阅读说明：本技术 一种多重pcr检测羊肉掺假的方法 (Method for detecting mutton adulteration by multiple PCR ) 是由 苟惠天 曹启航 韩晓梅 刘圆园 孙亚楠 薛慧文 魏衍全 于 2020-07-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种一种多重PCR检测羊肉掺假的方法,生物技术领域。本发明通过标准品采集及DNA提取、设计多重PCR引物、引物筛选扩增、检测引物的特异性和稳定性、构建双重PCR扩增体系、对掺杂羊肉样品进行检测这六个步骤来实现多重PCR检测羊肉掺假。本发明利用多重多聚酶链反应依据片段大小可以在一次PCR中检测羊肉及掺杂其中的其他肉类。本发明建立的复式PCR方法操作简便,特异性强,灵敏度高,可以在肉类及产制品鉴定和溯源中应用,提高了检测效率。本发明中以单一引物、两种引物或者四种引物进行总DNA模板进行PCR反应,其特异性片段均能被扩增出。(The invention discloses a method for detecting mutton adulteration by multiple PCR, belonging to the technical field of biology. The method realizes the multiplex PCR detection of mutton adulteration by six steps of standard product collection and DNA extraction, multiple PCR primer design, primer screening and amplification, primer specificity and stability detection, double PCR amplification system construction and mutton adulteration sample detection. The invention can detect mutton and other meat doped therein in one PCR by utilizing multiple polymerase chain reactions according to the size of fragments. The duplex PCR method established by the invention is simple and convenient to operate, has strong specificity and high sensitivity, can be applied to identification and tracing of meat and products, and improves the detection efficiency. In the invention, a single primer, two primers or four primers are used for carrying out PCR reaction on the total DNA template, and specific fragments can be amplified.)

一种多重PCR检测羊肉掺假的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多重PCR检测羊肉掺假的方法。

背景技术

自古以来“民以食为天”，“食”一直以来是人们日常生活中必不可少的一部分。随着社会经济的发展，肉类及其制品成为人们日常食物的重要来源和组成部分。如今，食品的丰富多样化和网络销售渠道也给肉类掺假者带来了可乘之机。这不仅仅涉及消费者的经济、营养价值和食品安全等问题，而且扰乱了肉类流通市场秩序。一些不法商家或个人为了追求自身利益用低价劣质的肉冒充高价优质的肉，尤以掺杂异种肉的造假行为最为常见。

传统的依靠感官与经验的肉类形态学鉴别手段已远不能满足对肉类食品掺假进行控制和监管的需求。目前，对肉类的鉴别方法主要有：显微镜观察法，通过肉制品的味道、色泽、肉类的纹理等进行肉类来源的判别；蛋白质检测法，如等电聚焦电泳法、免疫法、酶联免疫吸附实验、色谱法；DNA检测法，如核酸探针杂交、限制性片段长度多态性聚合酶链反应分析、DNA指纹分析和PCR特异扩增。基于显微镜及蛋白质的鉴别方法需要丰富的经验，且具有极大的主观性，主要用于生鲜肉类的鉴别。在熟肉制品中，蛋白质遇高温易变性，利用蛋白质检测法无法灵敏地检测其肉质种源。除此之外，这些方法存在成本高、工作量大、对检测对象要求高等缺点。分子生物学鉴定中的DNA杂交法费时、昂贵且复杂，而PCR方法由于反应时间短，具有较高灵敏性、特异性和可鉴别性，已成为肉制品品种鉴别中最常用的方法。目前，根据线粒体基因组DNA序列差异设计物种特异性引物建立的PCR与实时荧光PCR方法已有大量报道，且进入了中国权威的检测技术标准。PCR方法可以解决传统方法中由于蛋白质变性而失能的困难，使肉类及其制品种类鉴定成为必要，为临床或食品安全检测提供更多更准确的信息。

本发明根据动物线粒体16S rRNA基因的差异性位点，设计特异性引物，通过优化PCR反应体系，建立了正向引物共用、反向引物特异的PCR反应体系，一次PCR反应可同时扩增出四个不同物种的特异性片段。该方法具有较高的灵敏度和准确度，且操作简单易行，有望成为常规检测的有效方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单，提高灵敏度和准确度，一次PCR反应可同时扩增出四个不同物种的特异性片段的多重PCR检测羊肉掺假的方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种多重PCR检测羊肉掺假的方法，包括如下步骤：

1)标准品采集及DNA提取：将羊肉、猪肉、鸭肉和鼠肉分别于小型食品加工机中绞碎后备用，按相同重量称取羊肉、猪肉、鸭肉和鼠肉于离心管中，通过基因提取试剂盒分别提取羊肉、猪肉、鸭肉和鼠肉4种纯肉样品的DNA；

2)设计多重PCR引物：根据羊肉、猪肉、鸭肉和鼠肉的线粒体18SrRNA基因序列设计并确定各自特异引物，四个物种的编号分别为:羊-Y、猪-Z、鸭-YA、鼠-S,其产物大小分别为276bp,327bp,570bp,168bp；

3)引物筛选扩增：取10只0.2mLPCR管，依次编号1～10号，分别加入样品放入PCR仪进行扩增；

4)检测引物的特异性、稳定性：取一支离心管，依次加入Tap酶100uL，水88uL,forwall 4uL,revsus4uL，混合均匀后，取49uL依次加入4只PCR管中；在4只管中依次加入样品羊、猪、鸭、鼠；PCR进行扩增；扩增完成后，取 PCR产物加样，进行电泳；

5)构建双重PCR扩增体系：在反应体系：25uLTap酶12.5uL，水11uL,forw all0.5uL，rev羊、鼠各0.25uL，羊鼠模版各0.25uL的条件下进行扩增；

6)对掺杂羊肉样品进行检测：多重PCR反应采用50uL反应体系，Tap酶 25uL，水22uL,forw all 1uL，rev鸭、羊、鼠、猪按一定比例共1uL，掺杂样品模版1uL，待扩增完成后，取PCR产物加样，进行电泳。

进一步地，所述步骤3)中扩增条件为：预变性：95℃/2min,变性：95℃/30S, 退火：1～10号管温度分别为50℃～59℃/30S,延伸：72℃/1min,延伸：72℃ /8min,保存。

进一步地，所述4℃扩增完成后，取PCR产物加样，进行电泳。

进一步地，所述步骤5)中的扩增条件：预变性：95℃/2min,变性：95℃/30S, 退火：52℃/30S,延伸：72℃/1min,延伸：72℃/8min,保存：4℃取PCR产物， 2.0％琼脂糖凝胶，150V电泳30min。

进一步地，所述步骤6)中根据凝胶成像系统所出现的条带，判断是否掺杂以及掺杂的肉类。

进一步地，所述下游引物需要至少2次调整，直至出现2条清晰的条带。

进一步地，所述步骤4)中只有对应的小鼠条带时，其引物具有特异性。

本发明的有益效果是：

1)本发明利用多重多聚酶链反应依据片段大小可以在一次PCR中检测羊肉及掺杂其中的其他肉类。

2)本发明建立的复式PCR方法操作简便，特异性强，灵敏度高，可以在肉类及产制品鉴定和溯源中应用，提高了检测效率。

3)本发明中以单一引物、两种引物或者四种引物进行总DNA模板进行PCR 反应，其特异性片段均能被扩增出。

附图说明

图1为本发明四种肉品的基因组扩增条带；其中，M:DNA Marker 2000；1: 羊；2:鼠；3:鸭；4:猪。

图2为本发明鸭基因组温度梯度；其中，1～8所对应温度分别为50～57℃。

图3为本发明羊基因组温度梯度。

图4为本发明猪引物特异性，其中，2为猪肉PCR产物条带；1、3、4分别为羊肉、鸭肉、鼠肉。

图5为本发明鸭引物特异性；其中，M:DNA Marker 2000；3为鸭肉PCR 产物条带；1、2、4分别为羊肉、猪肉、鼠肉。

图6为本发明羊肉中掺杂鼠肉；其中，M:DNA Marker 2000；1为纯羊肉的阳性对照；2为纯鼠肉的阳性对照；3、4为羊肉中掺入鼠肉的扩增产物。

图7为本发明羊肉中掺杂鸭肉；其中，M:DNA Marker 2000；1为纯羊肉的阳性对照；2为纯鸭肉的阳性对照；3、4、5为羊肉中掺入鸭肉的扩增产物。

图8为本发明羊肉中掺杂鼠肉、猪肉；M:DNA Marker 2000；1为纯猪肉的阳性对照；2、3为羊肉中掺入鼠肉和猪肉的扩增产物。

图9为本发明羊肉中掺杂猪肉、鸭肉和鼠肉；其中，M:DNA Marker 2000； 1为纯鸭肉的阳性对照；2、3为羊肉中掺入猪、鸭和鼠肉的扩增产物。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：

一种多重PCR检测羊肉掺假的方法，包括如下步骤：

1)标准品采集及DNA提取：将羊肉、猪肉、鸭肉和鼠肉分别于小型食品加工机中绞碎后备用，按相同重量称取羊肉、猪肉、鸭肉和鼠肉于离心管中，通过基因提取试剂盒分别提取羊肉、猪肉、鸭肉和鼠肉4种纯肉样品的DNA；

2)设计多重PCR引物：根据羊肉、猪肉、鸭肉和鼠肉的线粒体18SrRNA基因序列设计并确定各自特异引物，四个物种的编号分别为:羊-Y、猪-Z、鸭-YA、鼠-S,其产物大小分别为276bp,327bp,570bp,168bp；

3)引物筛选扩增：取10只0.2mLPCR管，依次编号1～10号，分别加入样品放入PCR仪进行扩增；所述扩增条件为：预变性：95℃/2min,变性：95℃/30S, 退火：1～10号管温度分别为50℃～59℃/30S,延伸：72℃/1min,延伸：72℃ /8min,保存。所述4℃扩增完成后，取PCR产物加样，进行电泳。

4)检测引物的特异性、稳定性：取一支离心管，依次加入Tap酶100uL，水88uL,forwall 4uL,revsus4uL，混合均匀后，取49uL依次加入4只PCR管中；在4只管中依次加入样品羊、猪、鸭、鼠；PCR进行扩增；扩增完成后，取 PCR产物加样，进行电泳；只有对应的小鼠条带时，其引物具有特异性。

5)构建双重PCR扩增体系：在反应体系：25uLTap酶12.5uL，水11uL,forw all0.5uL，rev羊、鼠各0.25uL，羊鼠模版各0.25uL的条件下进行扩增；所述扩增条件：预变性：95℃/2min,变性：95℃/30S,退火：52℃/30S,延伸：72℃ /1min,延伸：72℃/8min,保存：4℃取PCR产物，2.0％琼脂糖凝胶，150V电泳 30min。所述下游引物需要至少2次调整，直至出现2条清晰的条带。

6)对掺杂羊肉样品进行检测：多重PCR反应采用50uL反应体系，Tap酶25uL，水22uL,forw all 1uL，rev鸭、羊、鼠、猪按一定比例共1uL，掺杂样品模版1uL，待扩增完成后，取PCR产物加样，进行电泳。根据凝胶成像系统所出现的条带，判断是否掺杂以及掺杂的肉类。

实验例

下面根据本发明的技术内容作出以下实验。

一、纯肉样品PCR的鉴别

以提取的各种肉品DNA为模板，使用相对应的引物进行PCR扩增，羊、猪、鸭、鼠分别对应条带276bp,327bp,570bp,168bp,说明已经正确提取出各样品基因组，电泳结果见图1。

二、针对每一对引物筛选扩增条件

对四种样品的基因组进行温度梯度扩增，观察最适退火温度为3号条带，对应温度为52℃。结果如图2，3。

三、检测引物的特异性

以提取的4种肉类为模板，用猪肉引物进行PCR扩增。结果如图4。说明猪肉DNA具有唯一的扩增片段，其他肉类DNA无扩增结果，猪肉的引物具有良好的特异性，可以有效的从常用的几种肉制品中鉴定出猪肉。

以提取的4种肉类为模板，用鸭肉引物进行PCR扩增。结果如图5。说明鸭肉DNA具有唯一的扩增片段，其他肉类DNA无扩增结果，鸭肉的引物具有良好的特异性，可以有效的从常用的几种肉制品中鉴定出鸭肉。

四、混合样品双重PCR反应

同时用羊、鼠的特异性引物对含鼠肉和羊肉的总DNA模板进行PCR反应，重复3次，结果如图6。可以看出羊、鼠的特异性片段均能被扩增出。

同时用羊、鸭的特异性引物对含鸭肉和羊肉的总DNA模板进行PCR反应，重复3次，结果如图7。可以看出羊、鸭的特异性片段均能被扩增出。

五、混合样品多重PCR反应

同时用羊、猪、鸭、鼠的特异性引物对含猪肉、鸭肉、鼠肉和羊肉的总DNA 模板进行PCR反应，重复3次，结果如图9。可以看出羊、猪、鸭、鼠的特异性片段均能被扩增出。

由此可知，本发明中以单一引物猪肉DNA或鸭肉DNA进行扩增时，猪肉或鸭肉具有良好的特异性，可以从其他肉制品中鉴别出来。

同时用羊、鼠的特异性引物或羊、鸭的特异性引物对含鼠肉和羊肉的总DNA 模板进行PCR反应或含鸭肉和羊肉的总DNA模板进行PCR反应，羊、鼠或羊、鸭的特异性片段均能被扩增出。

同时用羊、猪、鸭、鼠的特异性引物对含猪肉、鸭肉、鼠肉和羊肉的总DNA 模板进行PCR反应，羊、猪、鸭、鼠的特异性片段均能被扩增出。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。