阅读说明：本技术 一种基于16S rRNA基因设计的巢式PCR检测细菌性微生物核酸DNA的方法 (Method for detecting nucleic acid DNA of bacterial microorganisms by nested PCR based on 16S rRNA gene design ) 是由 田国忠 于 2019-10-09 设计创作，主要内容包括：一种基于16S rRNA基因设计的巢式PCR检测细菌性微生物核酸DNA的方法,涉及分子生物学技术领域,涉及待检样品中细菌性病原体核酸DNA的巢式PCR检测技术,通过对巢式PCR扩增产物的测序,鉴定细菌性病原体种类。基于16S rRNA基因设计的巢式PCR检测细菌性微生物核酸DNA的方法,灵敏性高,适用范围广,适用所有的目前已命名的细菌性微生物的检测与鉴定,该发明操作简单,费用低。(A nested PCR detection method for bacterial microbial nucleic acid DNA based on 16S rRNA gene design relates to the technical field of molecular biology, relates to a nested PCR detection technology for bacterial pathogen nucleic acid DNA in a sample to be detected, and identifies the bacterial pathogen species through sequencing of nested PCR amplification products. The method for detecting the nucleic acid DNA of the bacterial microorganisms by nested PCR based on 16S rRNA gene design has high sensitivity and wide application range, is suitable for detecting and identifying all the currently named bacterial microorganisms, and has simple operation and low cost.)

一种基于16S rRNA基因设计的巢式PCR检测细菌性微生物核 酸DNA的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，本发明涉及检测和鉴定待检测样品中(如：乳汁，水和组织液等)细菌性微生物核酸DNA的巢式PCR技术方法，通过对PCR扩增产物的测序，鉴定细菌性微生物的种类。

背景技术

16SrDNA其序列包含10个可变区(variable region)和与之相间的11个恒定区(constant region)，可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关，因此，16SrDNA可以作为细菌菌落结构分析最常用的系统进化标记分子。利用16S rDNA可变区与恒定区的特性，可以进行不同种属细菌的分类和鉴定。

PCR检测是运用聚合酶链反应扩增出细菌DNA片段，测序，进行核苷酸序列分析，从而定性的判断细菌的类别。该方法是将16SrDNA作为靶基因，设计引物，该引物只扩增细菌16SrDNA。对病毒及人类白细胞DNA均不扩增。关于16SrDNA常用引物和探针，当提取的DNA可能受损时，稍短的靶序列效果会更好；当样本中细菌含量丰富时，长的靶序列更合适，通常较长的靶序列能提供更多的可变序列，利于更准确的鉴定，另外不同的PCR引物对，扩增效率不同。因此选择引物对之前，要对引物进行测试和评估，以判断其能否用于诊断，

目前读取序列的准确性也非常高，出现一个操作错误的概率为0.01％-0.02％，在这种错读水平下不影响细菌的鉴定结果，而且还可以通过正反互补序列测定，对比重叠区域，进行校对，因此产生错误序列的几率非常低。

采用16SrDNA测序方法鉴定细菌时没有通用的操作指南，序列分析主要依靠序列相似百分率。一般认为相似率>99％定义为种，>95％一>99％则定义为属，<95％则定义为科。

本发明设计普通PCR，引物设计选择中等长度的核苷酸序列，包括恒定区和可变区，为了提高其灵敏度，选用巢式PCR二次扩增，其产物进行测序，对序列进行比对分析，从而鉴定细菌性微生物的种类。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、特异的细菌性微生物量核酸DNA检测与鉴定的巢式PCR检测方法，本发明的方法用于非疾病诊断。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种基于16S rRNA基因设计的巢式PCR检测细菌性微生物核酸DNA的方法，包括以下步骤：

(1)待检测样品核酸DNA的提取液，待检测样品核酸DNA的提取为从乳汁、水和组织液等待检测样品中提取的核酸DNA；

(2)引物对的设计：应用软件如Primer 5.0软件分别设计细菌性微生物16S rRNA巢式PCR引物，具体的引物序列包括如下：

第一次PCR扩增引物：

正向引物：F1：5’-TAGCT/GGGTCTGAGAGGATGA-3’，SEQ ID NO：1，其中T/G为兼并性碱基；兼并性碱基T/G采用K指代，即为5’-TAGCKGGTCTGAGAGGATGA-3’；

反向引物：R1：5’-ATGTGTGGCGGGCAGTGT-3’，SEQ ID NO：2；

第二次PCR扩增引物：

正向引物：F2：5’-TACGGGAGGCAGCAGT-3’，SEQ ID NO：3；

反向引物：R2：5’-ACTAGCGATTCCGACTTCA-3’，SEQ ID NO：4；

(3)以步骤(1)提取的核酸DNA为模板，利用SEQ ID NO:1-2所示引物，通过PCR反应第一次扩增模板核酸DNA，得到第一次PCR产物的核酸DNA；利用SEQ IDNO:3-4所示引物，通过PCR反应第二次扩增第一次PCR产物的核酸DNA；

其中PCR扩增反应：将对应的待检测核酸DNA加到对应的PCR反应混合液中，进行PCR扩增；所述PCR反应混合液，包括：待检测样品核酸DNA、PCR缓冲液10×Buffer、4种dNTP混合物溶液、Taq酶、引物和双蒸馏水的混合液；

(4)检测并分析PCR扩增产物；反应结束后，进行1％的琼脂糖凝胶电泳；所述的1％的琼脂糖凝胶为琼脂糖：凝胶的质量体积比为0.01g/ml；PCR产物经90V电压,1％琼脂糖凝胶电泳1h后，进行凝胶成像分析。

若电泳结果被检样品第二次PCR扩增出大小为1006bp的目的条带(不同的病原体其大小有差别)，且明亮清晰，提示有细菌性微生物存在，可用于测序分析；若电泳结果被检样品第二次PCR扩增未有条带的，表明被检样品不存在细菌性微生物核酸DNA，或者核酸DNA量少至PCR无法检测到；

(5)PCR产物测序：测序引物为正向引物F2和反向引物R2，双向测序，测通为止；

(6)对步骤(5)测序核苷酸序列进行分析，确定细菌性微生物的种类；核苷酸序列分析有两种方法，任选其一；

第一种方法，将核苷酸序列提交NCBI，BLAST进行匹配分析，结果(sequencesproducing significant arrangements)匹配度最高者(Max score)，即可定为感染的病原体；

第二种方法，采用MEGA5.1软件，与已知细菌性微生物16S rRNA核苷酸序列进行比对分析，聚类分析结果，待检样品的核酸DNA序列与已知核酸DNA序列一致的，即可定细菌性微生物的种类；

作为本发明进一步的优选方案：所述的巢式PCR反应，包括两次PCR，第一次PCR和第二次PCR；

作为本发明进一步的优选方案：第一次PCR体系中的模板核酸DNA，为待检标本提取的核酸DNA；

作为本发明的优选方案：第二次PCR体系中的模板核酸DNA，为第一次PCR反应产物的核酸DNA；

作为本发明的优选方案：所述的巢式PCR，第一次PCR反应体系包括：正向引物F1溶液和反向引物R1溶液各0.4μL，PCR缓冲液10×Buffer(Mg²⁺，15mmol/L)2.5μL，4种dNTP混合物溶液2μL，Taq酶(TaKaRa LA Taq酶5U/μL)0.2μL，待检测样品核酸DNA的提取液4μL，补充双蒸馏水至25μL体积；

作为本发明的优选方案：所述的巢式PCR，第二次PCR反应体系包括:PCR缓冲液10×Buffer(Mg²⁺，15mmol/L)2.5μL，4种dNTP混合物溶液2μL，正向引物F2溶液和反向引物R2溶液各0.4μL，Taq酶(TaKaRa LA Taq酶5U/μL)0.2μL，第一次PCR扩增产物核酸DNA溶液4μL，补充双蒸馏水至25μL体积；

作为本发明进一步的优选方案：所述各引物溶液的浓度为10μmol/L。

作为本发明进一步的优选方案：所述的dNTP混合物溶液中各NTP(A、T、G和C)的浓度均为2.5mmol/L。

作为本发明进一步的优选方案：第一次PCR反应体系中，加入待测核酸DNA模板为组织标本提取的核酸DNA，加入量为4μL。第二次PCR反应体系中，加入待测核酸DNA模板量为第一次PCR扩增产物，其加入量为4μL。

作为本发明进一步的优选方案：所述的巢式PCR，第一次PCR反应的条件为：95℃预变性4min；95℃变性45sec，52℃退火45sec，72℃延伸90sec，30个循环；72℃延伸5min。

作为本发明进一步的优选方案：所述的巢式PCR，第二次PCR反应的条件为：95℃预变性4min；94℃变性45sec，52℃退火45sec，72℃延伸90sec，30个循环；72℃延伸5min。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：目前使用的单一的16S rRNA引物难以到达检测微量核酸DNA水平，而单重的病原体特异性引物又不能达到检测的目的，本发明的巢式PCR技术，灵敏度高，可以检测微量核酸DNA，适用范围广，就目前已知的命名的细菌性微生物可以鉴定其种类；该发明操作简单，具有普通PCR技术的人员就可以完成，而且测序价格以及时效性上可以达到实际需要。

附图说明

图1为实施例一种基于16S rRNA基因设计的巢式PCR检测脑脊液标本细菌性微生物的电泳图；

用正向引物F1和反向引物R1第一次PCR扩增标本核酸DNA，PCR反应体系中加入标本核酸DNA为4μL，其产物行正向引物F2和反向引物R2第二次PCR扩增，PCR反应体系中加入第一次PCR产物核酸DNA为4μL，结果，在1006bp处有条带清晰明亮的电泳条带。将第二次PCR产物送测序公司测序。共检测96份临床采集的脑脊液标本，经巢式PCR检测，21份存在细菌性微生物。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，不作为对本发明的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

本发明实施例中，基于16S rRNA基因设计的巢式PCR检测细菌性微生物核酸DNA的方法，首先根据编码16S rRNA基因序列，应用Primer 5.0软件分别设计巢式PCR第一次和第二次扩增引物。

第一次PCR扩增引物：

正向引物：F1：5’-TAGCT/GGGTCTGAGAGGATGA-3’，SEQ ID NO：1，其中T/G为兼并性碱基；

反向引物：R1：5’-ATGTGTGGCGGGCAGTGT-3’，SEQ ID NO：2；

第二次PCR扩增引物：

正向引物：F2：5’-TACGGGAGGCAGCAGT-3’，SEQ ID NO：3；

反向引物：R2：5’-ACTAGCGATTCCGACTTCA-3’，SEQ ID NO：4；

1、临床脑脊液标本检测结果

1)待检核酸DNA：应用试剂盒提取46份临床采集的脑脊液标本核酸DNA，作为PCR反应核酸DNA模板。

2)第一次PCR扩增，应用正向引物F1和反向引物R1，其DNA模板为脑脊液提取的核酸DNA，加入量为4μL，第二次PCR扩增，应用正向引物F2和反向引物R2，其DNA模板为第一次PCR扩增产物4μL；

3)PCR反应体系包括:PCR缓冲液10×Buffer(Mg2+，15mmol/L)2.5μL，4种dNTPMixture(各2.5mmol/L)2μL，正向引物和反向引物各0.4μL(10μmol/L)，Taq酶(TaKaRa LATaq酶5U/μL)0.2μL，核酸DNA模板4μL，补充双蒸馏水至25μL体积。

4)PCR反应条件：95℃预变性4min；95℃变性45sec，52℃退火45sec，72℃延伸90sec，30个循环：72℃延伸5min。第一次PCR扩增和第二次PCR扩增反应体系和PCR反应条件完全一致。

5)结果：在1006bp处有条带清晰明亮的电泳条带。将第二次PCR产物送测序公司测序。共检测46份临床采集的脑脊液标本，经巢式PCR检测，43份存在细菌性微生物，其中，脑膜炎奈瑟菌7份，产气假单胞菌1份，草假单胞菌28份，嗜麦芽窄食单胞菌2份，S肺炎链球菌1份，未知细菌性微生物4份，细菌性微生物检测率为93.48％(43/46)。见图1，图1是部分标本电泳图。

4、分析

用基于16S rRNA基因设计的巢式PCR检测标本中细菌性微生物核酸DNA的方法,适用范围广，适用目前已命名的细菌性微生物核酸DNA的检测与鉴定，操作简单，费用低。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

序列表

<110>中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120>一种基于16S rRNA基因设计的巢式PCR检测细菌性病原体微量核酸DNA的方法

<160>4

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>“人工序列”

<400>1

tagck ggtct gagag gatga

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>“人工序列”

<400>2

atgtg tggcg ggcag tgt

<210>3

<211>16

<212>DNA

<213>“人工序列”

<400>3

tacgg gaggc agcag t

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>“人工序列”

<400>4

actag cgatt ccgac ttca