榄香素在制备用于治疗溶酶体贮积病的药物中的应用
阅读说明：本技术 榄香素在制备用于治疗溶酶体贮积病的药物中的应用 (Use of elemene in preparing medicine for treating lysosome storage disease ) 是由 李欣然 冯新华 向聪 于 2020-05-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了小分子化合物榄香素在制备用于治疗溶酶体贮积病的药物中的应用。本发明通过对一个天然萃取物的小分子库的筛选,从850种天然小分子中筛选到小分子化合物榄香素能够有效抑制溶酶体贮积病的表型,比如能够抑制溶酶体体积的增加、抑制胆固醇贮积、显著恢复被抑制的溶酶体管成、显著恢复对于重复饥饿的耐受并降低细胞死亡率,从而达到减轻损伤与抑制病情发展的目的。榄香素具有开发为广谱性治疗溶酶体贮积病药物的前景。(The invention discloses an application of a small molecular compound elemene in preparing a medicament for treating lysosomal storage disease. The invention screens a small molecule library of a natural extract, and the small molecule compound elemene screened from 850 natural small molecules can effectively inhibit the phenotype of the lysosome storage disease, such as inhibiting the increase of the volume of lysosome, inhibiting cholesterol storage, remarkably recovering the inhibited lysosome tube, remarkably recovering the tolerance to repeated hunger and reducing the cell death rate, thereby achieving the purposes of reducing injury and inhibiting the disease development. Elemene has the prospect of being developed into a broad-spectrum drug for treating lysosomal storage diseases.)
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及榄香素在制备用于治疗溶酶体贮积病的药物中的应用。
背景技术
溶酶体贮积病(Lysosomal Storage Disease，LSD)是一类由溶酶体相关的单基因突变所导致的遗传性疾病的统称。在人类当中已经发现的溶酶体贮积病大约有50种，每种的发病率平均低于十万分之一，但是其总发病率大约在1/10000至1/5000之间。
LSD的发病原理根据突变基因的不同而不同。突变的基因可以是溶酶体内负责降解的酶，溶酶体膜上负责转运物质的蛋白质，溶酶体膜运输相关的蛋白质，以及负责溶酶体相关蛋白质的翻译后修饰的酶等等。尽管发病机制不同，但是所有的LSD的发病首先伴随着某一样溶酶体相关物质的贮积。LSD根据其原发的贮积物质，一般可以分成以下几大类：
1.脂贮积病，又分为鞘脂贮积，神经节苷脂贮积和脑白质营养不良等；
2.黏多糖贮积病；
3.糖蛋白贮积病；
4.黏脂贮积病。
此外还有糖原贮积病如Pompe Disease，以及胱氨酸贮积病等不属于以上几类的LSD。由于溶酶体本身贮积的物质与溶酶体膜运输及功能的互相复杂影响，以上的各类LSD最终都会导致各类溶酶体相关代谢物的次级贮积，造成类似的代谢物贮积效果。
由于类似的物质堆积，除了与突变基因本身功能直接相关的表型之外，LSD不论在细胞层面还是在人体层面，其主要的病理表型都是相似的。其中，人体层面的表型主要是由长寿的终端分化细胞(主要为神经元与肌纤维)的损伤导致的，包括发育迟缓，肌痉挛，肌动力不足，智力低下，视觉与听觉损伤等。在细胞层面，表型主要包括膨大的溶酶体，各类溶酶体相关代谢产物(胆固醇，鞘磷脂，神经酰胺，各类多糖等)的积累，溶酶体降解和转运的功能下降，溶酶体再生受阻，等等。依据致病突变的严重程度，LSD的表型严重程度也有所不同。但即便是相对温和的突变，也会在少年时期发病并造成通常在三十岁前的死亡，严重的突变则会令患者在婴儿至幼儿期即发病并在几年内死亡。
由于LSD为基因层面上的突变所导致，以目前的生物与医学方面的技术无法做到根治。近年出现的CRISPR基因编辑技术虽然可以在活细胞以及高等动物体内直接进行靶基因序列的精确编辑，但是因为其未解决的脱靶效应与伦理问题，短期内尚无法应用于临床实验及治疗。截止目前，针对LSD的治疗方案主要为减少相关贮积物质的摄入以求减轻表型。此类方案及其耗费患者及家属的精力，且仅适用于原发贮积物质为外界摄入物质或其直接代谢产物。由体内合成的物质贮积所导致的LSD如糖蛋白贮积病，粘多糖贮积病等均无法通过调整摄入物质的方式治疗。
此外，目前有报道的治疗方式也包括基因疗法与蛋白质替代疗法，但均数量稀少。前者的治疗方案是将突变基因的野生型通过病毒包裹输送入患者体内并表达，以替代突变基因执行其功能。后者的治疗方案是将正常的蛋白质合成后注入患者体内直接替代病变蛋白质执行功能。基因疗法受到病毒转染效率以及表达效率的限制，且病毒***染色体的DNA片段可能会导致其他基因的突变，染色体不稳定等问题，容易引发其他疾病及增高癌变风险。蛋白质替代疗法一般仅适用于由于溶酶体内的酶突变所导致的LSD，且由于血脑屏障的存在，对于脑部细胞的效果极差。且蛋白质替代疗法需定期注射合成的蛋白质，代价高昂。
除了上述提到的缺点之外，目前针对LSD的治疗方式均存在另一个局限性，即它们都是针对单一或同一类发病原理的LSD，而无法作为大多数LSD的普适疗法。然而单一的LSD发病率均极低，这导致针对上述治疗方式的进一步优化效率极低且收益极小。
发明内容
基于以上有关LSD的治疗目前所面临的问题，本申请提供了可以广谱治疗LSD并且成本相对低廉的药物。本申请提供了榄香素在制备用于治疗溶酶体贮积病的药物中的应用。
榄香素(Elemicin)的分子结构如式Ⅰ所示。
榄香素目前仍没有药用记录，但是有一些研究表明其可能参与抗氧化，抗菌等过程，但其代谢产物在鼠类实验中也展现一定的毒性。榄香素大量存在于一些食用及药用植物中，包括肉豆蔻，西芹等。
榄香素的毒性研究表明榄香素的毒性主要是通过在肝脏中被代谢成1’-羟基榄香素(1’-hydroxylelemicin)导致的(Wang,Y.K.,et al.,Role of Metabolic Activationin Elemicin-Induced Cellular Toxicity.J Agric Food Chem,2019.67(29):p.8243-8252.)。毒性主要包括对于硬脂酰辅酶A去饱和酶1(Stearoyl-CoA desaturase 1)的抑制(Yang,X.N.,et al.,Metabolic Activation of Elemicin Leads to the Inhibition ofStearoyl-CoA Desaturase 1.Chem Res Toxicol,2019.32(10):p.1965-1976.)，与细胞中的半胱氨酸/N-乙基半胱氨酸的结合(Wang,Y.K.,et al.,Role of Metabolic Activationin Elemicin-Induced Cellular Toxicity.J Agric Food Chem,2019.67(29):p.8243-8252.)，以及一定的与DNA的结合能力(van den Berg,S.J.,et al.,Physiologicallybased kinetic models for the alkenylbenzene elemicin in rat and human andpossible implications for risk assessment.Chem Res Toxicol,2012.25(11):p.2352-67.)。但细胞实验(Wang,Y.K.,et al.,Role of Metabolic Activation inElemicin-Induced Cellular Toxicity.J Agric Food Chem,2019.67(29):p.8243-8252.)以及小鼠实验(van den Berg,S.J.,et al.,Physiologically based kineticmodels for the alkenylbenzene elemicin in rat and human and possibleimplications for risk assessment.Chem Res Toxicol,2012.25(11):p.2352-67.)中，分别能导致细胞活性下降/小鼠肝脏损伤的浓度为>250μM以及2.5mM，均远远高于本申请中所使用的10微摩尔的浓度。
本申请首先提供了榄香素在制备用于治疗溶酶体贮积病的药物中的应用。优选的，所述溶酶体贮积病为：(1)GM2神经节苷脂沉积症(GM2 gangliosidosis)，原发贮积物质为含半乳糖链的糖脂或多糖；(2)法布里氏病(Fabry’s Disease)，原发贮积物质为GM2神经节苷脂；(3)尼曼·皮克C型病(Niemann-Pick type C)，原发贮积物质为胆固醇。
本申请又提供了一种用于治疗溶酶体贮积病的药物，有效成分为榄香素。优选的，所述溶酶体贮积病为：(1)GM2神经节苷脂沉积症，原发贮积物质为含半乳糖链的糖脂或多糖；(2)法布里氏病，原发贮积物质为GM2神经节苷脂；(3)尼曼·皮克C型病，原发贮积物质为胆固醇。
因为LSD独特的发病机理，LSD的主要病理表征具备高度的相似性，在细胞层面均表现为溶酶体内的多种物质的贮积，溶酶体膜运输与再生的受阻，及溶酶体降解功能的下降等。而因溶酶体功能受损及溶酶体贮积所导致的有害物质在神经与肌肉细胞中的积累是导致患者生理功能损伤乃至死亡的主要原因。因此，在目前无法通过基因编辑手段直接根除病因的阶段，可以通过长期抑制细胞层面的病理表型达到减轻损伤与抑制病情发展的目的。
本发明通过对一个天然萃取物的小分子库的筛选，从850种天然小分子中筛选到小分子化合物榄香素能够有效抑制溶酶体贮积病的表型，比如能够抑制溶酶体体积的增加、抑制胆固醇贮积、显著恢复被抑制的溶酶体管成、显著恢复对于重复饥饿的耐受并降低细胞死亡率，从而达到减轻损伤与抑制病情发展的目的。榄香素具有开发为广谱性治疗溶酶体贮积病药物的前景。
附图说明
图1为三种LSD模型细胞系内溶酶体总体积检测结果图，其中A：GLAKO模型，B：HEXAKO模型，C：NPC1KO模型，在野生型(WT)的HeLa细胞以及GLAKO，HEXAKO，NPC1KO的HeLa细胞里以lysotracker标记溶酶体，通过流式细胞仪对细胞内的溶酶体总体积进行定量分析，并对比WT进行正常化。***：p-value<0.001。
图2为三种LSD模型细胞系内溶酶体胆固醇总量检测结果图，其中A：GLAKO模型，B：HEXAKO模型，C：NPC1KO模型，在野生型(WT)的HeLa细胞以及GLAKO，HEXAKO，NPC1KO的HeLa细胞里以filipin对细胞内的胆固醇进行染色(细胞内的胆固醇在溶酶体内聚积)，通过荧光共聚焦照相对溶酶体胆固醇进行定量分析。***：p-value<0.001。
图3为三种LSD模型细胞系内溶酶体管成检测结果图，其中A：GLAKO模型，B：HEXAKO模型，C：NPC1KO模型，对野生型(WT)的HeLa细胞以及GLAKO，HEXAKO，NPC1KO的HeLa细胞进行长时间(6小时)饥饿，通过活细胞成像观察细胞内溶酶体上出现的管状结构(溶酶体管成)数量并定量。溶酶体管成为溶酶体再生所必需的步骤。***：p-value<0.001。
图4为三种LSD模型细胞系对重复饥饿处理下死亡率结果图，其中A：GLAKO模型，B：HEXAKO模型，C：NPC1KO模型，对野生型(WT)的HeLa细胞以及GLAKO，HEXAKO，NPC1KO的HeLa细胞进行重复饥饿(12小时血清饥饿后12小时正常培养基恢复，重复三次)，通过PI染色定量细胞的死亡率。数据显示LSD细胞的死亡率均较野生型细胞显著上升。***：p-value<0.001。
图5为榄香素抑制LSD模型细胞系中溶酶体体积增加的表型检测结果图，***：p-value<0.001。
图6为榄香素抑制LSD模型细胞系中胆固醇贮积的表型检测结果图，***：p-value<0.001。
图7为榄香素恢复LSD模型细胞系中的溶酶体管成检测结果图，**：p-value<0.01，***：p-value<0.001。
图8为榄香素恢复LSD模型细胞系对于重复饥饿的耐受检测结果图，**：p-value<0.01，***：p-value<0.001。
具体实施方式
实施例1：实验所用的三种溶酶体贮积病模型细胞系表型鉴定
为了进行小分子库筛选，在HeLa细胞中通过CRISPR-Cas9系统构建了三种溶酶体贮积病的基因敲除模型细胞系，分别为GLAKO(GLA基因敲除)，HEXAKO(HEXA基因敲除)，以及NPC1KO(NPC1基因敲除)。基因敲除时用于转录成对应gRNA的DNA序列分别为：GLA：GCTCCCCAAAGAGATTCAGA；HEXA：TTTCCCCGCTTTCCTCACCG；NPC1：CTGGACACAGTAGCAGCAGG。其中，GLA的敲除导致两条染色体上该基因的外显子第234bp均出现7bp的碱基丢失造成移码，并通过WB确认了GLA蛋白的表达完全丧失；HEXA的敲除导致两条染色体上该基因的外显子第539bp均出现额外的一个碱基造成移码，并通过WB确认了HEXA蛋白的表达完全丧失；NPC1的敲除导致一条染色体上该基因的外显子第36bp出现1bp碱基丢失，另一条染色体该位点出现额外的一个碱基，均造成移码，并通过WB确认了NPC1蛋白的表达完全丧失。
其中GLA的缺失会导致GM2神经节苷脂沉积症(GM2 gangliosidosis)，HEXA的缺失会导致法布里氏病(Fabry’s Disease)，NPC1的缺失会导致尼曼·皮克C型病(Niemann-Pick type C)(Platt,F.M.,et al.,Lysosomal storage diseases.Nat Rev DisPrimers,2018.4(1):p.27.)。这三种疾病的原发贮积物质完全不同，其中GLA的缺失会导致含半乳糖链的糖脂或多糖的贮积，HEXA的缺失会导致GM2神经节苷脂的贮积，而NPC1的缺失会导致胆固醇的贮积。因此，这三种敲除模型能有效地测试小分子药物对于不同LSD疾病的广谱性。
上文提到，所有的LSD均在细胞层面具有一些相似的表型，包括膨大的溶酶体，溶酶体内物质的贮积，溶酶体功能下降及溶酶体再生受阻等。因此，先鉴定了这三种贮积病模型细胞系的LSD表型。实验结果确认(图1～4)，这三种模型细胞系在测试的项目中均具有显著区别于野生型的病理表型，其表型相似，但程度上略有高低。具体来说，三种细胞系均具有膨大的溶酶体(图1)，均有溶酶体胆固醇贮积(图2)，且溶酶体管成(溶酶体上出现的管状结构，溶酶体再生的指标)均被高度抑制(图3)。与此同时，在严重饥饿的情况下，这三种细胞系的死亡率均较野生型显著上升(图4)。
实施例2：小分子库筛选
通过对一个天然萃取物的小分子库(TargetMol Natural Compound Library,L6000)的筛选，从850种天然小分子中筛选到榄香素(Elemicin)在细胞层面对溶酶体贮积病的表型有明显改善作用的小分子。
具体的筛选过程如下：
通过Lysotracker(Thermo Fisher公司，货号L7528)在WT以及三种溶酶体贮积病模型细胞系中标记溶酶体，以10微摩尔浓度的小分子处理细胞48小时后，以流式细胞仪检测细胞内lysotracker荧光度，以此计算细胞内溶酶体总体积。其中，在三种细胞系中均造成溶酶体总体积下降20％以上，且未对WT细胞造成明显细胞损伤的药物进入第二次筛选。第二次筛选中，以10微摩尔浓度的小分子处理三种细胞系48小时后，以菲律宾蓝染色细胞内的胆固醇，并通过拍照进行定量分析。最终选取出能在三种细胞系中均造成胆固醇贮积减少20％以上的小分子。
实施例3：榄香素能显著抑制溶酶体贮积病细胞系的表型
在WT，GLAKO，HEXAKO，NPC1KO的Hela细胞中，分别以浓度10微摩尔的榄香素处理48小时，再以lysotracker标记细胞内的溶酶体，并通过活细胞成像拍摄后以ImageJ分析细胞内的lysotracker荧光量以定量溶酶体体积。结果如图5所示：榄香素未影响WT细胞中的溶酶体体积，而抑制了三种LSD细胞系中溶酶体体积的增加。
在WT，GLAKO，HEXAKO，NPC1KO的Hela细胞中，分别以浓度10微摩尔的榄香素处理48小时，再以菲律宾蓝标记细胞内的胆固醇，并通过活细胞成像拍摄后以ImageJ分析细胞内的菲律宾蓝荧光量以定量胆固醇的贮积。结果如图6所示：榄香素未影响WT细胞中的胆固醇量，而抑制了三种LSD细胞系中的胆固醇贮积。
溶酶体管成现象是溶酶体的应激反应，在溶酶体被大量消耗或功能低下的情况下被激活以进行溶酶体的再生。Lamp1是溶酶体的膜蛋白，是公认的溶酶体膜标记物。在WT，GLAKO，HEXAKO，NPC1KO的Hela细胞中，转染溶酶体的膜蛋白Lamp1-mCherry以标记可能出现的溶酶体管状结构，然后分别以浓度10微摩尔的榄香素处理48小时，再以血清饥饿处理6小时后，通过活细胞成像拍摄细胞内的溶酶体管成并定量。结果如图7所示：榄香素未影响WT细胞中的溶酶体管成，而显著恢复了在三种LSD细胞系中被抑制的溶酶体管成。
在WT，GLAKO，HEXAKO，NPC1KO的Hela细胞中，分别以浓度10微摩尔的榄香素处理72小时，在过程中重复三次12小时血清饥饿-12小时正常培养基的饥饿处理，随后以PI(碘化丙啶)标记死亡细胞，然后通过活细胞成像拍摄并定量细胞死亡率。结果如图8所示：在WT细胞中不显著地增加了对于重复饥饿的耐受度，在三种LSD细胞中则显著恢复了其对于重复饥饿的耐受，显著降低了LSD模型细胞系的死亡率。
上述数据显示，榄香素能有效抑制溶酶体贮积病的表型。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 榄香素在制备用于治疗溶酶体贮积病的药物中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctccccaaa gagattcaga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tttccccgct ttcctcaccg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctggacacag tagcagcagg 20