阅读说明：本技术 肉豆蔻木脂素在治疗弓形虫病中的应用 (Application of myristolignan in treating toxoplasmosis ) 是由 张吉丽 张继瑜 司鸿飞 李冰 周绪正 程富胜 于 2019-08-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了肉豆蔻木脂素在治疗弓形虫病中的应用。当培养基中加入肉豆蔻木脂素后加入弓形虫速殖子孵育2h,弃去药物培养基继续培养24h,肉豆蔻木脂素的浓度高于60μg/mL时,可以完全抑制虫体的入侵并呈剂量依赖。当肉豆蔻木脂素的浓度的升高,处理孔内的包囊数,速殖子数,和纳虫囊泡内的平均虫体数均降低呈剂量依赖。肉豆蔻木脂素对弓形虫速殖子的半数抑制浓度IC<Sub>50</Sub>值为31.32μg/mL。肉豆蔻木脂素可以抑制弓形虫速殖子的入侵和胞内复制,保护弓形虫急性感染的小鼠,超微结构观察显示,肉豆蔻木脂素对弓形虫的抑制作用与线粒体有关。本发明表明肉豆蔻木脂素细胞毒性小,可以安全有效的治疗弓形虫病。(The invention discloses application of macelignan in treating toxoplasmosis. Adding myristyl lignanoid into the culture medium, adding toxoplasma tachyzoite, incubating for 2h, removing the medicinal culture medium, and culturing for 24h, wherein the myristyl lignanoid has a concentration higher than 60 μ g/mL, and can completely inhibit invasion of insect body and show dose dependence. The number of cysts, tachyzoites, and average worm size in naematococcus decreased dose-dependently as the concentration of myristolignan increased. Median inhibitory concentration IC of myristolignan on Toxoplasma gondii tachyzoites 50 The value was 31.32. mu.g/mL. Myristica fragrans lignan can inhibit invasion and intracellular replication of Toxoplasma gondii tachyzoite and protect mice acutely infected by Toxoplasma gondii, and ultrastructural observation shows that the inhibitory effect of myristolignan on Toxoplasma gondii is related to mitochondria. The invention shows that the myristyl lignanoid has low cytotoxicity and can safely and effectively treat toxoplasmosis.)

肉豆蔻木脂素在治疗弓形虫病中的应用

技术领域

本发明涉及肉豆蔻木脂素在治疗弓形虫病中的应用。

背景技术

弓形虫是专性胞内寄生原虫，隶属于顶复门(Apicomplexa)孢子虫纲(Sporozoasida)球虫亚纲(Coccidiasina)真球虫目(Eucoccidiorida)艾美耳亚目(Eimeriina)弓形虫科(Toxoplasmatidae)弓形虫属(Toxoplasma)，弓形虫属下只有一个种，为刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)常称其为弓形虫。

免疫系统正常的个体来说，患弓形虫病临床表现一般为无症状，而在免疫缺陷患者中就可能会危及生命。在这些免疫缺陷患者中，弓形虫病几乎都是反复发作的。弓形虫病的典型的临床表现为：单纯性的颈部或枕部***肿大。而弓形虫感染引起的视网膜脉络膜炎经常呈现覆膜的白色病灶和强烈的玻璃体炎症反应。中枢神经系统是受感染最典型和最严重的部位。弓形虫感染引起中枢神经系统受损，造成脑炎，临床表现包括精神状态改变、癫痫发作、局部运动障碍、颅神经紊乱、感觉异常、小脑症候、运动障碍和神经精神病的症状。免疫功能低下的弓形虫病患者也会发生脉络膜视网膜炎、肺炎，常表现为急性呼吸衰竭和类似感染性休克的血液动力学异常。在骨髓移植患者和艾滋病患者中，弓形虫肺炎似乎更为常见。胎儿先天性弓形虫病临床表现为脑积水、小头畸形、颅内钙化、脉络膜视网膜炎、斜视、失明、癫痫、智力障碍、血小板减少引起的出血和贫血等。

临床治疗通常用乙胺嘧啶、磺胺嘧啶和叶酸的联合应用治疗弓形虫感染，但治疗常常伴有副作用，且治疗不彻底，易复发。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中治疗弓形虫感染，治疗常常伴有副作用，且治疗不彻底，易复发的缺陷，提供一种肉豆蔻木脂素在治疗弓形虫病中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

肉豆蔻木脂素对人***成纤维细胞的半数抑制浓度为：100μg/mL。

为考察肉豆蔻木脂素对弓形虫速殖子入侵HFF细胞的影响，在培养基中加入肉豆蔻木脂素后加入弓形虫速殖子孵育2h，弃去药物培养基继续培养24h，用Giemsa染色观察肉豆蔻木脂素对弓形虫入侵宿主细胞的影响，试验结果显示甘草查尔酮的浓度高于60μg/mL时，可以完全抑制虫体的入侵并呈剂量依赖。

为确定肉豆蔻木脂素的抗虫体增殖效果和准确测定对虫体增殖的IC₅₀，首先，建立了用荧光定量PCR仪评价虫体荷载量的方法，并采用此方法对不同浓度的肉豆蔻木脂素作用下的虫体荷载量进行测定，计算肉豆蔻木脂素对弓形虫的IC₅₀。同时，用Giemsa染色法观察不同浓度的肉豆蔻木脂素对弓形虫增殖的影响。结果显示，建立的评价虫体荷载量的荧光定量PCR的方法精密度和回收率的RSD值均小于5。Giemsa染色表明：随着肉豆蔻木脂素的浓度的升高，处理孔内的包囊数，速殖子数，和纳虫囊泡内的平均虫体数均降低呈剂量依赖。用荧光定量PCR测定在各个肉豆蔻木脂素浓度下的虫体荷载量，结果与Giemsa 染色结果一致，并且通过计算得出，肉豆蔻木脂素对弓形虫速殖子的半数抑制浓度IC₅₀值为31.32μg/mL。

为探究肉豆蔻木脂素抑制虫体增殖的机制，采用扫描电镜和透射电镜观察肉豆蔻木脂素对弓形虫的超微结构的影响，随后采用罗丹明123染色，用激光共聚焦显微镜观察线粒体膜电位变化，并用荧光酶标仪对荧光强度进行测定。扫描电镜显示：不同浓度处理后弓形虫速殖子变小变圆，表面丧失。透射电镜结果显示：药物处理下，速殖子内部出现线粒体肿大，并且随着时间的延长，各个细胞器的膜结构消失，最终虫体死亡。罗丹明染色证明了这一现象，可以观察到线粒体膜电位下降的情况，并呈现浓度依赖性。表明肉豆蔻木脂素可能是通过干扰线粒体功能而引起虫体死亡。

在体内，建立体内弓形虫急性感染模型，采用腹腔注射的方式对不同浓度肉豆蔻木脂素的体内抗虫效果进行评价。肉豆蔻木脂素的腹腔注射时剂量为50 mg/kg.bw时，存活率为100％。

本发明所达到的有益效果是：肉豆蔻木脂素可以抑制弓形虫速殖子的入侵和胞内复制，保护弓形虫急性感染的小鼠，超微结构观察显示，肉豆蔻木脂素对弓形虫的抑制作用与脂代谢有关。本发明表明肉豆蔻木脂素细胞毒性小，可以安全有效的治疗弓形虫病。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是肉豆蔻木脂素抗弓形虫胞内增殖情况；

图2是肉豆蔻木脂素影响弓形虫表面结构图；

图3是肉豆蔻木脂素影响弓形虫内部结构图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1不同浓度肉豆蔻木脂素处理后速殖子的增殖情况

感染前一天将HFF接种于6孔板种，接种量为1×10⁵个/孔，第二天细胞基本长满80％时，接种速殖子，接种量为1×10⁵个/孔，放入培养箱培养6h，弃去培养基，用PBS清洗2遍去除未感染的虫体，加入不同浓度的肉豆蔻木脂素培养基(20、30、40、50、60)，阳性药物选用阿奇霉素(8.6μg/mL)和磺胺嘧啶(0.4μg/mL)，阴性对照组只加感染培养基，孵育24h，孵育期间每隔12h观察一次虫体的生长状况和细胞的状态，24h后取出用4％的中性多聚甲醛固定10min，PBS清洗两遍，Giemsa染色，镜下拍照观察。

实施例2：荧光定量PCR测定不同浓度肉豆蔻木脂素处理后虫体荷载量。

为评价不同药物、不同浓度下的虫体荷载量，进行此次试验。感染前一天将HFF接种于6孔板种，接种量为1×10⁵个/孔，次日细胞基本长满80％时，接种弓形虫速殖子，接种量为1×10⁵个/孔，放入CO₂培养箱培养6h，弃去培养基，用PBS清洗2遍去除未感染的虫体，加入不同浓度的肉豆蔻木脂素培养基(20、30、40、50、60)，阳性药物选用阿奇霉素(8.6μg/mL)和磺胺嘧啶 (0.4μg/mL)，阴性对照组只加感染培养基，每个做三个重复，孵育24h，弃去培养基，PBS清洗两遍，进行总DNA的提取和相对表达量的测定，并换算各个样本(T样)和阴性对照(T阴)的虫体荷载量。计算各个浓度下的增殖率并做图，用抑制率做Probit回归分析，找到抑制率为50％时所对应的浓度。增殖率＝T样/T阴×100％，抑制率＝1-(T样/T阴)。

实施例3：透射电镜观察肉豆蔻木脂素对弓形虫内部超微结构的影响:

(1)收集细胞样品

感染前一天在T₁₅₀培养瓶中接种HFF细胞，接种量为2×10⁶个/孔，次日，细胞基本长满80％时，接种速殖子，接种量为1×10⁶个/孔，放入培养箱培养 12h，弃去培养基，用PBS清洗2遍去除未感染的虫体，加入4μg/mL肉豆蔻木脂素培养基，继续培养2h、4h、8h和16h，孵育结束后，取出弃去药物培养基，用PBS清洗两遍，用TrypLEExpress消化3min，用培养基终止消化，用PBS将感染的细胞清洗两次，最终分别将每个时间点的感染细胞团块收集到1.5mL离心管中(避免其紧贴离心管壁)，加入2.5％的戊二醛(0.01mol/L PBS，PH7.4)4℃固定。

(2)透射电子显微镜样品制备

前固定24h后(如不能快速进行下一步，可4℃密封保存一个月左右)，用PBS反复清洗，直至将固定液冲洗完全(5次以上)。用1％锇酸(0.01mol/L PBS，PH7.4)进行后固定，固定时间为2h(避光)。PBS清洗3次每次10min，再用梯度酒精进行脱水，浓度梯度分别为30％、50％、70％、80％、90％、95％和100％ (3次)每次10min，最后用无水丙酮置换酒精。将样品用包埋剂Epon812和丙酮的1:2混合液于35℃温箱浸透过夜。将样品埋入包埋板中，并做好标记一同埋入包埋板。将包埋样品置于温箱，逐级升高温度聚合硬化(37℃，12h；45℃，12h；60℃，48h)。

将组织修成四面椎体，暴露出样品，并将样品表面修整平滑。用制刀机制作玻璃刀，安装在LeicaUC6型超薄切片机对样本进行超薄切片，用200目铜网进行捞片，晾干后用2％醋酸双氧铀染色30min，取出迅速用双蒸水清洗，清洗后用柠檬酸铅染色15min。最后用日立H-7500透射电子显微镜进行观察，工作电压80kv。

图1是本发明肉豆蔻木脂素抗弓形虫胞内增殖情况，HFF感染6h后，用肉豆蔻木脂素(20、30、40、50、60)或阿奇霉素、磺胺嘧啶处理24h，qPCR 测定各个处理组的虫体荷载量，计算虫体抑制率。结果用平均值±标准差来表示，*表示差异极显著(P≤0.01)。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。