阅读说明：本技术 一种临床样本中微生物核酸保存液 (Microbial nucleic acid preservation solution in clinical sample ) 是由 夏赞贤 陈俊如 凡丽娜 于 2019-03-25 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种临床样本保存液,具体涉及一种临床样本中微生物的DNA核酸和RNA核酸保存液；本发明的临床样本微生物核酸保存液,包括如下组分：质量分数为1%-3%的乙二胺四乙酸二钠、三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液,乙醇,并调节PH至6.0-8.0。本发明的临床样本微生物核酸保存液可用于常温下保存临床样本中微生物的DNA和RNA核酸,其操作简单、适用性强、便于运输。(The invention relates to a clinical sample preservative fluid, in particular to a preservative fluid for DNA nucleic acid and RNA nucleic acid of microorganisms in a clinical sample; the invention relates to a microbial nucleic acid preservation solution for clinical samples, which comprises the following components: disodium ethylene diamine tetraacetate with the mass fraction of 1-3%, tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer solution and ethanol, and adjusting the PH value to 6.0-8.0. The microbial nucleic acid preservation solution for clinical samples can be used for preserving DNA and RNA nucleic acid of microbes in clinical samples at normal temperature, and is simple to operate, high in applicability and convenient to transport.)

一种临床样本中微生物核酸保存液

技术领域

本发明涉及一种临床样本保存液，具体涉及一种临床样本中微生物的DNA核酸和RNA核酸保存液。

背景技术

临床样本采集离体后，其环境发生了变化，例如无氧环境变成了有氧环境，因而细菌的增长和死亡速度已不同于采集前，且环境中含有的DNA酶和RNA酶易造成样本中的微生物核酸发生降解。因此，为了提高临床病原微生物检测的准确性，需要对临床样本进行保存，稳定其中的DNA和RNA核酸，尽可能将临床样品中的微生物固定在刚刚离体的状态，从而可以更准确的鉴定出样品中的DNA病原体和RNA病原体，提高临床病原微生物检测的覆盖度和准确性。

发明内容

发明要解决的问题

目前对于临床样本的保存，大多采用低温冷冻的方式，如采集样本后立即冻存于-80℃或-20℃。然而低温冷冻的方法需配备设备，且在临床采集过程中，样品采集后无法立即转移至低温冷冻，存在一定的时间差易造成样品中微生物核酸的降解，从而使得临床样本病原微生物检测的准确性降低，具有使用局限性。为了解决上述技术问题，本发明提供一种适用于常温下保存临床样本中微生物DNA和RNA核酸的保存液，其操作简单、适用性强、便于运输。

用于解决问题的方案

本发明的临床样本中微生物核酸保存液，包括如下组分：1%-3%的乙二胺四乙酸二钠，三（羟甲基）氨基甲烷缓冲液，乙醇，并调节PH至6.0-8.0。

本发明还公开了上述保存液的制备工艺如下：

具体的，所述的保存液中乙二胺四乙酸二钠质量分数为2%；

具体的，所述的保存液中三（羟甲基）氨基甲烷 缓冲液质量分数为5%；

具体的，所述的保存液中乙醇质量分数为2%；

具体的，所述保存液调节pH至7.0。

发明的效果

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：本发明所述的保存液，可常温保存和运输临床样本，包括脑脊液、腹水、痰液、粪便等，将采集的样本浸没在保存液中，常温条件下能够维持样本中的微生物DNA和RNA核酸组成的稳定，从而使采样者可以随时进行采样和样本保存。

下面结合实施例，对本发明的

具体实施方式

做进一步详细描述。

具体实施方式

除非另有定义，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。

应当理解的是，除非另外明确地说明，否则落入所列数值和数值范围之间的所有值和范围均意图由本发明所涵盖。

实施例

一、样品来源及分组保存方式

由于临床样品的保存要求较高，本发明实施例采用人粪便微生物样品作为实验样品来进行如下实验。

采集5位志愿者的粪便样品，每个志愿者采集15份，分别做3种不同的处理，每种处理重复实验3次；

不同处理方式：

a、-80摄氏度冻存一周（标号0）：采集至少0.2g粪便样品，立即放入-80℃密封保存，一周后进行DNA提取，进行16S rRNA V34区域测序分析；

b、保存液保存一周（标号1）：采集至少0.2g粪便样品，使用本发明的保存液（成分如表1所示），室温下（26℃）密封保存一周后进行DNA提取，进行16S rRNA V34区域测序分析；

c、不做任何处理保存一周（标号2）：采集至少0.2g粪便样品，室温下（26℃）密封保存一周后进行DNA提取，进行16S rRNA V34区域测序分析；

表1本发明微生物样品核酸保存液配方

乙二胺四乙酸二钠 2%

三（羟甲基）氨基甲烷缓冲液 5%

乙醇 2%

二、粪便样本预处理

取200mg/200ul的粪便样品于干净的2ml离心管中，加入800ul Lysis-BindingBuffer涡旋震荡混匀。

三、核酸提取

按照微生物核酸提取标准操作流程，对经过预处理后的样品进行核酸提取，提取结果如表1所示：

表2 不同处理下样品核酸提取结果

样品编号 处理组标号 体积(ul) 核酸浓度(ng/ul) 核酸总量(ug)

Sample1 0 40 10.5 420

Sample1 0 40 97.73 3909.2

Sample1 0 40 5.72 228.8

Sample1 0 40 34.65 1386

Sample1 0 40 81.69 3267.6

Sample1 1 40 56.8 2272

Sample1 1 40 23.81 952.4

Sample1 1 40 605.02 24200.8

Sample1 1 40 288.14 11525.6

Sample1 1 40 424.33 16973.2

Sample1 2 40 329.02 13160.8

Sample1 2 40 587.06 23482.4

Sample1 2 40 254.6 10184

Sample1 2 40 430.28 17211.2

Sample1 2 40 611.33 24453.2

Sample2 0 40 295.11 11804.4

Sample2 0 40 133.21 5328.4

Sample2 0 40 132.49 5299.6

Sample2 0 40 19.08 763.2

Sample2 0 40 70.13 2805.2

Sample2 1 40 65.41 2616.4

Sample2 1 40 466.33 18653.2

Sample2 1 40 382.67 15306.8

Sample2 1 40 399.03 15961.2

Sample2 1 40 394.53 15781.2

Sample2 2 40 197.04 7881.6

Sample2 2 40 472.5 18900

Sample2 2 40 557.28 22291.2

Sample2 2 40 139.1 5564

Sample2 2 40 573.74 22949.6

Sample3 0 40 69.42 2776.8

Sample3 0 40 227.3 9092

Sample3 0 40 96.13 3845.2

Sample3 0 40 509.33 20373.2

Sample3 0 40 526.67 21066.8

Sample3 1 40 53.73 2149.2

Sample3 1 40 168.6 23007.6

Sample3 1 40 516.74 6744

Sample3 1 40 99.89 20669.6

Sample3 1 40 447.49 3995.6

Sample3 2 40 71.48 17899.6

Sample3 2 40 142.08 2859.2

Sample3 2 40 466 5683.2

Sample3 2 40 31.3 18640

Sample3 2 40 67.5 1252

Sample4 0 40 29.9 2700

Sample4 0 40 19.8 1196

Sample4 0 40 103.83 792

Sample4 0 40 176.28 4153.2

Sample4 0 40 26.67 7051.2

Sample4 1 40 21.82 1066.8

Sample4 1 40 473.07 872.8

Sample4 1 40 213.11 18922.8

Sample4 1 40 200.42 8524.4

Sample4 1 40 86.98 8016.8

Sample4 2 40 93.25 3479.2

Sample4 2 40 399.83 3730

Sample4 2 40 8.83 15993.2

Sample4 2 40 93.36 353.2

Sample4 2 40 254.77 3734.4

Sample5 0 40 49.71 10190.8

Sample5 0 40 223.51 1988.4

Sample5 0 40 410.01 8940.4

Sample5 0 40 479.49 16400.4

Sample5 0 40 409.42 19179.6

Sample5 1 40 208.56 16376.8

Sample5 1 40 131.94 8342.4

Sample5 1 40 253.81 5277.6

Sample5 1 40 180.93 10152.4

Sample5 1 40 20.94 7237.2

Sample5 2 40 116.29 837.6

Sample5 2 40 447.89 4651.6

Sample5 2 40 55.41 17915.6

Sample5 2 40 475.13 2216.4

Sample5 2 40 153.05 19005.2

通过表2结果表明，采用本发明的保存液保存一周后，对核酸提取实验无影响，成功率、浓度、总量均可保证。

四、扩增建库及数据分析

将提取完成后的核酸样品，进行16S rRNA V34区域扩增建库，采用Illumina Miseq进行测序，所有样品测序数据下机后，按照16S标准生物信息分析流程分析，得出分析结果。

表3科水平上的物种丰度分布结果

-80摄氏度冻存一周 本发明保存液保存一周 不做任何处理保存一周

Lachnospiraceae 0.29416084 0.297051738 0.158953768

Bifidobacteriaceae 0.02840427 0.027754962 0.123092807

Ruminococcaceae 0.32967764 0.294413216 0.164873236

Bacteroidaceae 0.09757944 0.09131582 0.25914879

Veillonellaceae 0.00445107 0.006059424 0.007341975

Prevotellaceae 0.00229437 0.00232878 0.0000918

Lactobacillaceae 0.0000918 0 0.00156017

Enterobacteriaceae 0.054583 0.03395664 0.017896065

Rikenellaceae 0.0008948 0.000720753 0.033589538

Streptococcaceae 0.00690605 0.004041528 0.012664908

Other 0.18095675 0.242357139 0.220786968

表3表示科水平上的物种丰度分布结果，每一列代表某一个处理，每一行表示一个科。从科水平的物种构成来看，本发明的临床样本中微生物核酸保存液的处理效果与-80℃立即冻存的处理效果接近，获取得到的微生物物种构成相似度很高，而不做任何处理保存一周的样品其与另外两组的微生物整体构成极不相似，结果显示本发明所述保存液配方对微生物核酸具有很好的稳定性，其效果不亚于冻存处理的保存方案。

以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，并不用作对本发明保护范围的限定。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有实施范围予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。