阅读说明：本技术 哮喘生物标志物klrc1及其应用 (Asthma biomarker KLRC1 and application thereof ) 是由 杨永清 陈艳焦 王宇 徐玉东 尹磊淼 刘艳艳 于 2019-03-29 设计创作，主要内容包括：本发明属于哮喘诊断研究领域,具体提供了哮喘生物标志物KLRC1及其应用。本发明涉及疾病相关生物标志物及应用领域,首次公开了一种自然杀伤细胞受体KLRC1在哮喘患者中表达上调,提示检测KLRC1受体水平可以用于哮喘临床诊断、直接反映哮喘控制情况,以及KLRC1抗体运用于哮喘疾病防治的应用。KLRC1作为生物标志物用于哮喘的诊断、治疗方案选择、预后评估,客观、特异性高、灵敏度好。可克服原有哮喘检测大多为主观检测的局限。(The invention belongs to the field of asthma diagnosis research, and particularly provides an asthma biomarker KLRC1 and application thereof. The invention relates to disease-related biomarkers and the application field, and discloses the expression up-regulation of a natural killer cell receptor KLRC1 in an asthmatic patient for the first time, which prompts the detection of the KLRC1 receptor level to be used for clinical diagnosis of asthma and directly reflecting the asthma control condition, and the application of a KLRC1 antibody in the prevention and treatment of asthma diseases. KLRC1 is used as a biomarker for asthma diagnosis, treatment scheme selection and prognosis evaluation, and has objectivity, high specificity and good sensitivity. Can overcome the limitation that the prior asthma detection is mostly subjective detection.)

哮喘生物标志物KLRC1及其应用

技术领域

本发明属于细胞生物技术领域，具体涉及哮喘生物标志物KLRC1及其应用。

背景技术

2018年GINA指南中关于哮喘疾病的诊断，仍以患者临床症状、体征，结合实验室检查、影像学检查及呼吸功能为依据。症状体征为主观指标不利于疾病诊断，肺功能检查有一定禁忌(如严重高血压、冠心病、肺大泡等)，支气管激发试验有患者耐受性差、诱发支气管痉挛危及生命的风险。缺少直接客观的诊断方法。

目前哮喘的治疗方案主要是控制哮喘症状，主要的方法有舒张平滑肌，控制气道高反应性。尽管规律性地吸入β受体激动剂和糖皮质激素，哮喘仍然会反复发作，而每一次发作便会加重肺部炎症和肺功能的进一步恶化。

KLRC1是一种43kD II型跨膜蛋白，主要表达在NK细胞膜上，属于NK类的受体家族(NKG2家族)。从蛋白结构角度出发，KLRC1属于C型凝集素样受体，也叫杀伤凝集素样受体(KLR)；从功能角度出发，KLRC1属于能够抑制NK细胞杀伤作用的抑制型受体。现有文献报道该受体直接影响NK细胞的活性，KLRC1抗体可应用于***药物。目前国内外没有关于此受体与哮喘疾病关系的研究，以及KLRC1抗体应用于哮喘防治的报道。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种哮喘生物标志物KLRC1及其应用。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供KLRC1用于制备或筛选哮喘检测试剂的用途。

进一步的，KLRC1作为生物标志物。

所述哮喘检测试剂用于哮喘的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估。

哮喘的预后评估是指对哮喘病人的病程和/或结局进行预后判断。

进一步的，所述哮喘检测试剂是指是指用于检测样本中KLRC1表达量的试剂，根据检测结果以对病人是否患有哮喘、选择何种治疗方案和/或病人的病程和/或结局进行预后判断。

在一种实施方式中，所述预后判断包括对病人的生活质量和/或哮喘控制进行判断。

进一步的，KLRC1表达量越高，病人的生活质量评分越低，哮喘越严重。KLRC1表达量越低哮喘生活质量评分越高，哮喘症状越轻。

KLRC1表达量越高，哮喘控制测试评分越低，哮喘越严重。KLRC1表达量越低，哮喘控制测试评分越高，哮喘症状越轻。

KLRC1的表达量可以为KLRC1的蛋白表达量、KLRC1基因的转录水平或是KLRC1的基因表达水平。

所述样本可以为待检测者全血RNA样本。

需要说明的是，所述哮喘检测试剂和/或哮喘预后判断试剂并不限定为必须为液体形式。

KLRC1基因的Genbank登录号为3821。

在一种实施方式中，所述特异性识别KLRC1的试剂选自特异性识别KLRC1基因的试剂或特异性识别KLRC1蛋白的试剂。

所述特异性识别KLRC1基因的试剂选自以下任一种或多种：(1)特异性扩增KLRC1基因或转录本的引物，(2)特异识别KLRC1基因或转录本的探针；所述特异性识别KLRC1蛋白的试剂为KLRC1蛋白的抗体或配体。

所述特异性扩增KLRC1基因的引物的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示；下游引物如SEQ ID NO：2所示。

所述抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明的第二方面，提供特异性识别KLRC1的试剂用于制备哮喘检测试剂盒的用途。

进一步的，KLRC1作为生物标志物。

述哮喘检测试剂用于哮喘的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估。

哮喘的预后评估是指对哮喘病人的病程和/或结局进行预后判断。

进一步的，所述哮喘检测试剂是指是指用于检测样本中KLRC1表达量的试剂，根据检测结果以对病人是否患有哮喘、选择何种治疗方案和/或病人的病程和/或结局进行预后判断。

在一种实施方式中，所述预后判断包括对病人的生活质量和/或哮喘控制进行判断。

进一步的，KLRC1表达量越高，病人的生活质量评分越低，哮喘越严重。KLRC1表达量越低哮喘生活质量评分越高，哮喘症状越轻。

KLRC1表达量越高，哮喘控制测试评分越低，哮喘越严重。KLRC1表达量越低，哮喘控制测试评分越高，哮喘症状越轻。

KLRC1的表达量可以为KLRC1的蛋白的表达量、KLRC1基因的转录水平或是KLRC1的基因表达水平。

所述样本可以为待检测者全血RNA样本。

需要说明的是，所述哮喘检测试剂和/或哮喘预后判断试剂并不限定为必须为液体形式。

在一种实施方式中，所述特异性识别KLRC1的试剂选自特异性识别KLRC1基因的试剂或特异性识别KLRC1蛋白的试剂。

所述特异性识别KLRC1基因的试剂选自以下任一种或多种：(1)特异性扩增KLRC1基因或转录本的引物，(2)特异识别KLRC1基因或转录本的探针；所述特异性识别KLRC1蛋白的试剂为KLRC1蛋白的抗体或配体。

所述特异性扩增KLRC1基因的引物的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示；下游引物如SEQ ID NO：2所示。

所述抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体。

所述试剂盒可以是实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒的基本原理是利用一对靶多核苷酸的特异性引物，在本试剂盒PCR扩增反应液中，通过荧光定量PCR扩增仪实现靶核苷酸的循环扩增，从而达到快速、定量检测多核苷酸的目的。

本发明第三方面提供一种哮喘检测试剂盒，所述试剂盒中至少包括哮喘检测试剂，所述哮喘检测试剂选自特异性识别KLRC1的试剂。

进一步的，KLRC1作为生物标志物。

述哮喘检测试剂用于哮喘的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估。

哮喘的预后评估是指对哮喘病人的病程和/或结局进行预后判断。

进一步的，所述哮喘检测试剂是指是指用于检测样本中KLRC1表达量的试剂，根据检测结果以对病人是否患有哮喘、选择何种治疗方案和/或病人的病程和/或结局进行预后判断。

在一种实施方式中，所述预后判断包括对病人的生活质量和/或哮喘控制进行判断。

进一步的，KLRC1表达量越高，病人的生活质量评分越低，哮喘越严重。KLRC1表达量越低哮喘生活质量评分越高，哮喘症状越轻。

KLRC1表达量越高，哮喘控制测试评分越低，哮喘越严重。KLRC1表达量越低，哮喘控制测试评分越高，哮喘症状越轻。

KLRC1的表达量可以为KLRC1的蛋白表达量、KLRC1基因的转录水平或是KLRC1的基因表达水平。

所述样本可以为待检测者全血RNA样本。

需要说明的是，所述哮喘检测试剂和/或哮喘预后判断试剂并不限定为必须为液体形式。

在一种实施方式中，所述特异性识别KLRC1的试剂选自特异性识别KLRC1基因的试剂或特异性识别KLRC1蛋白的试剂。

所述特异性识别KLRC1基因的试剂选自以下任一种或多种：(1)特异性扩增KLRC1基因或转录本的引物，(2)特异识别KLRC1基因或转录本的探针；所述特异性识别KLRC1蛋白的试剂为KLRC1蛋白的抗体或配体。

所述特异性扩增KLRC1基因的引物的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示；下游引物如SEQ ID NO：2所示。

所述抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体。

所述试剂盒可以是实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒的基本原理是利用一对靶多核苷酸的特异性引物，在本试剂盒PCR扩增反应液中，通过荧光定量PCR扩增仪实现靶核苷酸的循环扩增，从而达到快速、定量检测多核苷酸的目的。

本发明第四方面提供前述试剂盒的使用方法，包括步骤：

(1)加样：将样品基因组cDNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有前述KLRC1基因检测引物；

(2)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；

(3)PCR反应结束后，分析结果。

所述样本可以为待检测者全血RNA样本。

除了采用本发明的引物，本发明对PCR反应体系中其它各组分及其终浓度没有特别的限制，本领域人员可根据常规建立PCR体系时采用的一般成分及其浓度来建立PCR反应体系。用于PCR扩增的模板(如基因组DNA)也可采用本领域的常规方法提取获得。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明涉及疾病相关生物标志物及应用领域，首次公开了一种自然杀伤细胞(NK)受体KLRC1在哮喘患者及小鼠哮喘模型中表达上调，提示检测KLRC1受体水平可以用于哮喘临床诊断、直接反映哮喘控制情况，以及KLRC1抗体运用于哮喘疾病防治的应用。KLRC1作为生物标志物用于哮喘的诊断、治疗方案选择、预后评估，客观、特异性高、灵敏度好。可克服原有哮喘检测大多为主观检测的局限。

附图说明

图1显示为正常组与哮喘组全血RNA KLRC1基因表达量(*表示具有显著统计学意义p＜0.05)。

图2显示为哮喘患者治疗前和治疗后全血RNA KLRC1基因表达量(FC＞2或FC＜0.5)表示具有统计学意义。

图3显示为正常组和哮喘组KLRC1表达量拟合ROC曲线结果。

图4显示为KLRC1表达量与哮喘患者哮喘生活质量评分关系图。

图5显示为KLRC1表达量与哮喘患者哮喘控制测试评分关系图。

具体实施方式

KLRC1是一种43kD II型跨膜蛋白，主要表达在NK细胞膜上，属于NK类的受体家族(NKG2家族)。从蛋白结构角度出发，KLRC1属于C型凝集素样受体，也叫杀伤凝集素样受体(KLR)；从功能角度出发，KLRC1属于能够抑制NK细胞杀伤作用的抑制型受体。

KLRC1中的NKG2分子可以与恒定链CD94形成CD94-NKG2异源二聚体特异识别人类非经典HLA-E分子，利用自身具有的免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)来发挥抑制NK细胞杀伤作用。并有证据表明，每个NK细胞表面一般只表达一个抑制性受体，与非经典HLA-E类分子结合的KLRC1受体可能对NK细胞活性起着关键的作用。

我们的研究结果表明临床研究中，经基因芯片检测和RT-PCR验证哮喘患者较正常人KLRC1受体表达上调。这一受体可能为哮喘的诊断和防治提供新方法。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

哮喘检测试剂盒和/或哮喘预后判断试剂盒

基于本发明所述试剂盒是采用实时荧光PCR技术来进行检测的，所述试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：SYBR premix ex Taq、双蒸水(ddH₂O)、样品基因组DNA提取试剂、dNTPs、RT buffer、RNasin、M-MLV-RTase等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。

本发明的试剂盒，可以是含有独立包装的各组引物对，也可以是含有配置好的含有各组引物对的PCR检测混合液。

所述PCR检测混合液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用PCR检测混合液加入引物获得。例如，所述试剂盒中还可以含有SYBR premix ex Taq、双蒸水(ddH₂O)。加入本发明的引物、待检样本DNA提取物或者cDNA即可获得PCR反应体系。

可选的，所述试剂盒中还可含有阳性对照。所述阳性对照为含有KLRC1基因表达的cDNA样本。

可选的，所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为无KLRC1基因表达的cDNA样本。

所述试剂盒的使用方法

包括如下步骤：

(1)加样：将样品基因组cDNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有前述KLRC1基因检测引物；

(2)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；

(3)PCR反应结束后，分析结果。

可选的，步骤(3)中，PCR反应的条件设置为：(a)95℃15S；(b)95℃5S；(c)60℃30S；步骤(b)-(c)循环40次。

实施例1

1、临床哮喘患者全血RNA芯片检测与RT-PCR验证

(1)临床样品与数据来源

本研究中涉及的所有临床样品与数据，均来自“‘三穴五针’法针刺治疗哮喘随机、双盲临床试验”，正常组、哮喘组各8例。

(2)芯片检测

本研究选用的芯片为SBC Human(4*180K)ceRNA芯片，唯一一款全面覆盖mRNA、lncRNA、circRNA的基因芯片，可同时获得这三个层面的表达数据。

(3)RT-PCR验证

①引物设计

A.根据NCBI(National Center for Biotechnology Information)GeneBank数据库中检索人类mRNA序列https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/NM_001304448？ report＝genbank&log$＝nuclalign&blast_rank＝4&RID＝AY9ZP1ZG015；

B.利用PrimerPremier 5.0软件和PrimerBank(https://pga.mgh.harvard.edu/ primerbank/index.html)设计扩增引物，

上游引物AGAAGCTCATTGTTGGGATC(SEQ ID NO：1)，

下游引物TTCAGGGAAGAATTGTTGTG(SEQ ID NO：2)。

②逆转录合成cDNA

A.将PCR八连管置于冰上，依次加入：

B.温和混匀，短暂离心后，在65℃孵育5min，迅速放冰上降温；

C.按照以下步骤添加试剂：

D.温和地混匀，短暂离心；

E.使用Oligo(dT)18Primer，放置42℃孵育60min；

F.70℃加热5min终止反应；

G.-20℃保存一周内，更长时间存于-70℃以下温度。

③RT-PCR检测与分析

A.反应条件：

B.按照TOYOBO Realtime PCR Master Mix试剂盒的说明建立20ul实验体系见表，50个循环；

C.上完样品后，离心1min后，放入96仪器；

D.结束后，分析扩增效率和溶解曲线，判断引物以及反应条件是否合适，进而进行参数和引物的调整或重新设计；

E.将PCR产物进行测序，进行进一步的确认。

(4)哮喘患者临床症状控制与KLRC1相关性关联分析

本研究中对哮喘患者进行了哮喘症状控制评分，所用量表为哮喘生活质量问卷调 查(Asthma quality of life questionnaire)和哮喘控制测试(Asthma Control Test)，将量表评分与KLRC1进行了相关性关联分析。

临床患者——芯片检测结果：

芯片扫描得到的原始数据由R软件中limma包进行归一化处理，所用的算法为Quantile，归一化信号值为经过log2计算的信号值。

说明：

治疗前与治疗后KLRC1基因变化具有统计学意义p＝0.001949；

治疗前临床样本均值/治疗后临床样本均值＝1.520885。

临床患者——RT-PCR结果：

正常组与哮喘组全血RNA KLRC1基因表达量如图1所示，可以看出，哮喘组的全血RNA KLRC1基因表达量高于正常组。

哮喘患者治疗前和治疗后全血RNA KLRC1基因表达量如图2所示，可以看出治疗前与治疗后KLRC1基因变化具有统计学意义(FC＜0.5)。

临床患者——正常组和哮喘组KLRC1表达量拟合ROC曲线结果：

如图3及下表所示,KLRC1作为哮喘的生物标志物准确性高。

a.在非参数假设下

b.零假设:实面积＝0.5

临床患者——相关性关联分析结果

KLRC1表达量与哮喘患者哮喘生活质量问卷调查呈中等负相关关系，如图4，表示KLRC1表达量越高哮喘生活质量评分越低，哮喘越严重，KLRC1表达量越低哮喘生活质量评分越高，哮喘症状越轻。

KLRC1表达量与哮喘患者哮喘控制测试评分呈中等负相关关系，如图5，表示KLRC1表达量越高哮喘控制测试评分越低，哮喘越严重，KLRC1表达量越低哮喘控制测试评分越高，哮喘症状越轻。

本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 上海中医药大学

<120> 哮喘生物标志物KLRC1及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agaagctcat tgttgggatc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttcagggaag aattgttgtg 20