩增产物的量，即为待测样本双阳性孔中B基因在扩增达到阈值线时的荧光强度；

为标准品中B基因在扩增达到阈值线时的扩增产物的量，即为标准品中B基因在扩增达到阈值线时的荧光强度；

X_B’为标准品中B基因原模板数m；

Ct_b为待测样品双阳性孔中B基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数；

Ct_B’为标准品中B基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数；

Y_Cta为待测样品双阳性孔中A基因在扩增达到阈值线时的扩增产物的量，即为标准品中A基因在扩增达到阈值线时的荧光强度；

Y_CtA’为标准品中A基因在扩增达到阈值线时的扩增产物的量，即为标准品中A基因在扩增达到阈值线时的荧光强度；

X_A’为标准品中A基因原模板数；

Ct_a为待测样品双阳性孔中A基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数；

Ct_A’为标准品中A基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数；

6为人端粒基因(TTAGGG)6个碱基长度基数；

II、待测样本中不含A基因染色体端粒的绝对长度L_Bn：

其中，

为待测样品单阳性孔中B基因在扩增达到阈值线时的扩增产物的量；

为待测样品双阳性孔中含A基因染色体的B基因在扩增达到阈值线时，扩增产物的平均量，即：

其中，n为待测样品双阳性孔的数目；

为待测样品双阳性孔中含A基因染色体的B基因平均长度，即：其中，n为待测样品双阳性孔的数目；

为标准品中B基因在扩增达到阈值线时的扩增产物的量，即为标准品中B基因在扩增达到阈值线时的荧光强度；

X_B’为标准品中B基因原模板数m；

Ct_B’为标准品中B基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数；

Ct_Bn为待测样品单阳性孔中B基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数；

为待测样本双阳性孔中含A基因染色体的B基因在扩增达到阈值线时的平均扩增循环数，即：

其中，n为待测样品双阳性孔的数目；

Y_Cta为待测样品双阳性孔中A基因在扩增达到阈值线时的扩增产物的量，即为标准品中A基因在扩增达到阈值线时的荧光强度；

Y_CtA’为标准品中A基因在扩增达到阈值线时，扩增产物的量，可取其荧光信号值；

X_A’为标准品中A基因原模板数；

Ct_a为待测样品双阳性孔中A基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数；

Ct_A’为标准品中A基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数。

将根据本发明所提供方法计算得到的人端粒拷贝数以及原始质粒中端粒拷贝数记载于如下表2中：

表2

上述测定结果显示，实时数字PCR结果与原始拷贝数差异小于5％，说明根据本发明的方法基于实时数字PCR检测可准确计算得到人端粒绝对长度。

实施例3

本实施例为基于实时数字PCR技术检测平均长度的一个示例。

一、实验样本：

采用人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS)，培养至细胞汇合度约80％时进行基因组DNA磁珠法提取。测定DNA浓度、纯度，对每一样品均重复测量3次取平均值，并保证所有样品光密度D260/D280比值在1.8到2.0之间，-20度保存备用。

二、实验步骤：

1、DNA印迹法测定端粒长度

印迹膜的制备、杂交及显影

取4ug质粒DNA，加入限制性内切酶Msp I和Rsa I(NEB)各20U，反应体系50uL，37度，4-12h，酶切样本于7-8g/L琼脂糖凝胶中电泳(1V/cm)10-12h。电泳时可在样品两侧各上一道DNA marker for Genomi DNA(Fermentasin)，以保证对条带定位准确。用0.2mol/L盐酸对凝胶脱嘌呤，直到溴酚蓝变黄为止；经去离子水短暂漂洗后，用变性溶液(1.5mol/LNaCl，0.5mol/L NaOH)处理45min；用中和缓冲液(1mol/L Tris·HCl，pH7.4，1.5mol/LNaCl)中和45min，中间换1次液。切下含DNA marker的泳道，EB染色后凝胶成像，同时放一标尺，以毛细管碱性转移法转移至尼龙膜，36h后烤干(80度)2-4h。此印迹膜可用于后续杂交反应或松弛包于滤纸中暂时保存。

将印迹膜于6*SSC中浸泡2min。向杂交管内加入7-8mL，预杂交液[5*SSC，50％(体积分数)甲酰胺，1g/L月桂酰肌氨酸钠，0.2g/L SDS，10g/L脱脂奶粉]，42度，30min。将地高辛配基标记探针[DIG-5`-end labeled-(TTAGGG)4]加入7-8mL预热的新鲜预杂交液中(35ug/L)，充分混匀制成杂交液。去除预杂交液，加入杂交液，42度，2-6h或以上。室温，洗涤液1(2*SSC，1g/L SDS)振荡漂洗15min*2，洗涤液2(0.1*SSC，1g/L SDS)振荡漂洗15min*2。以下操作均在15-25度进行。将膜用洗涤缓冲液[马来酸缓冲液：0.1mol/L马来酸，0.15mol/L NaCl，pH7.5；0.3％(体积分数)Tween20]短暂漂洗1-5min，100mL封闭液(含100g/L脱脂奶粉的马来酸缓冲液)孵育30min，20mL抗体溶液(含1：104Anti-DIG-AP，Roche的封闭液)孵育30min，100mL洗涤缓冲液洗涤15min*2，20mL平衡缓冲液(0.1mol/L NaCl，0.1mol/L Tris，pH9.5)平衡3min，使附有DNA的一面朝上，滴加1mL CDP-Star(Roche，USA)显色液使其均匀覆盖整块膜，室温避光5min，暗室曝光显影。使用ImageQuant TM RT ECL TM成像系统(GEHealthcare)获取及处理图像，使用Telometric1.2软件计算端粒长度。

二、实时数字PCR测定端粒长度

本实施例可使用实时数字PCR系统(例如且不限于：富鲁达/Fluidigm的Bio-Mark^TM基因分析系统)进行测定。

按照数字PCR进样仪使用操作说明书的要求，开启芯片进样程序，完成芯片进样。

将芯片置于实时数字PCR仪的芯片槽内，进行热循环反应，37℃10分钟；55℃10分钟；95℃10分钟；95℃20秒，60℃20秒，45个循环；25℃保温。在每一个循环的60℃保温结束后，收集芯片中的荧光信号，根据各种荧光信号的变化情况，计算得到端粒长度。

三、实验数据与计算

利用本发明的公式计算端粒的绝对长度：

I、待测样本中含A基因染色体端粒的绝对长度L_b：

其中，

为待测样品双阳性孔中B基因在扩增达到阈值线时的扩增产物的量，即为待测样本双阳性孔中B基因在扩增达到阈值线时的荧光强度；

为标准品中B基因在扩增达到阈值线时的扩增产物的量，即为标准品中B基因在扩增达到阈值线时的荧光强度；

X_B’为标准品中B基因原模板数m；

Ct_b为待测样品双阳性孔中B基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数；

Ct_B’为标准品中B基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数；

Y_Cta为待测样品双阳性孔中A基因在扩增达到阈值线时的扩增产物的量，即为标准品中A基因在扩增达到阈值线时的荧光强度；

Y_CtA’为标准品中A基因在扩增达到阈值线时的扩增产物的量，即为标准品中A基因在扩增达到阈值线时的荧光强度；

X_A’为标准品中A基因原模板数；

Ct_a为待测样品双阳性孔中A基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数；

Ct_A’为标准品中A基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数；

6为人端粒基因(TTAGGG)6个碱基长度基数；

II、待测样本中不含A基因染色体端粒的绝对长度L_Bn：

其中，

为待测样品单阳性孔中B基因在扩增达到阈值线时的扩增产物的量；

为待测样品双阳性孔中含A基因染色体的B基因在扩增达到阈值线时，扩增产物的平均量，即：其中，n为待测样品双阳性孔的数目；为待测样品双阳性孔中含A基因染色体的B基因平均长度，即：其中，n为待测样品双阳性孔的数目；

为标准品中B基因在扩增达到阈值线时的扩增产物的量，即为标准品中B基因在扩增达到阈值线时的荧光强度；

X_B’为标准品中B基因原模板数m；

Ct_B’为标准品中B基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数；

Ct_Bn为待测样品单阳性孔中B基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数；

为待测样本双阳性孔中含A基因染色体的B基因在扩增达到阈值线时的平均扩增循环数，即：其中，n为待测样品双阳性孔的数目；

Y_Cta为待测样品双阳性孔中A基因在扩增达到阈值线时的扩增产物的量，即为标准品中A基因在扩增达到阈值线时的荧光强度；

Y_CtA’为标准品中A基因在扩增达到阈值线时，扩增产物的量，可取其荧光信号值；

X_A’为标准品中A基因原模板数；

Ct_a为待测样品双阳性孔中A基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数；

Ct_A’为标准品中A基因在扩增达到阈值线时的扩增循环数。

经DNA印迹法和实时数字PCR检测得到的数据，如下表3所示：

表3

	DNA印迹法	实时数字PCR 1	实时数字PCR 2	实时数字PCR 3
					数值	8303±40	8222±234	8386±107	8506±121

从以上内容可知，采用本发明所提供的基于实时数字PCR检测人端粒绝对长度的方法多次测量值差异小于5％，说明根据本发明的方法可准确计算得到人端粒绝对长度。

根据上述说明书的揭示和教导，本申请所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本申请并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本申请的一些修改和变更也应当落入本申请的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本申请构成任何限制。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南圣洲生物科技有限公司

<120> 基于实时数字PCR检测人端粒绝对长度的方法及试剂盒

<130> 192066CN-CH-I

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aatccgtcga gcagagttag ggttagggtt agggttaggg ttag 44

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcgcggctta cccttaccct taccctaacc 30

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttaggcagct cgtctcaatc 20

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcataacatc aatagaggat cctggcggcc taaggact 38

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atcatccatg gtgagctgcg 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agtattgtag ttatctccta 20