阅读说明：本技术 一种生物膜抑制剂及其制备方法和应用 (Biofilm inhibitor and preparation method and application thereof ) 是由 李睿 卢洁元 周敏 毕旺来 于 2020-07-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种生物膜抑制剂及其制备方法和应用,所述生物膜抑制剂包括茶多酚、柠檬酸、Na<Sub>2</Sub>EDTA和无菌水,其中,所述茶多酚、柠檬酸和Na<Sub>2</Sub>EDTA的质量比为(0.1～3)：(25～60)：(0.1～2.5)。本发明提供的生物膜抑制剂包括茶多酚、柠檬酸和Na<Sub>2</Sub>EDTA,对食品的优势腐败菌生长具有显著的抑制效果,能够抑制食源性致病菌的生长,减少细菌生物膜的形成,可应用于食品保鲜处理,也可以用于清除食品加工设备的生物膜。(The invention discloses a biomembrane inhibitor and a preparation method and application thereof, wherein the biomembrane inhibitor comprises tea polyphenol, citric acid and Na 2 EDTA and sterile water, wherein the tea polyphenol, citric acid and Na 2 The mass ratio of the EDTA is (0.1-3): (25-60): (0.1-2.5). The biomembrane inhibitor provided by the invention comprises tea polyphenol, citric acid and Na 2 EDTA has obvious effect of inhibiting the growth of dominant putrefying bacteria in food, can inhibit the growth of food-borne pathogenic bacteria and reduce the formation of bacterial biomembrane, can be applied to food preservation treatment and can also be used for removing foodBiofilm of product processing equipment.)

一种生物膜抑制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及食品加工技术领域，具体涉及一种生物膜抑制剂及其制备方法和应用。

背景技术

生物膜是细菌在不利生存条件下形成的一种特殊基质结构，是细菌在生长过程中粘附于固体或液体表面而形成的膜状复合物，主要由细菌及自身分泌的物质如蛋白质、多糖、核酸等组成。生物膜的形成过程包括如下阶段：可逆过程、不可逆过程、微菌落形成阶段、生物膜成熟阶段及传播阶段。细菌生物膜一旦形成很难清除，抗生素、热应激、消毒剂等难以穿过生物膜屏障作用到膜内细菌，导致膜内细菌抗逆性能大大增强。

在食品领域方面，食品加工生产过程中细菌生物膜在管道器械上形成后可脱落并掺入至食品中，细菌持续黏附在食品表面并形成生物膜，人体一旦误食可能会造成食物中毒。有关报道显示80％的食源性疾病是由食源性致病菌形成生物膜而造成。其次，食品中微生物形成生物膜后会造成消毒措施失效，食品保质期大大缩短，例如，冷鲜肉和小龙虾等肉质丰富，容易在微生物繁殖作用下变质。现有技术中缺乏针对食源性生物膜的抑制剂，尤其是针对冷鲜肉和小龙虾等极易产生腐败菌生物膜等食品具有高效安全抑菌效果的生物膜抑制剂。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种生物膜抑制剂及其制备方法和应用，旨在提供一种能够安全高效地抑制食品优势腐败菌生长形成生物膜的抑制剂。

为实现上述目的，本发明提出一种生物膜抑制剂，所述生物膜抑制剂包括茶多酚、柠檬酸、Na₂EDTA和无菌水，其中，所述茶多酚、柠檬酸和Na₂EDTA的质量比为(0.1～3)：(25～60)：(0.1～2.5)。

可选地，所述茶多酚、柠檬酸和Na₂EDTA的质量比为(0.5～2)：(40～55)：(0.2～1)。

可选地，所述茶多酚、柠檬酸和Na₂EDTA的质量比为1:50:0.5。

进一步地，本发明还提出一种如上所述的生物膜抑制剂的制备方法，包括以下步骤：

将柠檬酸、Na₂EDTA和茶多酚依次加入到无菌水中，搅拌至完全溶解，制得生物膜抑制剂。

此外，本发明还提出一种食品保鲜的方法，包括以下步骤：

将生物膜抑制剂喷洒于待保鲜处理的食品表面，然后将所述待保鲜处理的食品包装并冷链储存；其中，所述生物膜抑制剂为如上所述的生物膜抑制剂。

可选地，所述待保鲜处理的食品为冷鲜肉或小龙虾。

可选地，将生物膜抑制剂喷洒于待保鲜处理的食品表面，然后将所述待保鲜处理的食品包装并冷链储存的步骤中：

所述生物膜抑制剂中的茶多酚、柠檬酸、Na₂EDTA的使用总浓度分别为0.1g/L、5g/L和0.05g/L。

此外，本发明还提出一种食品加工设备的抑菌清洁方法，包括以下步骤：

将生物膜抑制剂喷洒于经过清洁后的食品加工设备上；其中，所述生物膜抑制剂为如上所述的生物膜抑制剂。

可选地，将生物膜抑制剂喷洒于经过清洁后的食品加工设备上的步骤中：

所述生物膜抑制剂中的茶多酚、柠檬酸、Na₂EDTA的使用总浓度分别为0.1g/L、5g/L和0.05g/L。

本发明提供的技术方案中，所述生物膜抑制剂包括茶多酚、柠檬酸和Na₂EDTA，对食品的优势腐败菌生长具有显著的抑制效果，能够抑制食源性致病菌的生长，减少细菌生物膜的形成；其中，茶多酚、柠檬酸和Na₂EDTA均为食品中常见、安全的添加剂，茶多酚具有良好的抗菌、抗氧化、抗生物膜作用；柠檬酸是食品中常见的酸碱调节剂、抗氧化剂、风味增进剂，此外还具有一定的抑菌作用；Na₂EDTA在食品添加剂中通常作为螯合剂、抗腐剂和抗氧化剂，在本方案中可络合金属离子，Na₂EDTA和柠檬酸与茶多酚协同作用，增强茶多酚的抗菌和抗生物膜作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明提供的生物膜抑制剂对常见杆菌生物膜的抑制效果对比图；

图2为本发明提供的生物膜抑制剂对小龙虾优势腐败菌生物膜的抑制效果对比图；

图3为本发明提供的生物膜抑制剂对肉类优势腐败菌生物膜的抑制效果对比图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

细菌生物膜具有屏障作用，导致膜内细菌呈现很强抗逆性能，对抗生素、消毒剂和防腐剂具有更高的耐受性。在食品领域方面，食品加工生产过程中细菌生物膜在管道器械上形成后可脱落并掺入至食品中，细菌持续黏附在食品表面并形成生物膜，人体一旦误食可能会造成食物中毒。有关报道显示80％的食源性疾病是由食源性致病菌形成生物膜而造成。其次，食品中微生物形成生物膜后会造成消毒措施失效，食品保质期大大缩短，例如，冷鲜肉和小龙虾等肉质丰富，容易在微生物繁殖作用下变质。其中，冷鲜肉在储存的过程中主要有乳酸菌、铜绿假单胞杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等优势腐败菌，小龙虾主要有阴沟肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、嗜水杆菌属、溶酪巨球菌等优势腐败菌，这些细菌在食品冷藏过程中能混合生长并形成生物膜，导致食品加速腐败。不同食品的优势腐败菌种类不同，产膜特性不同，采用的抗菌抗生物膜策略也不同，现有技术中缺乏针对食源性生物膜的抑制剂，尤其是针对冷鲜肉和小龙虾等极易产生腐败菌生物膜等食品具有高效安全抑菌效果的生物膜抑制剂。

为解决现有技术缺乏能够高效安全的抑制食源性生物膜的抑制剂的问题，本发明提出一种生物膜抑制剂，以茶多酚搭配柠檬酸和Na₂EDTA，该抑制剂能够有效抑制食源性致病菌的生长。在本发明提供的生物膜抑制剂的一实施例中，所述生物膜抑制剂包括茶多酚、柠檬酸、Na₂EDTA和无菌水，其中，所述茶多酚、柠檬酸和Na₂EDTA的质量比为(0.1～3)：(25～60)：(0.1～2.5)。其中，所述无菌水可以选用白开水，或者经过化学法、物理过滤法等进行杀菌处理后的无菌水，所述无菌水的添加量不做限定，可以根据实际使用需求，将所述生物膜抑制剂配制成高浓度的浓缩液，也可以配制成能够直接使用的低浓度的稀释液。

本发明提供的技术方案中，所述生物膜抑制剂包括茶多酚、柠檬酸、Na₂EDTA和无菌水，且茶多酚、柠檬酸和Na₂EDTA的质量比为(0.1～3)：(25～60)：(0.1～2.5)，此比例范围内获得的生物膜抑制剂对食品的优势腐败菌生长具有显著的抑制效果，能够抑制食源性致病菌的生长，减少细菌生物膜的形成；其中，茶多酚、柠檬酸和Na₂EDTA均为食品中常见、安全的添加剂，茶多酚具有良好的抗菌、抗氧化、抗生物膜作用；柠檬酸是食品中常见的酸碱调节剂、抗氧化剂、风味增进剂，此外还具有一定的抑菌作用；Na₂EDTA在食品添加剂中通常作为螯合剂、防腐剂和抗氧化剂，在本方案中可络合金属离子，Na₂EDTA和柠檬酸与茶多酚协同作用，增强茶多酚的抗菌和抗生物膜作用。此外，本发明提供的生物膜抑制剂涉及的物质浓度低，低于GB2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》食品添加剂国家限量标准，安全可靠，且成本低，容易商业化购得，可同时作为食品保鲜剂和生物膜清除剂，特异性好，针对性强，尤其适用于冷鲜肉和小龙虾的抗菌抗生物膜、护色保鲜需求。

作为本发明的一优选实施方式，所述生物膜抑制剂中：所述茶多酚、柠檬酸和Na₂EDTA的质量比为(0.5～2)：(40～55)：(0.2～1)。在此比例范围内，所述生物膜抑制剂抑制食源性致病菌生长的抑制效果更佳。

作为本发明提供的另一优选实施方式，所述生物膜抑制剂中：所述茶多酚、柠檬酸和Na₂EDTA的质量比为1:50:0.5。由此添加配比获得的所述生物膜抑制剂对常见杆菌，包括大肠杆菌ATCC 25922、沙门氏菌、奇异变形杆菌和枯草芽孢杆菌等具有更为显著的抑制作用，且针对肉类优势腐败菌和小龙虾优势腐败菌具有极为显著的抑制效果。

进一步地，本发明还提出一种如上所述的生物膜抑制剂的制备方法，按比例将所述茶多酚、柠檬酸和Na₂EDTA添加到无菌水中，搅拌至所述茶多酚、柠檬酸和Na₂EDTA完全溶解，即制得所述生物膜抑制剂。考虑到茶多酚的溶解难度相较于所述柠檬酸和Na₂EDTA稍高，因此，作为本发明提供的生物膜抑制剂的一优选实施例，所述生物膜抑制剂的制备方法包括以下步骤：将柠檬酸、Na₂EDTA和茶多酚依次加入到无菌水中，搅拌至完全溶解，制得生物膜抑制剂。具体地，先将所述柠檬酸和Na₂EDTA按比例加入到无菌水中，搅拌至完全溶解，然后再加入茶多酚进行搅拌至完全溶解，可以解决所述茶多酚溶解难的问题，降低了所述生物膜抑制剂的制备难度。

本发明上述实施例提供的生物膜抑制剂对食源性致病菌具有显著的抑制作用，可以直接在食品保鲜处理过程中使用，喷涂于食品表面，起到抑制生物膜和延长产品保质期的作用，也可以应用于食品加工过程中所使用到的加工设备，对食品加工设备进行抑菌清洁，起到防腐抗生物膜的作用，避免在食品加工生产环境中食源性细菌及其生物膜造成的污染。因此，基于上述提供的生物膜抑制剂，本发明还提出一种食品保鲜的方法，使用上述提供的生物膜抑制剂对食品进行保鲜处理。具体地，在本发明提供的食品保鲜的方法的一实施例中，上述食品保鲜的方法包括以下步骤：将生物膜抑制剂喷洒于待保鲜处理的食品表面，然后将所述待保鲜处理的食品包装并冷链储存；其中，所述生物膜抑制剂为如上所述的生物膜抑制剂。进一步地，所述待保鲜处理的食品优选为冷鲜肉或小龙虾，本发明提供的所述生物膜抑制剂特异性好，针对性强，尤其对适用于冷鲜肉和小龙虾的抗菌抗生物膜、护色保鲜需求，能够有效抑制各类食源性致病菌生长。

更进一步地，当所述生物膜抑制剂在使用时，浓度越高，抑菌效果当然也越好，但是综合考虑到试剂浓度带来的副作用和成本问题，优选为所述生物膜抑制剂中的茶多酚、柠檬酸、Na₂EDTA的使用总浓度分别为0.1g/L、5g/L和0.05g/L，在能够有效抑制生物膜的基础上，基本无副作用，成本也较低，更有利于所述生物膜抑制剂的推广使用。如果预先配制的所述生物膜抑制剂中各组分的浓度高于此浓度范围，在使用前可先添加适量的无菌水进行稀释，所述无菌水同样可以选用白开水，或者经过化学法、物理过滤法等进行杀菌处理后的无菌水。

此外，本发明还提出一种食品加工设备的抑菌清洁方法，使用上述提供的生物膜抑制剂对食品加工设备进行抑菌清洁，同样地，所述生物膜抑制剂在使用前需要进行适当稀释，在本发明提供的食品加工设备的抑菌清洁方法的一实施例中，该方法包括以下步骤：将生物膜抑制剂喷洒于经过清洁后的食品加工设备上，例如将稀释后的生物膜抑制剂喷洒于经过常规清洁后的食品加工台面或管道等难以清洁的部位，可用于清除生物膜；其中，所述生物膜抑制剂为如上所述的生物膜抑制剂。同样地，综合考虑到试剂浓度带来的副作用和成本问题，优选为所述生物膜抑制剂中的茶多酚、柠檬酸、Na₂EDTA的使用总浓度分别为0.1g/L、5g/L和0.05g/L，在能够有效抑制生物膜的基础上，基本无副作用，成本也较低，更有利于所述生物膜抑制剂的推广使用。如果预先配制的所述生物膜抑制剂中各组分的浓度高于此浓度范围，在使用前可先添加适量的无菌水进行稀释，所述无菌水同样可以选用白开水，或者经过化学法、物理过滤法等进行杀菌处理后的无菌水。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

(1)生物膜抑制剂包括：茶多酚0.1份、柠檬酸25份、Na₂EDTA 0.1份以及无菌水74.8份。

(2)将柠檬酸和Na₂EDTA加入到无菌水中，搅拌至完全溶解后，再加入茶多酚搅拌至完全溶解，得到生物膜抑制剂。

实施例2

(1)生物膜抑制剂包括：茶多酚0.5份、柠檬酸40份、Na₂EDTA 0.2份以及无菌水59.3份。

(2)将柠檬酸和Na₂EDTA加入到无菌水中，搅拌至完全溶解后，再加入茶多酚搅拌至完全溶解，得到生物膜抑制剂。

实施例3

(1)生物膜抑制剂包括：茶多酚1份、柠檬酸50份、Na₂EDTA 0.1～2.5份以及无菌水34.5～74.8份。

(2)将柠檬酸和Na₂EDTA加入到无菌水中，搅拌至完全溶解后，再加入茶多酚搅拌至完全溶解，得到生物膜抑制剂。

实施例4

(1)生物膜抑制剂包括：茶多酚2份、柠檬酸55份、Na₂EDTA 1.0份以及无菌水42份。

(2)将柠檬酸和Na₂EDTA加入到无菌水中，搅拌至完全溶解后，再加入茶多酚搅拌至完全溶解，得到生物膜抑制剂。

实施例5

(1)生物膜抑制剂包括：茶多酚3份、柠檬酸60份、Na₂EDTA 2.5份以及无菌水34.5份。

(2)将柠檬酸和Na₂EDTA加入到无菌水中，搅拌至完全溶解后，再加入茶多酚搅拌至完全溶解，得到生物膜抑制剂。

应用测试

1、生物膜抑制剂对常见杆菌的抑制效果

(1)配制生物膜抑制剂：将茶多酚、柠檬酸和Na₂EDTA按照表1的比例配制，余量为无菌水(茶多酚、柠檬酸、Na₂EDTA和无菌水的总质量份数为100份)，充分混合均匀得到生物膜抑制剂浓缩液，然后加入无菌水稀释50倍，备用。

(2)培养常见杆菌：将大肠杆菌ATCC 25922、沙门氏菌、奇异变形杆菌和枯草芽孢杆菌分别接种于LB液体培养基中，摇床120rpm培养12h，于分光光度计下测定各细菌菌悬液OD₆₀₀值，并调节OD₆₀₀至接近1；然后将4种细菌分别等量加入离心管中，混合均匀，制备成混合菌液，再用LB新鲜培养基将混合菌液稀释50倍，制得混合菌悬液，备用。

(3)混合菌与生物膜抑制剂共培养：将稀释后的混合菌悬液和稀释后的生物膜抑制剂按照1:1的比例加入到96孔板中，每孔加样200μL，每个样品重复5个平行对照，设置阳性和阴性对照，阳性对照为不加生物膜抑制剂的混合菌液，阴性对照只加LB液体培养基。将96孔板在28℃下静置培养72h，培养完成后，弃掉菌液，加入250μL无菌PBS缓冲液洗涤2次后风干；再每孔加入0.1％的结晶紫染液250μL，染色20min后去除染液，加入250μL无菌PBS缓冲液洗涤3次，至阴性对照孔多余染液被几乎洗净为止，然后风干并对96孔板进行拍照，加入250μL 95％的乙醇，过夜抽提多余染料，测定OD₅₉₅值，定量测定细菌生物膜，测定结果如图1所示。

表1生物膜抑制剂中各组分的使用终浓度

由图1的测试结果可知，除阳性对照组形成很强的生物膜外，添加有生物膜抑制剂的实验组均未在96孔板中形成生物膜，说明本发明提供的生物膜抑制剂具有显著的抗生物膜效果，其中以实验组1的抑菌效果最佳，说明本发明提供的生物膜抑制剂在低剂量下，且茶多酚、柠檬酸和Na₂EDTA的质量分数分别为1％、50％和0.5％时，所述生物膜抑制剂的使用效果最佳。

2、生物膜抑制剂对小龙虾优势菌的抑制效果

(1)配制生物膜抑制剂：将茶多酚、柠檬酸和Na₂EDTA按照1份、50份和0.5份的比例配制(对应茶多酚、柠檬酸和Na₂EDTA的使用终浓度分别为0.1g/L、5g/L和0.05g/L)，余量为无菌水(48.4份)，充分混合均匀得到生物膜抑制剂浓缩液，然后加入无菌水稀释50倍，备用。

(2)培养小龙虾优势菌：将阴沟肠杆菌、溶酪巨球菌、嗜水杆菌、蜡样芽孢杆菌分别接种于LB液体培养基中，摇床120rpm培养12h，于分光光度计下测定各细菌菌悬液OD₆₀₀值，并调节OD₆₀₀至接近1；然后将4种细菌分别等量加入离心管中，混合均匀，制备成混合菌液，再用LB新鲜培养基将混合菌液稀释50倍，制得混合菌悬液，备用。

(3)混合菌与生物膜抑制剂共培养：将稀释后的混合菌悬液和稀释后的生物膜抑制剂按照1:1的比例加入到96孔板中，每孔加样200μL，每个样品重复5个平行对照，设置阳性和阴性对照，阳性对照为不加生物膜抑制剂的混合菌液，阴性对照只加LB液体培养基。将96孔板在28℃下静置培养72h，培养完成后，弃掉菌液，加入250μL无菌PBS缓冲液洗涤2次后风干；再每孔加入0.1％的结晶紫染液250μL，染色20min后去除染液，加入250μL无菌PBS缓冲液洗涤3次，至阴性对照孔多余染液被几乎洗净为止，然后风干并对96孔板进行拍照，加入250μL 95％的乙醇，过夜抽提多余染料，测定OD₅₉₅值，定量测定细菌生物膜，测定结果如图2所示。

3、生物膜抑制剂对肉类优势菌的抑制效果

(1)配制生物膜抑制剂：将茶多酚、柠檬酸和Na₂EDTA按照1份、50份和0.5份的比例配制(对应茶多酚、柠檬酸和Na₂EDTA的使用终浓度分别为0.1g/L、5g/L和0.05g/L)，余量为无菌水(48.5份)，充分混合均匀得到生物膜抑制剂浓缩液，然后加入无菌水稀释50倍，备用。

(2)培养肉类优势菌：将乳酸菌、铜绿假单胞杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌ATCC 25922分别接种于LB液体培养基中，摇床120rpm培养12h，于分光光度计下测定各细菌菌悬液OD₆₀₀值，并调节OD₆₀₀至接近1；然后将4种细菌分别等量加入离心管中，混合均匀，制备成混合菌液，再用LB新鲜培养基将混合菌液稀释50倍，制得混合菌悬液，备用。

(3)混合菌与生物膜抑制剂共培养：将稀释后的混合菌悬液和稀释后的生物膜抑制剂按照1:1的比例加入到96孔板中，每孔加样200μL，每个样品重复5个平行对照，设置阳性和阴性对照，阳性对照为不加生物膜抑制剂的混合菌液，阴性对照只加LB液体培养基。将96孔板在28℃下静置培养72h，培养完成后，弃掉菌液，加入250μL无菌PBS缓冲液洗涤2次后风干；再每孔加入0.1％的结晶紫染液250μL，染色20min后去除染液，加入250μL无菌PBS缓冲液洗涤3次，至阴性对照孔多余染液被几乎洗净为止，然后风干并对96孔板进行拍照，加入250μL 95％的乙醇，过夜抽提多余染料，测定OD₅₉₅值，定量测定细菌生物膜，测定结果如图3所示。

由图2和图3的测定结果可知，除阳性对照组形成很强的生物膜外，其他实验组均未在96孔板中形成生物膜，说明本发明提供的生物膜抑制剂对小龙虾优势腐败菌和肉类优势腐败菌具有显著的抗生物膜效果。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。