阅读说明：本技术 白花蛇舌草抗肿瘤有效组分及其制备方法和用途 (Oldenlandia diffusa anti-tumor effective component and preparation method and application thereof ) 是由 王英锋 洪雅 于 2020-04-02 设计创作，主要内容包括：本发明涉及医药领域,具体涉及一种白花蛇舌草抗肿瘤有效组分及其制备方法和用途。本发明提供的一种山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半糖和E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯单独或组合在抗肿瘤或者制备抗肿瘤药物中的用途,本发明研究发现山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半糖化合物单体和E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯化合物单体各自都具有很强的抗肿瘤活性,在体内抗肿瘤活性研究中,抑制率可以分别达到48.97％和45.96％,而当两者组合抑制肿瘤细胞时,发现两者具有显著的协同抑制肿瘤的作用。(The invention relates to the field of medicines, and in particular relates to an oldenlandia antitumor active component, and a preparation method and application thereof. The invention provides an application of kaempferol-3-O- [2-O- (6-O-E-feruloyl) -beta-D-glucopyranosyl ] -beta-D-glucopyranose and E-6-O-p-coumaroyl paederoside methyl ester in anti-tumor or anti-tumor drug preparation, the invention researches to find that kaempferol-3-O- [2-O- (6-O-E-feruloyl) -beta-D-glucopyranosyl ] -beta-D-glucopyranose compound monomer and E-6-O-p-coumaroyl paederoside methyl ester compound monomer respectively have strong anti-tumor activity, in the research of in vivo anti-tumor activity, the inhibition rate can reach 48.97% and 45.96% respectively, and when the two are combined to inhibit tumor cells, the two are found to have obvious synergistic tumor inhibition effect.)

白花蛇舌草抗肿瘤有效组分及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种白花蛇舌草抗肿瘤有效组分及其制备方法和用途。

背景技术

白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Willd.)是茜草科耳草属植物,广泛分布于亚热带地区。在我国云南、广西、广东、福建、浙江、江苏和安徽等地均有生长。白花蛇舌草的主要功效为清热解毒和利尿，药理研究表明,其具有抗菌、增强免疫功能、抗肿瘤和抗衰老等作用。白花蛇舌草中成分复杂，主要含有蒽醌类、萜类、黄酮类、甾醇类、有机酸类、多糖类、生物碱类、微量元素、氨基酸及挥发性成分。蒽醌类成分以茜素型为主，黄酮类成分主要以槲皮素和山奈酚等为主，萜类成分以环烯醚萜类为主要成分，甾醇类化合物中以β-谷甾醇、豆甾醇为主，有机酸类以熊果酸、齐墩果酸、阿魏酸。

恶性肿瘤严重威胁人类生命健康，是全世界死亡率最高的疾病。随着人们生活方式的改变和环境污染的加剧，近年来其发病率呈逐年上升的趋势。而白花蛇舌草中具有丰富的抗肿瘤活性成分，目前被报道过具有抗肿瘤活性的成分主要有蒽醌类、萜类、黄酮类、甾醇类、有机酸类、多糖类和挥发性成分。从白花蛇舌草中分离提取抗肿瘤活性物质，开发成具有抗肿瘤疗效的新药，将具有重要的应用价值和广阔发展前景。为此，本发明在前人研究的基础上，对白花蛇舌草进行有效部位进行提取，经过大量的研究，从中分离得到了白花蛇舌草的抗肿瘤有效组分，对抗肿瘤新药的开发具有非常重要的意义。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种白花蛇舌草抗肿瘤有效组分及其制备方法和用途。

为此，本发明提供了如下的技术方案：

第一方面，本发明提供了一种山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半糖和E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯单独或组合在抗肿瘤或者制备抗肿瘤药物中的用途。

优选的，所述的肿瘤包括肝癌。

优选的，在组合时，山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半糖和E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯的质量比为1:1-1:5或2:1-5:1。

优选的，在组合时，山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半糖和E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯的质量比为1:2-1:5或2:1-5:1；优选的，质量比为1:2、1:3、1:4、1:5、2:1、3:1、4:1或5:1。

优选的，在组合时，山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半糖和E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯的质量比为3:1。

第二方面，本发明提供了一种白花蛇舌草抗肿瘤有效组分，包括山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半糖和E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯。

优选的，山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半糖和E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯的质量比为1:1-1:5或2:1-5:1。

优选的，山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半糖和E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯的质量比为1:2-1:5或2:1-5:1；优选的，质量比为1:2、1:3、1:4、1:5、2:1、3:1、4:1或5:1。

优选的，山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半糖和E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯的质量比为3:1。

优选的，所述的白花蛇舌草抗肿瘤有效组分的制备方法包括：

香豆酰鸡屎藤苷甲酯的制备方法包括：

将白花蛇舌草的提取物溶于体积百分比3-7％醇溶液中，上样大孔树脂，静态吸附，然后依次用体积百分比为8-12％、18-22％、28-32％和38-42％的醇溶液洗脱，收集体积百分比38-42％的醇溶液的洗脱液，浓缩，得到白花蛇舌草的有效部位；

将所得白花蛇舌草的有效部位溶于体积百分比15-25％醇溶液中，采用凝胶减压层析柱分离，使用体积百分比为15-25％的醇溶液洗脱，收集洗脱液，得到含E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯的洗脱液，然后使用体积百分比为45-55％的醇溶液洗脱，收集洗脱液，得到含山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半糖的溶液。

优选的，所述的白花蛇舌草抗肿瘤有效组分的制备方法包括：

将白花蛇舌草的提取物溶于体积百分比5％乙醇溶液中，上样大孔树脂，静态吸附，然后依次用体积百分比为10％、20％、30％和40％的乙醇溶液洗脱，收集体积百分比40％的乙醇溶液的洗脱液，浓缩，得到白花蛇舌草的有效部位；

将所得白花蛇舌草的有效部位溶于体积百分比20％乙醇溶液中，采用凝胶减压层析柱分离，使用体积百分比为20％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，得到含E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯的洗脱液，然后使用体积百分比为50％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，得到含山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半糖的溶液。

第三方面，本发明提供了一种抗肿瘤药物组合物，包括所述的白花蛇舌草抗肿瘤有效组分。

优选的，还包括制剂允许的药物赋形剂或载体。

优选的，所述抗肿瘤药物组合物的制剂形式包括液体制剂和固体制剂；优选的，所述制剂形式包括注射液、滴注液、冲剂、散剂、口服液、喷雾剂、粉针剂、颗粒剂、片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、口崩片、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、***剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、微丸、膏剂、丹剂或崩解剂。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的一种山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半糖和E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯单独或组合在抗肿瘤或者制备抗肿瘤药物中的用途，本发明研究发现山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半糖化合物单体和E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯化合物单体各自都具有很强的抗肿瘤活性，在体内抗肿瘤活性研究中，E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯剂量为5mg/kg，抑制率可以达到48.97％，山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半糖的抑制率也达到了45.96％，而当两者组合抑制肿瘤细胞时，发现两者具有显著的协同抑制肿瘤的作用。

2.本发明提供的一种白花蛇舌草抗肿瘤有效组分，包括山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半糖和E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯；上述白花蛇舌草抗肿瘤有效组分具有显著的抑制肿瘤的作用，通过研究发现，山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半糖和E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯的质量比为1:1-1:5或2:1-5:1时具有较为显著的抗肿瘤作用，而当山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半糖和E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯的质量比为3:1时，抗肿瘤作用最高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明

具体实施方式

或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1中C单体物质液相色谱图；

图2是本发明实施例1中C单体物质质谱图；

图3是本发明实施例1中F单体物质液相色谱图；

图4是本发明实施例1中F单体物质质谱图；

图5是本发明实验例1中小鼠接瘤后体内抗肿瘤实验中小鼠相对脾重结果图；

图6是本发明实验例1中小鼠接瘤后体内抗肿瘤实验中小鼠相对胸腺重量结果图；

图7是本发明实验例1中小鼠接瘤后体内抗肿瘤实验中小鼠白细胞数量比较结果图；

图8是本发明实验例1中小鼠接瘤后体内抗肿瘤实验中小鼠淋巴细胞数量百分比结果图。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

仪器：电子天平(JT10001,GingJian)，真空干燥箱(ZK-82A,上海市实验仪器总厂)，电热鼓风干燥箱(DL-101-ZBS,天津市中环实验电炉有限公司)，超声波清洗器(KQ-250型，昆山超声仪器有限公司)，超声波清洗器(KQ-500型，昆山超声仪器有限公司)，旋转蒸发仪(BüChi Rotavapor R-200，瑞典),水浴锅(长风，北京市长风仪器仪表公司)，提取罐(HM1-50,台湾省弘荃机械有限公司)；LC-MS(Waters2695:DualλAbsorbance Detector,Sample manager,Binary solvent manager；MS:Micromass Q-Tof；Masslyness V4.0工作站),NMR(Varian NMRs，600Hz)，超声波清洗器(KQ-250型，昆山超声仪器有限公司),超纯水机(pall),电子天平(Satorius)；

试剂：95％乙醇，D-101大孔树脂(天津南开大学试剂厂)，正丁醇(北京化工厂；批号：20090415)，凝胶Sephadex-20,甲醇，超纯水，有机滤膜(0.45um)；甲醇(Fisher，HPLCGrade,Fisher Scientific)，乙腈(Fisher，HPLC Grade,Fisher Scientific)，水(娃哈哈超纯水)。CD₃OD(CIL)。

药材：白花蛇舌草药材(购于河北省安国市药材市场)，经北京中医药大学刘春生教授鉴定。

实施例1白花蛇舌草抗肿瘤有效组分的制备、分离和纯化

(1)白花蛇舌草提取物的制备

取白花蛇舌草药材2kg，加入12倍量(24L)体积百分比为60％乙醇溶液中，浸泡过夜，80℃回流提取2小时，重复提取2次，合并提取液，旋转蒸发浓缩、干燥，得到白花蛇舌草提取物。

(2)白花蛇舌草有效部位的制备

取上述制备的白花蛇舌草提取物10g溶解于体积百分比为5％乙醇溶液50ml中，上样D-101型大孔树脂，上样完成后静态吸附过夜，依次用体积百分比为10％、20％、30％、40％乙醇溶液洗脱3至5倍柱体积，收集体积百分比40％乙醇溶液洗脱的洗脱液旋转蒸发浓缩，将浓缩液冻干成粉末，得到白花蛇舌草有效部位。

(3)E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯和山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半乳糖的制备

常温条件下将LH-20凝胶减压层析柱用体积百分比为20％乙醇溶液平衡3至5倍柱体积，然后将白花蛇舌草有效部位按照料液比1:5(g/ml)用体积百分比为20％的乙醇溶液溶解后上样，上样体积为柱床体积的2％，先用体积百分比为20％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液得到C单体溶液，然后用体积百分比为50％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液得到F单体溶液，分别将得到的C单体溶液和F单体溶液旋转蒸发浓缩后，冻干，得到C单体粉末和F单体粉末。

(4)分析鉴定

采用液相色谱和质谱联用(LC-MS)和NMR分别鉴定上述步骤(3)得到的C单体粉末和F单体粉末。分别将C单体粉末和F单体粉末采用分析级甲醇稀释，制备成供试品溶液。将得到的供试品溶液采用液相色谱和质谱进行分析。

色谱条件：

色谱柱：YMC-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；

流动相：流动相A为水，流动相B为乙腈，梯度洗脱条件见下表1；

流速：1.0mL/min；

检测波长：310nm；

柱温：35℃

进样体积：10μL。

表1：液相梯度洗脱条件

质谱条件：

Polarity(极性)：ESI-；Capillary(毛细管)：2600v；Source Temp(源温)：80℃；Desolvation Gas Flow(脱溶剂气流量)：600L/h；Desolvation Gas Flow Temp(脱溶剂气流量温度):300℃；Collision Energy(磁碰能量)(MS)：10v；Collision Energy(磁碰能量)(MSMS)：30v；Flight Tube(飞行管)：5630v；MCP Detector(微通道板检测器)：2400v。

LC-MS分析结果：

C单体物质和F单体物质进行LC-MS检测，得到了相应的液相图和质谱图，得到了两种物质的分子离子峰以及碎片峰，并与文献进行对比。C单体物质液相色谱图如图1所示，质谱图如图2所示。F单体物质液相色谱图如图3所示，质谱图如图4所示。C单体物质和F单体物质的保留时间和[M-H]^-如下表2。

表2各物质保留时间和[M-H]^-

NMR结果：

分别对C单体物质和F单体物质进行碳谱和氢谱分析，得到谱图后进行对照。

C单体物质的氢谱和HMQC数据见表3。

表3C单体物质的¹H和HMQC数据(D₂O，600MHz)

F单体物质的氢谱和HMQC数据见表4。

表4F单体物质的¹H和HMQC数据(D₂O，600MHz)

结果分析：

根据LC-MS数据和NMR数据与已知文献(张永勇,罗佳波.白花蛇舌草化学成分研究[J].中药材,2008(4):522)对照可以得出C单体物质是E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯，结构式如下：

F单体物质是山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半乳糖，结构式如下：

实验例1

本实验例目的在于研究单一组分C(E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯)和F(山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半乳糖)的体内抗肿瘤作用。

1材料和试剂

1.1实验动物

雄性(雌性)ICR小鼠：Ⅱ级，由北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号：SCXK京2007-0001)提供。

1.2受试肿瘤细胞株

实体瘤肿瘤细胞株S180(系北京鼎国生物科技技术有限公司惠赠)。

1.3实验用试剂与器材

1.3.1试剂

无水乙醇：批号，20081026；纯度，分析纯；来源，北京华腾化工有限公司；

75％酒精棉：系自配；

蒸馏水。

1.3.2器材

一次性使用无菌注射器：批号，071211；规格，5ml；来源，浙江欧健医用器材有限公司；

一次性使用无菌注射器：批号，080327；规格，1ml；来源，上海康寿医疗器械有限公司；

一次性使用无菌注射器：批号，080327；规格，20ml；来源，上海康寿医疗器械有限公司；

程控自主活动箱：医科院药研所制，2IL-2；

血球计数析：上海市求精生化试剂仪器有限公司；量制沪字，0202701113；

显微镜：XSD-A1；

灌胃针。

1.1受试药物

白花蛇舌草纯化后有效部位(以下简称有效部位)：实施例1步骤(2)制备得到；

E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯(以下简称为甲酯)：实施例1步骤(3)制备得到，经纯化，纯度检测得到纯度为98％以上；

山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半乳糖(以下简称为山奈酚)：实施例1步骤(3)制备得到，经纯化，纯度检测为98％以上；

对香豆酸(阿拉丁试剂公司)。

1.2阳性对照药物

环磷酰胺：中西试剂有限公司(100234-200502)

2方法

2.1细胞复苏及传代

从液氮罐中取出实体瘤细胞株S180冻存管，迅速放入37℃水中，并不时的摇动。待冻存细胞母液解冻后，用酒精棉擦拭冻存管盖的边缘。取注射器将解冻了细胞液腹腔注射入ICR小鼠腹腔中，于室温25±5℃，湿度60±10％，自然光照，自由摄食、水。一周左右后用注射器吸取ICR小鼠腹腔中的腹水，按0.5ml/只注于新的ICR小鼠腹腔中传代，待用。

2.2 ICR小鼠适应性饲养

ICRⅡ级小鼠，重约18-22g。饲养条件：室温25±5℃，湿度60±10％，自然光照，自由摄食水，所有小鼠于饲养环境中适应性饲养四天，实验前禁食12h，自由摄食水。

2.3实体瘤细胞S180的活体接种

将实验用器械放于洁净台中，开紫外灯，灭菌30min左右。将已接有腹水的小鼠(一周左右)脱颈处死，用酒精棉擦拭小鼠腹部。选取20ml的注射器抽取小鼠体内的腹水(已乳白色为佳)，抽取的腹水置于无菌小瓶后，将小瓶放于装有冰块的小盒中。吸取一定量的腹水于计数板上，置于显微镜下计数，细胞数以10⁷为基数进行肿瘤的接种(1:2)与传代(1:5)。

取已适应性饲养的ICRⅡ级雄性小鼠，用酒精棉擦拭小鼠右前肢腋下部位。取已经稀释好的小鼠腹水细胞(10⁷个)悬液按0.2ml/只，接种于小鼠右前肢腋腔中。接瘤后的小鼠，自由摄食、水。一小时后灌胃给药。

2.4小鼠接瘤后体内抗肿瘤实验

ICRⅡ级小鼠168只，体重18-22g，雄性。实验前于2.2的条件下适应性饲养四天。四天后，称量体重，测自主。随机将ICR小鼠分成14组，即：空白组，模型组，阳性药物对照组，有效部位5，有效部位10，有效部位20，甲酯2.5，甲酯5，甲酯10，甲酯20，山奈酚2.5，山奈酚5，山奈酚10，山奈酚20。每组小鼠12只。按照2.3的方法给每只小鼠接种S180肿瘤小鼠，接种后灌胃给药。

精密称取适量受试样品，以体积百分比5％的乙醇水溶液为溶剂，配制所需浓度的受试样品溶液，即：有效部位5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg，上述分别对应有效部位5，有效部位10，有效部位20的小组的受试样品溶液；E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯依次为2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg，上述分别对应甲酯2.5，甲酯5，甲酯10，甲酯20的小组的受试样品溶液；山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半乳糖依次为2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg，上述分别对应山奈酚2.5，山奈酚5，山奈酚10，山奈酚20的小组的受试样品溶液。精密称取适量的环磷酰胺阳性药物，以体积百分比5％的乙醇水溶液为溶剂，配制所需浓度的溶液，即：20mg/kg。其中空白组给予体积百分比5％的乙醇水溶液，阳性药物对照组给予环磷酰胺溶液，其它组对应药物及剂量给药。每只小鼠按0.2ml/10g的剂量灌胃给药，给药期间小鼠按照3g/只喂食，自由摄食水。连续给药9天，第10天断头处死所有小鼠，收集小鼠血液，肿瘤，肝脏，脾脏，和胸腺。其中取得的血液置于低温环境下，外送测血相；记录下肿瘤、肝脏、脾脏、胸腺的重量及肿瘤的体积大小。

2.5 E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯与其代谢产物对香豆酸体内抗肿瘤实验

ICRⅡ级小鼠30只，体重18-22g，雄性。实验前于2.2的条件下适应性饲养四天。四天后，称量体重，测自主。随机将ICR小鼠分成3组，即：模型组，甲酯10，对香豆酸10。每组小鼠10只。按照2.3的方法给每只小鼠接种S180肿瘤小鼠，接种后灌胃给药。

精密称取适量受试样品，以体积百分比5％的乙醇水溶液为溶剂，配制所需浓度的受试样品溶液，即：E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯10mg/kg；对香豆酸10mg/kg。精密称取适量的环磷酰胺阳性药物，以体积百分比5％的乙醇水溶液为溶剂，配制所需浓度的溶液，即：20mg/kg。其中空白组给予溶剂，阳性药物对照组给予环磷酰胺溶液，其它组对应药物及剂量给药。每只小鼠按0.2ml/10g的剂量灌胃给药，给药期间小鼠按照3g/只喂食，自由摄食水。连续给药9天，第10天断头处死所有小鼠，收集小鼠血液，肿瘤，肝脏，脾脏，胸腺。其中取得的血液置于低温环境下，外送测血相；记录下肿瘤、肝脏、脾脏、胸腺的重量及肿瘤的重量大小。

2.6数据处理

记录下的结果均采用均数加减标准差来表示，数据用统计软件SPSS 11.5software进行数据分析。

3结果

3.1小鼠接瘤后体内抗肿瘤实验结果

由表5结果可知，和模型组相比，阳性对照组，有效部位组，甲酯组，山奈酚组都有明显的抗肿瘤活性。其中，阳性对照组(20mg/kg)达到了57.19％。甲酯组和山奈酚组的剂量为5mg/kg时的抑制率也达到了40％以上，其中甲酯剂量为5mg/kg时的抑制率为三种受试药中最高，达到了48.97％。而山奈剂量为5mg/kg时的抑制率也达到了45.96％。同时在实验中找到了剂量与抑制率的线性关系，三种受试药抑制率均随剂量的增长而增长，但达到一定剂量后(及最好剂量)抑制率反而随剂量的增长而减小。可见，有效部位的最好剂量是10mg/kg,甲酯的最好剂量是5mg/kg,山奈酚的最好剂量是5mg/kg。同时在实验中，比较了三组最好剂量组，正常组，模型组，阳性对照组的脾重，胸腺重，血液中的白细胞数量，以及淋巴细胞重量。脾重比较结果如图5中所示，除阳性对照组以外，有效部位剂量10mg/kg，甲酯剂量5mg/kg，山奈酚剂量5mg/kg的小鼠脾脏相对重量与模型组相比均有提高。山奈酚5mg/kg为最高，阳性对照组降低。胸腺重量比较结果如图6所示，阳性对照组，甲酯剂量5mg/kg，山奈酚剂量5mg/kg的胸腺相对重量与模型组比较均有提高，且阳性对照组数值最大，有效部位剂量10mg/kg的胸腺相对重量较模型组有所降低。白细胞数量比较结果如图7所示，与模型组相对照，阳性对照组和山奈酚剂量5mg/kg时的白细胞数量明显下降，而有效部位剂量10mg/kg和甲酯剂量5mg/kg的白细胞数量有明显的升高。淋巴细胞百分比如图8所示，与模型组相比较，阳性对照，有效部位10，甲酯5和山奈酚5均有提高，但甲酯剂量为5mg/kg时的淋巴细胞百分比提高的最明显，也远远高出所有的组别。

表5各组别抑制率

阳性对照：环磷酰胺

^a相对肿瘤重量均值＝∑相对肿瘤重量/荷瘤小鼠个数

相对肿瘤重量＝肿瘤实际重量/荷瘤小鼠体重

统计结果均用平均数±标准差给药组与模型组的显著性差异表示^*P<0.05。

3.2 E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯与其代谢产物对香豆酸体内抗肿瘤实验

由表6可知，与模型组相比较，对香豆酸10mg/kg的剂量组抑制率只有17.20％，无明显的抗肿瘤活性，而甲酯10mg/kg的剂量组的抑制率为36.59％，有明显的抗肿瘤活性。

表6反式对香豆酸鸡屎藤苷甲酯与对香豆酸抗肿瘤活性对照

^a相对肿瘤重量均值＝∑相对肿瘤重量/荷瘤小鼠个数

相对肿瘤重量＝肿瘤实际重量/荷瘤小鼠体重

统计结果均用平均数±标准差

给药组与模型组的显著性差异表示^*P<0.05。

4小结与讨论

本实验例研究白花蛇舌草中分离纯化的E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯和山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半乳糖的体内抗肿瘤活性，阳性药物选用环磷酰胺，与模型组相比较，阳性对照组剂量为20mg/kg时的抑制率达到了60％左右，可见模型建立成功，且正常老鼠发育良好。在实验模型成立的条件下，与模型组对照，可以得出有效部位，甲酯和山奈酚三种药给药剂量与抑制率之间的联系，即一定剂量内，给药剂量越大抑制率越大，超过一定剂量，给药量增大，抑制率无明显变化，或是稍有减少。这里的一定剂量是指肿瘤抑制的最好剂量。通过上述实验，本发明找到了有效部位的最好剂量是10mg/kg，甲酯的最好剂量是5mg/kg,山奈酚的最好剂量是5mg/kg。并且通过比较得出几组中抑制率最高的是甲酯剂量为5mg/kg，它的抑制率可以达到48.97％，山奈酚的抑制率也达到了45.96％。说明两种物质有很强的抗肿瘤活性。

同时，本实验例对机体免疫组织胸腺和脾脏进行各组别的比较，也比较了白细胞数量，以及淋巴细胞百分比。结果表明，与模型组比较，阳性对照组的抑制率最高，但在在免疫组织中，其相对脾重却比模型组还要低。阳性对照组的白细胞数量和红细胞数量也相对于模型组有所降低，根据阳性对照药的机理，推测环磷酰胺在吞噬肿瘤细胞的同时可能吞噬了正常细胞，导致红细胞和白细胞数量剧减，可推测阳性对照药组小鼠的免疫系统被一定的破坏。而在比较中不管是组织重量还是白细胞，红细胞数量甲酯剂量为5mg/kg的小组都是最高的一组，每项指标都远远超过模型组，可见甲酯在抑制肿瘤的过程中，明显提高了小鼠的免疫功能，得到了较高的抗癌能力。其它两组与模型组比较也都有改善。

因此，甲酯作为白花蛇舌草中含量最多的物质经过体内抗肿瘤活性的研究以及免疫系统考察，充分说明这种物质在剂量达到5mg/kg的时候有很强的抗肿瘤活性且能明显的提高机体免疫能力。山奈酚5mg/kg作为含量较少的黄酮类物质同样有较高的抗肿瘤活性，但是免疫系统提高程度不如甲酯。

同时为研究甲酯的抗癌作用机理，比较了甲酯及其代谢产物对香豆酸的抑制率。结果显示，对香豆酸的抑制率并不明显，而甲酯的抑制率则较高，进而推测出甲酯在作用过程中吸收是很重要的一个过程，对香豆酸由于是酸类物质没有酯类物质甲酯的吸收率高，所以抑制率较低。同时推测甲酯水解后除对香豆酸外的部分对抗癌药物的吸收作用有一定的促进作用。

实验例2

本实验例的目的在于测定黄酮单体(山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半乳糖)和环烯醚萜单体(E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯)在不同比例下对人肝癌细胞Hep-G2细胞的抑制率。

1材料和试剂

1.1实验药品

E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯(以下简称为甲酯)：实施例1步骤(3)制备得到，经纯化，纯度检测的纯度为98％以上；

山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半乳糖(以下简称为山奈酚)：实施例1步骤(3)制备得到，经纯化，纯度检测的纯度为98％以上；

5-氟尿嘧啶

1.2试剂

DMEM粉末：Gibco公司；标准胎牛血清：Gibco公司，批号1739464，规格100mL，储存条件-20℃，密封保存；青霉素/链霉素(双抗)：供应商Gibco公司，批号1780186，规格100mL，储存条件-20℃，密封保存；胰蛋白酶：供应商Amresco公司，批号1742078，规格100mL，储存条件-20℃，密封保存；DMSO(质谱级)：供应商默克股份有限公司，批号19947199813，规格250mL，储存条件遮光、密闭，在阴凉处保存；PBS缓冲溶液：供应商Gibco公司，批号2098597，规格500mL，储存条件4℃，密封保存；0.4％台盼蓝染液：供应商Invitrogen公司，批号1189952，规格1mL，储存条件遮光、密闭，在阴凉处保存；5-氟尿嘧啶，规格100g，储存条件遮光、密闭，在阴凉处保存；CCK-8，规格5mL，储存条件遮光、密闭，4℃保存。

1.3受试肿瘤细胞株

人肝癌细胞Hep-G2为市售产品。

1.4实验仪器

酶标仪：供应商Thermso Scientific Cellomics；CO₂培养箱：供应商Thermo，产品型号311；生物安全柜：供应商NSF，产品型号1389-A2；生物显微镜：供应商OLYMPUS 1，产品型号X71；全自动细胞计数仪：供应商Invitrogen；立式压力蒸汽灭菌器：产品型号SN510C。

2.实验方法

2.1细胞复苏

从液氮罐中取出肝癌细胞Hep-G2的冻存管后，将其迅速置于38～39℃水浴中，不断摇动冻存管，使其在一分钟内完全解冻，800r/min离心9min，冻存管外部喷洒75％酒精后将其放入超净台内，吸取上清液弃去，加入1ml DMEM完全培养基，吹打均匀后，转移细胞至25ml培养皿，再加入6～8ml DMEM完全培养基，轻轻吹打均匀，放入37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养。

2.2细胞传代

吸出2.1中的原有旧培养基，加入2ml PBS缓冲液，轻轻晃动培养瓶洗涤细胞后，吸出PBS缓冲液，除去贴壁疏松、死亡和衰老的细胞及其代谢废物，洗涤2～3次；加入2ml胰蛋白酶，轻轻晃动培养皿30s，吸出胰蛋白酶后，将培养皿放入培养箱充分消化3min，加入2ml新鲜DMEM完全培养基，轻轻吹打细胞，使其在显微镜下观察分散成单个细胞，再加入6～8ml新鲜DMEM完全培养基，放入恒温培养箱中培养。

2.3细胞铺板

将2.2中培养的处于对数生长期的细胞，加入2mL胰蛋白酶，消化30s，吸出胰蛋白酶后，将培养皿放入培养箱充分消化3min，加入2mL新鲜培养基，轻轻吹打细胞，使其在显微镜下观察分散成单个细胞。取10μL细胞悬液及10μL的0.4％台盼蓝染液，混匀，使细胞充分染色后，取10μL染色后细胞悬液加入到细胞计数板，用全自动细胞计数仪统计细胞数量。用DMEM完全培养基稀释细胞悬液浓度至2×10⁵个/mL，用排枪吸取100μL细胞悬液，接种到96孔板中，在37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养24h。

2.4药物配置

准确量取DMEM完全培养基30mL，加入30μL DMSO，混匀，制成0.1％DMSO的培养基。分别精确称取甲酯15mg、山奈酚15mg以及5-氟尿嘧啶5mg于10mL一次性含盖离心管中，分别加入5mL 0.1％DMSO的培养基于离心管，混匀，制成3mg/mL的甲酯溶液与山奈酚溶液，及1mg/mL的5-氟尿嘧啶溶液(阳性对照)。按照山奈酚：甲酯的1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、5:1、4:1、3:1、2:1的质量比例，分别将上述浓度山奈酚溶液和甲酯溶液混匀，配置成所需比例药液，每份药液400μL。将1mg/mL的5-氟尿嘧啶溶液稀释，使其浓度分别为：800、600、400、200、100、50、25μg/mL，每份药液400μL。

2.5细胞加药

吸出2.3中的96孔板中原有旧培养基，每孔加入100μL PBS缓冲液，除去贴壁疏松、死亡和衰老的细胞及其代谢废物后，吸出PBS缓冲液；每孔加入配置好的药液100μL，平行3孔，同时设置阴性对照，每孔加入等体积的含体积分数0.1％DMSO的DMEM完全培养基，平行3孔，此外设置空白对照为不含细胞的含体积分数0.1％DMSO的DMEM完全培养基，平行3孔，在37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养24h。

2.6抑制率测定

吸出2.5中的96孔板中药液和阴性对照中的含体积分数0.1％DMSO的DMEM完全培养基，每孔加入100μL PBS缓冲液，除去贴壁疏松、死亡和衰老的细胞及其代谢废物并将原有药液洗净，吸出PBS缓冲液，共洗涤2次；每孔加入DMEM培养基100μL，CCK-8染液10μL，震荡摇匀，在37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养3h后，放入酶标仪，在254nm波长下测定96孔板每孔的吸光度。

重复2.3至2.6步骤3次。

2.7抑制率计算

各给药组、空白对照、阴性对照的OD值均用平均值±标准差(X±S)来表示；通过如下所示公式计算药物对人肝癌细胞Hep-G2的抑制率。

3实验结果

3.1阳性对照结果

表7阳性对照结果

3.2第1次测定结果

表8第一次测定结果

3.3第2次测定结果

表9第2次测定结果

3.4第3次测定结果

表10第3次测定结果

4.结果讨论

通过3次测定发现，山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半乳糖与E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯对人肝癌细胞Hep-G2存在抑制效果，且不同比例情况下抑制效果不同。第1次实验中，在山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半乳糖与E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯比例为1:3时抑制率最高为38.23％，1:2与3:1时相对较高，分别为29.78％和28.17％；第2次实验中在山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半乳糖与E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯比例同样为1:4时抑制率最高为42.73％，1:5与3:1时相对较高，分别为41.06％和39.94％；第3次实验中在山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半乳糖与E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯比例同样为1:3时抑制率最高为41.33％，3:1时相对较高为39.78％。3次实验中，第1次和第3次实验，最佳抑制比例均为山奈酚：甲酯＝1:3，但第2次结果不同，为最佳抑制比例均为山奈酚：甲酯＝1:4。但是，三次实验中，山奈酚：甲酯＝3:1时，抑制率均相对较高，且结果稳定。3次实验中，山奈酚：甲酯比例为3:1时的抑制率，均高于各次实验山奈酚-3-O-[2-O-(6-O-E-阿魏酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃半乳糖与E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯的抑制率。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。