寡核苷酸构建体及其用途

文档序号：1191680 发布日期：2020-08-28 浏览：17次 >En<

阅读说明：本技术 寡核苷酸构建体及其用途 (Oligonucleotide constructs and uses thereof ) 是由 S.格里亚佐夫 L.贝格曼 T.云于 2018-11-02 设计创作，主要内容包括：本公开描述了基于寡聚脱氧核苷酸的免疫刺激性Toll样受体9(TLR9)激动剂。还描述了包含TLR9激动剂的组合物,制备TLR9激动剂的方法,以及使用TLR9激动剂治疗免疫疾病、障碍或病症,诸如病毒感染或癌症的方法。(The present disclosure describes oligodeoxynucleotide-based immunostimulatory Toll-like receptor 9(TLR9) agonists. Also described are compositions comprising a TLR9 agonist, methods of making a TLR9 agonist, and methods of using a TLR9 agonist to treat an immune disease, disorder, or condition, such as a viral infection or cancer.)

寡核苷酸构建体及其用途

相关申请的交叉引用

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本专利申请含有序列表，该序列表以电子方式通过EFS-Web作为ASCII格式化序列表提交，文件名为“688097_119U1 Sequence Listing”，创建日期为2018年10月31日，并且大小为11.3KB。通过EFS-Web提交的该序列表是本说明书的一部分并且全文以引用方式并入本文。

技术领域

本公开涉及寡核苷酸构建体，包含寡核苷酸构建体的组合物，以及制备寡核苷酸构建体的方法。寡核苷酸构建体可充当免疫调节分子，特别是充当Toll样受体9(TLR9)激动剂。因此，本公开还涉及将寡核苷酸构建体作为TLR9激动剂单独地或与其他试剂组合使用以治疗或预防其中TLR9活性的调节将会有益的疾病(诸如免疫疾病、障碍或病症，病毒感染，以及癌症)的方法。

背景技术

Toll样受体(TLR)是一类在先天性免疫应答中发挥关键作用的模式识别受体(PRR)蛋白。TLR识别可不同于宿主分子的来自微生物病原体诸如细菌、真菌、寄生生物和病毒的病原体相关分子模式(PAMP)。TLR是通常以二聚体起作用的跨膜蛋白，并且由参与先天性免疫应答的细胞(包括抗原呈递树突细胞和吞噬巨噬细胞)表达。

存在至少十个人TLR家族成员：TLR1至TLR10，以及至少十二个小鼠TLR家族成员：TLR1至TLR9和TLR11至TLR13，它们识别的抗原类型各不相同。例如，TLR9是由单链或双链DNA(包括病毒DNA)中的非甲基化胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)二核苷酸激活的核苷酸敏感TLR，其中胞嘧啶通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键连接至鸟嘌呤。

TLR的激活导致一系列信号转导事件，从而导致产生I型干扰素(IFNγ)、炎性细胞因子和趋化因子，并且诱导免疫应答。最终，该炎症反应还激活了适应性免疫系统，这随后导致侵入的病原体和受感染的细胞被清除。

TLR9在免疫系统的B细胞和浆细胞样树突细胞中表达。含CpG的DNA与TLR9的结合引发了下游信号级联，导致转录因子NF-κB、MAPK和IRF7的激活，这最终导致诱导出快速炎症反应，其特征在于各种白介素和细胞因子的表达提高(Yamamoto和Takeda,Gastroenterology Research and Practice，第2010卷)。具体地，含CpG激动剂对TLR9的刺激导致IFN-α、TNF-α、IL-6和/或IL-1的产生增加，这取决于CpG的种类。

乙型肝炎病毒(HBV)是引起包括乙型肝炎、纤维变性、硬化症和肝细胞癌在内的疾病的双链DNA(dsDNA)病毒。约20亿人感染有HBV，并且几乎4亿人患有慢性乙型肝炎感染(慢性HBV)，其特征在于持久性病毒和亚病毒颗粒在血液中存在6个月以上(Xu等人,2014,Gastrointest Tumors,1(3):135–145)。慢性HBV目前采用IFN-α和核苷或核苷酸类似物治疗，但由于共价闭环DNA(cccDNA)在受感染的肝细胞中持续存在，尚不存在最终治愈。保留的cccDNA作为病毒RNA和新病毒体的模板发挥着持续作用。据认为通过使用合成CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)刺激B细胞上的TLR9信号转导途径来诱导病毒特异性B细胞应答能够有效地消除携带cccDNA的肝细胞(Isogawa等人,2005,J.Virology 79(11)7269-7272)。

大量证据表明免疫疗法是用于治疗多种类型癌症的可行且有效的方法。靶向Toll样受体的配体及其他先天识别途径代表了调节先天免疫以产生抗肿瘤免疫的有效策略。目前正在探索TLR激动剂在抗癌疗法中作为疫苗佐剂来激活免疫细胞和促进炎症的能力(参见例如Kaczanowska等人,J Leukoc Biol.2013年6月；93(6):847–863及其中的参考文献)。例如，据报道除延长CD4⁺T细胞存活和抑制T_Reg活性之外，TLR9配体还通过增加IL-2产生和IL-2R表达来增加CD4⁺和CD8⁺T细胞数(同上，及其中的参考文献)。CpG-ODN对神经母细胞瘤细胞系上TLR9的刺激已示出减少了细胞增殖并且增加了半胱天冬酶依赖性细胞凋亡，从而导致携带肿瘤的小鼠的存活增加(同上)。然而，还报道了肿瘤细胞上TLR的接合可以通过对维持慢性炎症环境，诱导癌细胞增殖和促进细胞存活作出贡献来促进肿瘤生长。例如，据报道表达TLR9的人乳腺癌和胃癌细胞由于在组织培养中TLR9刺激后MMP13和COX-2的分泌增加而具有增强的侵袭能力，而在神经胶质瘤的情况下，尽管TLR9有诱导癌细胞转移的特性，但其对细胞增殖没有影响，这强调了TLR9信号转导可能对不同的肿瘤细胞类型具有不同的影响(同上)。

用于促进治疗性寡核苷酸的体内递送的策略包括寡核苷酸的化学修饰、脂质纳米载体的使用、将寡核苷酸与受体靶向剂连接，以及使用小分子增强寡核苷酸的有效性。然而，纳米粒子递送体系可能具有有限的治疗应用范围，这是由于它们不能进入大多数组织和潜在的毒性问题。此外，与反义或siRNA不同，含CpG寡核苷酸的激动剂通过直接结合至TLR9而起作用。当设计含CpG寡核苷酸的激动剂与递送分子诸如胆固醇的缀合物时，必须避免空间位阻。

因此，仍然需要能够有效治疗或预防其中TLR9活性的调节将会有益的疾病诸如慢性HBV感染和癌症的有效治疗剂。

发明内容

本公开通过如下方式满足了对能够有效地治疗或预防其中TLR9活性的调节将会有益的疾病的有效治疗剂的需求：提供基于寡聚脱氧核苷酸(ODN)的构建体，该构建体通过结合并刺激TLR9来刺激免疫应答。本公开还涉及这些ODN构建体单独地或与其他试剂联合用于治疗或预防其中TLR9活性的调节将会有益的疾病，诸如免疫疾病、障碍或病症(包括病毒感染或癌症)的用途。

本公开的ODN构建体包含通过接头缀合至脂质部分的CpG寡聚脱氧核苷酸。

ODN构建体的设计包括例如胞嘧啶-鸟嘌呤(CpG)基序及其核苷酸间键的数量和定位，以及脂质部分的结构和定位，以及接头的存在与否。脂质部分可包括缀合至ODN构建体的脂质分子，诸如胆固醇和生育酚。此外，ODN构建体在寡核苷酸的一个或多个CpG基序之内包含磷酸二酯核苷酸间键。

根据本公开的实施方案ODN构建体已经示出作为TLR9激动剂实现了意料不到水平的增强的生物利用率和功效。尽管不受任何具体理论的束缚，增强的TLR9激动活性可通过如下方式有效地减少或消除携带HBV cccDNA的肝细胞：刺激潜伏性病毒的再表达，同时刺激免疫系统以识别病毒产物。具体地，免疫系统不识别处于其潜伏状态的HBV病毒，并且由所公开的ODN构建体诱导的低水平炎症可促使病毒从该潜伏态显现。随后，所得HBV的再表达以及新形成的病毒表达产物的形成由激活的免疫系统识别，以控制循环病毒并杀死受感染细胞，从而有效地消除携带HBV cccDNA的肝细胞。

根据本公开的实施方案的所公开的ODN构建体也可用于***，优选地癌症，诸如结肠直肠癌。所公开的CpG ODN构建体在体内诱导针对肿瘤细胞的免疫并且提高携带肿瘤的小鼠的存活率。

在一个总的方面，本公开涉及具有脂质部分的CpG ODN构建体，该脂质部分通过接头连接至CpG ODN。在一个实施方案中，CpG ODN构建体具有下式：

式I：5’M₁-L₁-[CpG ODN]-L₂-M₂3’，

其中：

M₁和M₂中的每者独立地表示脂质部分，优选地脂质部分包括选自胆固醇、生育酚、棕榈酰基和硬脂酰基中的至少一种，任选地M₁和M₂中的一者不存在；

L₁和L₂中的每者独立地表示接头，优选地所述接头包含至少10个选自碳、氮、氧、氢、硫和磷的原子，并且L经由可裂解键，优选地经由酯或酰胺键共价连接至CpG ODN，任选地当相应的M₁或M₂不存在时，L₁和L₂之一不存在；并且

优选地，CpG ODN包含至少一个具有磷酸二酯(po)核苷酸间键的CpG基序；

任选地，式(I)的CpG ODN构建体进一步共价缀合至靶向部分，所述靶向部分优选地选自半乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、岩藻糖、甘露糖、唾液酸、N-乙酰神经氨酸。

在一个实施方案中，本公开涉及具有下式的CpG ODN构建体：

式(IIa)：5’M-L-[CpG ODN]3’，或

式(IIb)：5’[CpG ODN]-L-M 3’

其中：

M表示脂质部分，优选地脂质部分包括选自胆固醇、生育酚、棕榈酰基和硬脂酰基中的至少一种；

L表示包含至少10个选自碳、氮、氧、氢、硫和磷的原子的接头，并且L经由可裂解键，优选地经由酯或酰胺键共价连接至所述CpG ODN；并且

CpG ODN包含至少一个具有po核苷酸间键的CpG基序，优选地包含至少两个、三个或四个各自具有所述po核苷酸间键的CpG基序；

任选地，式(IIa)或(IIb)的CpG ODN构建体进一步共价缀合至靶向部分，所述靶向部分优选地选自半乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、岩藻糖、甘露糖、唾液酸、N-乙酰神经氨酸。

在一个实施方案中，式(IIa)或(IIb)中的接头L包括-(((CH₂)₂O)_m-X)_n-，其中m为1至15的整数，X独立地为磷酸二酯(po)或硫代磷酸酯(ps)键，并且n为1至5的整数。

在另一个实施方案中，式(IIa)或(IIb)中的接头L通过磷酸二酯(po)键或硫代磷酸酯(ps)键连接至脂质部分M。

在另一个实施方案中，式(IIa)或(IIb)中的接头L经由磷酸二酯(po)键或氨基磷酸酯键，优选地po键连接至CpG ODN。

在另一方面，本公开涉及具有以下结构的ODN构建体：

式(IIIa)：5’M₁-Y₁-(((CH₂)₂O)_m-X)_n-Y₂-[CpG ODN]-Y₃-M₂3’，或

式(IIIb)：5’M₂-Y₃-[CpG ODN]-Y₂-(((CH₂)₂O)_m-X)_n-Y₁-M₁3’

其中：

M₁表示脂质部分，优选地所述脂质部分包括选自胆固醇、生育酚、棕榈酰基和硬脂酰基中的至少一种，

M₂表示脂质部分、靶向部分，或者不存在，

Y₁为化学键或接头，优选地具有式((CH₂)₂O)_o的乙二醇，其中o为1-15，其经由磷酸二酯(po)键、硫代磷酸酯(ps)键或化学键共价连接至(((CH₂)₂O)_m-X)_n，

X独立地为化学键、po键或ps键，

Y₂和Y₃中的每者独立地为可裂解键，优选地包括酯或酰胺键，更优选地包括po键或氨基磷酸酯键，最优选地po键，前提条件是当M₂不存在时，Y₃不存在，

CpG ODN包含至少一个具有po核苷酸间键的CpG基序，优选地包含至少两个、三个或四个各自具有所述po核苷酸间键的CpG基序；

m为1至15的整数，并且

n为1至5的整数。

在一个实施方案中，本公开涉及具有下式的CpG ODN构建体：

式(IVa)：5’M-Y₁-(((CH₂)₂O)_m-X)_n-Y₂-[CpG ODN]3’，或

式(IVb)：5’[CpG ODN]-Y₂-(((CH₂)₂O)_m-X)_n-Y₁-M 3’

其中：

M表示脂质部分，优选地脂质部分包括选自胆固醇、生育酚、棕榈酰基和硬脂酰基中的至少一种，

Y₁为化学键或接头，优选地具有式((CH₂)₂O)_o的乙二醇，其中o为1-15，其经由磷酸二酯(po)键、硫代磷酸酯(ps)键或化学键共价连接至(((CH₂)₂O)_m-X)_n，

X独立地为化学键、磷酸二酯(po)键或硫代磷酸酯(ps)键，

Y₂为可裂解键，优选地包括酯或酰胺键，更优选地包括po键或氨基磷酸酯键，最优选地po键；

CpG ODN包含至少一个具有po核苷酸间键的CpG基序，优选地包含至少两个、三个或四个各自具有所述po核苷酸间键的CpG基序；

m为1至15的整数，优选地为6；并且

n为1至5的整数，优选地为2；

任选地，式(IVa)或(IVb)的CpG ODN构建体进一步共价缀合至靶向部分，所述靶向部分优选地选自半乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、岩藻糖、甘露糖、唾液酸、N-乙酰神经氨酸。

根据具体实施方案，脂质部分表示胆固醇、生育酚或棕榈酰基。

根据具体实施方案，式(I)至(IVb)中的每者的CpG ODN具有一个或多个硫代磷酸酯(ps)核苷酸间键。根据一个更具体的方面，式(I)中的ODN构建体的所有核苷酸间键均为硫代磷酸酯(ps)键。根据一个具体的方面，ODN构建体中的CpG二核苷酸的C与G之间的核苷酸间键中的至少一种是立体限定的硫代磷酸酯(ps)核苷酸间键。根据一个具体的方面，CpGODN中的CpG二核苷酸的C与G之间的核苷酸间键中的至少一种是磷酸二酯(po)核苷酸间键，并且CpG ODN的剩余核苷酸间键中的每者是硫代磷酸酯(ps)键。根据一个具体的方面，CpGODN具有19至24个核苷酸长度。

在另一个总的方面，本公开涉及一种药物组合物，该药物组合物包含本公开的ODN构建体和药学上可接受的载体。

在另一个总的方面，本公开涉及一种制备本公开的药物组合物的方法，该方法包括使本公开的ODN构建体与药学上可接受的载体组合。

在另一个总的方面，本公开涉及一种在对其有需要的受治疗者中刺激免疫应答的方法，该方法包括向受治疗者施用本公开的药物组合物。

在另一个总的方面，本公开涉及一种在对其有需要的受治疗者中治疗疾病的方法，该方法包括向受治疗者施用本公开的药物组合物。优选地，疾病选自免疫疾病、障碍或病症，诸如病毒感染或癌症。更优选地，疾病是慢性HBV感染或实体瘤癌。

根据以下的公开，包括本公开详细描述和其优选的实施方案以及所附权利要求书，本公开的其他方面、特征和优点将显而易见。

附图说明

在结合附图阅读时，将更好地理解上述发明内容以及以下本公开的

具体实施方式

。应当理解，本公开不限于附图中示出的确切实施方案。

在附图中：

图1示出在不同位置具有磷酸二酯连接的CpG基序的TLR9激动剂对报告细胞系的TLR9激活(通过OD630水平测量)；

图2示出根据本公开的实施方案的ODN构建体对报告细胞系的TLR9激活(通过OD630水平测量)，该ODN构建体包含经可裂解接头缀合至胆固醇的磷酸二酯连接的CpG基序；

图3示出根据本公开的实施方案的ODN构建体对报告细胞系中人(左图)和小鼠(右图)TLR9的激活(归一化为ODN2006)；

图4示出在施用ODN构建体之后4h的根据本公开的实施方案的ODN构建体对小鼠的体内细胞因子诱导(IL-6，左图；TNF-α，中间图；MIP-1β，右图)；

图5示出为了在小鼠中分析根据本公开的实施方案的ODN构建体对HBV感染的影响而实施的示意性实验；

图6示出在用单剂量(左图)或多剂量(右图)的根据本公开的实施方案的ODN构建体处理后小鼠中HBV DNA的水平；

图7示出在用单剂量(左图)或多剂量(右图)的根据本公开的实施方案的ODN构建体处理后小鼠中HBsAg的水平；

图8示出在用单剂量(左图)或多剂量(右图)的本公开的ODN构建体处理后小鼠中HBeAg的水平；

图9示出通过皮下注射本公开的ODN构建体对小鼠的体内细胞因子诱导(IL-12p40，左图；IL-6，中间图；MIP-1β，右图)；

图10示出通过静脉内注射本公开的ODN构建体(称为AG8)对小鼠的体内细胞因子诱导(IL-12p40，左图；IL-6，中间图；MIP-1β，右图)；

图11示出经静脉内(IV)或皮下(SQ)给予HBsAg和ODN构建体的小鼠在第14天的HBsAg特异性IgG的水平；

图12示出根据本公开的实施方案的示例性ODN构建体；

图13A示出在皮下施用AG9即根据本公开的实施方案的ODN构建体后AAV-HBV小鼠中HBsAg、抗HBs抗体和HBVDNA的水平；

图13B示出在静脉内施用AG9后AAV-HBV小鼠中HBsAg、抗HBs抗体和HBV DNA的水平；

图13C示出在静脉内施用AG19即根据本公开的实施方案的ODN构建体后AAV-HBV小鼠中HBsAg、抗HBs抗体和HBV DNA的水平；

图13D示出在施用根据本公开的实施方案的ODN构建体后AAV-HBV小鼠中HBsAg特异性T细胞的水平；

图14示出在携带MC-38肿瘤的小鼠(结肠直肠癌模型)中经瘤内(IT)和静脉内(IV)给予根据本公开的实施方案的ODN构建体的初步功效研究的示意图；

图15示出在静脉内给予递增量的根据本公开的实施方案的ODN构建体之后，植入MC-38结肠癌细胞的首次接受试验的C57BL/6小鼠中的肿瘤体积，具体地，

图15A示出静脉内给予AG1 ODN构建体的小鼠中的肿瘤体积；

图15B示出静脉内给予AG9 ODN构建体的小鼠中的肿瘤体积；并且

图15C示出静脉内给予AG17 ODN构建体的小鼠中的肿瘤体积；

图16示出在携带MC-38肿瘤的小鼠中采用根据本公开的实施方案的ODN构建体的最大耐受剂量(MTD)/功效研究的示意图；

图17示出根据本公开的实施方案的ODN构建体的合成方案；

图18示出从分离自C57BL/6小鼠的小鼠脾细胞纯化并用根据本公开的实施方案的ODN构建体刺激的B细胞中的CD40水平；

图19示出根据本公开的实施方案的ODN构建体对报告细胞系中人TLR9的激活(归一化为ProMune)；

图20示出根据本公开的实施方案的ODN构建体对小鼠TLR9的激活(归一化为ODN1826)；

图21A示出相比于AG20(与AlexaFluor 647缀合的AG1)，向小鼠皮下(SQ)施用AG21(与AlexaFluor-647缀合的AG9)导致小鼠的引流***中的寡核苷酸积聚；

图21B示出相比于AG20，向小鼠静脉内(IV)施用AG21导致小鼠的脾中的寡核苷酸积聚；

图22A示出生育酚可促进CpG ODN与血清蛋白诸如牛血清白蛋白(BSA)结合；

图22B展示CpG ODN缀合至棕榈酰基促进了ODN与胎牛血清(FBS)内血清蛋白的相互作用；并且

图23展示CpG ODN的生育酚缀合赋予了ODN胶束形成特性。

具体实施方式

背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、材料、设备、文章等的讨论旨在为本公开提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均相对于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。

定义

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。否则，本文所用的某些术语具有本说明书中所述的含义。本文引用的所有专利、公布的专利申请和出版物均以引用方式并入本文，如同在本文中进行了充分阐述。应该注意的是，除非上下文清楚地指明，否则本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数引用物。

贯穿本说明书和随后的权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包括”以及诸如“包含”和“含有”的变型形式将被理解为暗示包括所陈述的整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。当在本文使用时，术语“包含”可用术语“含有”或“包括”替代，或者有时在本文使用时用术语“具有”替代。

当在本文使用时，“由……组成”排除权利要求要素中未指定的任何要素、步骤或成分。当在本文使用时，“基本上由……组成”不排除没有实质上影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。每当在本文中用于本发明的一个方面或实施方案的情境时，任何前述术语“包含”、“含有”、“包括”和“具有”均可用术语“由……组成”或“基本上由……组成”替代以改变本公开的范围。

如本文所用，术语“TLR9”或“Toll样受体9”(也称为CD289、UNQ5798或PRO19605)是指通过非甲基化胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)二核苷酸激活的核苷酸敏感TLR。TLR9的示例包括但不限于人TLR9，即由3922个核苷酸长的mRNA转录物(NM_017442.3)编码的1032个氨基酸长的蛋白质。所例示的人TLR9的氨基酸序列以GenBank登录号NP_059138.1表示。如本文所用，术语“TLR9”包括来自人以外的物种，诸如Macaca Fascicularis(食蟹猴)或Pantroglodytes(黑猩猩)的TLR9同源物。如本文所用，术语“TLR9”包括包含全长野生型TLR9的突变，例如点突变、片段、***、缺失和剪接变体的蛋白质。术语“TLR9”还涵盖TLR9氨基酸序列的翻译后修饰。

如本文所用，术语“激动剂”是指结合一个或多个TLR并诱导受体介导的应答的分子。例如，激动剂可诱导、刺激、增大、激活、促进、增强、或上调受体的活性。此类活性称为“激动活性”。例如，TLR9激动剂可以通过结合受体激活或增加细胞信号转导。激动剂包括但不限于核酸、小分子、蛋白质、碳水化合物、脂质或与受体结合或相互作用的任何其他分子。激动剂可以模拟天然受体配体的活性。激动剂可在序列、构象、电荷或其他特征方面与这些天然受体配体同源，使得它们能够被受体识别。这种识别可导致细胞之内的生理和/或生物化学变化，使得细胞以与天然受体配体存在时的相同方式对激动剂的存在作出反应。如本文所用，术语“TLR9激动剂”是指充当TLR9的激动剂的任何化合物。

如本文所用，术语“诱导”和“刺激”及其变型形式是指细胞活性的任何可测量的增大。TLR9介导的细胞活性的诱导可包括例如免疫细胞群的激活、增殖、或成熟；增加细胞因子的产生；和/或提高的免疫功能的另一种指示物。在某些实施方案中，免疫应答的诱导可包括增加B细胞的增殖；产生抗原特异性抗体；增加抗原特异性T细胞的增殖；改善树突细胞抗原呈递；和/或提高某些细胞因子、趋化因子和共刺激标记物的表达。

如本文所用，“脂质部分”是指包含亲脂性结构的部分。脂质部分诸如烷基、脂肪酸、甘油三酯、甘油二酯、甾体化合物、鞘脂、糖脂或磷脂。例如，脂质部分可包括固醇，诸如胆固醇；具有甲基化疏水性侧链的甲基化苯并二氢吡喃醇环，诸如生育酚；或饱和脂肪酸，诸如棕榈酸或其酯。当连接到高度亲水性分子诸如核酸上时，脂质部分可显著地增强血浆蛋白结合，并因此增加亲水性分子的循环半衰期。此外，与某些血浆蛋白(诸如脂蛋白)结合已示出增加了表达对应脂蛋白受体(例如LDL受体、HDL受体或清道夫受体SR-B1)的特定组织的摄取。参见例如Bijsterbosch,M.K.等人(2000)Nucleic Acids Res.28,2717-25；Wolfrum,C.等人(2007)Nat Biotechnol 25:1149–5725。

脂质部分也可与靶向部分组合使用，从而改善靶向递送方法的胞内运输。靶向部分可为与本公开的CpG ODN直接或间接连接的任何合适的部分或配体，其可将ODN构建体引导至体内靶标诸如大分子(例如受体)、细胞(例如巨噬细胞、树突细胞、肝细胞、肿瘤细胞)或它们的组分。因此，靶向部分可包括任何合适的天然存在或合成分子，诸如脂质、脂质酸衍生物、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、岩藻糖、甘露糖、唾液酸、N-乙酰神经氨酸、抗体、脂质体、胶束、树枝状体、纳米微球、纳米胶囊、肽、蛋白质、白蛋白和激素。

如本文所用，术语“接头”是指将核苷酸诸如CpG ODN的5'或3'端核苷酸连接到脂质部分或靶向部分的化学部分。术语“可裂解接头”是指根据需要在某些条件下经历裂解以从核苷酸移除脂质部分或靶向部分而不改变其所连接的核苷酸或核酸分子的接头或其部分。根据键的性质，裂解可例如通过酸或碱处理(例如腙的处理)，通过酶解(例如通过核酸酶或蛋白酶)，通过键的氧化或还原(例如二硫键的氧化或还原)，通过光处理(例如通过光漂白)在体外或体内实现。根据具体实施方案，接头包括任何柔性的可裂解接头。接头包括但不限于例如共价键、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基诸如聚乙二醇(PEG)、一个、两个或三个脱碱基和/或核糖醇基团、乙二醇部分、或肽。根据本公开的实施方案，接头经由可裂解键，诸如磷酸二酯(po)、氨基磷酸酯键(np)或硫代磷酸酯(ps)键，优选地经由酯或酰胺键，诸如po键或np键，最优选地po键共价连接至CpG ODN。根据本公开的实施方案，接头包括经由po、np或ps键共价连接至CpG ODN的具有式((CH₂)₂O)_o的乙二醇，其中o为1-15。

在一个实施方案中，可裂解键诸如po键可通过磷酸二酯酶，例如环核苷酸磷酸二酯酶、磷脂酶C、磷脂酶D、自毒素、鞘磷脂磷酸二酯酶、DNA酶、RNA酶、或限制性内切核酸酶裂解。

根据本公开的实施方案，接头包括((CH₂)₂O)_m，其中m为1至15的整数，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。根据具体实施方案，接头包含一个或多个具有以下分子式的六甘醇(HEG)部分：((CH₂)₂O)₆。

在一个实施方案中，接头包含由一个或多个磷酸二酯(po)或硫代磷酸酯(ps)键连接的一个或多个HEG部分。在一个实施方案中，接头包含经由po键连接至CpG ODN的一个HEG部分。在一个实施方案中，接头包含经po键连接在一起并且经由po键连接至CpG ODN的两个HEG部分。

根据其他实施方案，接头包括可裂解二硫化物基。根据其他实施方案，接头包括蛋白酶可裂解肽，例如包含针对肿瘤微环境特异的蛋白酶(诸如uPA、天冬酰胺肽链内切酶(legumain)、蛋白裂解酶或组织蛋白酶)的裂解位点的肽接头。

根据本发明的实施方案，脂质部分(M)，诸如胆固醇、生育酚、棕榈酰基、或硬脂酰基可通过接头共价连接至CpG ODN。接头可包含一个或多个接头部分，诸如具有式((CH₂)₂O)_m的乙二醇，其中m为1-15。在一些实施方案中，m为6，并且接头部分为六甘醇(HEG)。

根据本发明的实施方案，脂质部分(M)诸如胆固醇、生育酚、棕榈酰基、或硬脂酰基可经由化学键直接地，或经由第二接头诸如包含具有式((CH₂)₂O)_o(其中o为1-15)的乙二醇的接头间接地共价连接至HEG部分。第二接头可经由化学键、磷酸二酯(po)键、氨基磷酸酯键(np)或硫代磷酸酯(ps)键共价连接至HEG。

每个接头部分可以通过键，诸如选自磷酸二酯(po)键、氨基磷酸酯键(np)或硫代磷酸酯(ps)键的键独立地连接至其他接头部分。接头可以通过可裂解键，诸如选自磷酸二酯(po)键、氨基磷酸酯键(np)和硫代磷酸酯(ps)键的可裂解键进一步连接至CpG ODN。在一些实施方案中，接头包含介于脂质部分与CpG ODN之间的一个接头部分。在一些实施方案中，接头包括介于脂质部分与CpG ODN之间的两个接头部分。在一些实施方案中，每个接头部分通过po键连接到至少一个其他接头部分。在一些实施方案中，每个接头部分通过ps键连接到至少一个其他接头部分。在一些实施方案中，每个接头部分通过np键连接到至少一个其他接头部分。在一些实施方案中，接头部分经由第二接头，诸如包含具有式((CH₂)₂O)_o(其中o为1-15)的乙二醇的接头共价地连接至脂质部分，并且第二接头经由化学键、磷酸二酯(po)键、氨基磷酸酯键(np)或硫代磷酸酯(ps)键共价地连接至脂质部分。在一些实施方案中，接头包含在脂质部分与CpG ODN之间经po键连接的两个接头部分。在一些实施方案中，接头包含在脂质部分与CpG ODN之间经ps键连接的两个接头部分。在一些实施方案中，接头包含在脂质部分与CpG ODN之间经np键连接的两个接头部分。

脂质部分(M)可通过化学键或键，诸如选自磷酸二酯(po)键、氨基磷酸酯键(np)或硫代磷酸酯(ps)键的键连接至接头。如本文所用，“M-po(HEG)”或“(HEG)po-M”意指脂质部分M经由磷酸二酯(po)键直接地或经由第二接头，诸如包含具有式((CH₂)₂O)_o(其中o为1-15)的乙二醇的接头间接地共价连接至HEG部分，并且第二接头经由磷酸二酯(po)键共价地连接至HEG部分。例如，如本文所用，“Toco-ps(HEG)”可以指经由第二接头诸如具有式((CH₂)₂O)_o(其中o为1-15)的乙二醇共价地连接至CpG ODN的生育酚基团，该第二接头经由磷酸二酯(po)键共价地连接至HEG部分。

如本文所用，“M-ps(HEG)”或“(HEG)ps-M”意指脂质部分M经由硫代磷酸酯(ps)键直接地或经由第二接头，诸如包含具有式((CH₂)₂O)_o(其中o为1-15)的乙二醇的接头间接地共价连接至HEG部分，并且第二接头经由硫代磷酸酯(ps)键共价地连接至HEG部分。例如，如本文所用，“Toco-ps(HEG)”可以指经由第二接头诸如具有式((CH₂)₂O)_o(其中o为1-15)的乙二醇共价地连接至CpG ODN的生育酚基团，该第二接头经由硫代磷酸酯(ps)键共价地连接至HEG部分。

如本文所用，术语“CpG”或“CpG基序”是指含有由磷酸键或含磷主链诸如磷酸二酯(po)键连接的非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤(即胞嘧啶(C)之后是鸟嘌呤(G)，即5’-CG-3’)的二核苷酸序列。

如本文所用，“寡核苷酸”、“寡聚脱氧核苷酸”或“ODN”是指由多个连接的核苷酸单元形成的多核苷酸。此类寡核苷酸可从现有的核酸来源获得，或者可通过合成方法制备。在一些实施方案中，寡核苷酸各自具有约5至约30个核苷酸残基，优选地约10至约25个核苷酸残基，更优选地约19至约24个核苷酸残基。在一个实施方案中，ODN含有19个核苷酸残基。在一个实施方案中，ODN含有20个核苷酸残基。在一个实施方案中，ODN含有21个核苷酸残基。在一个实施方案中，ODN含有22个核苷酸残基。在一个实施方案中，ODN含有23个核苷酸残基。在一个实施方案中，ODN含有24个核苷酸残基。本公开的ODN可从现有的核酸来源(例如基因组或cDNA)获得，但优选是合成的(例如通过寡核苷酸合成制备)。

如本文所用，“核苷酸”包括任何天然或天然存在的核苷酸，其包括选自以下的含氮碱基：腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和尿嘧啶(U)、脱氧核糖、以及磷酸基。示例性核苷酸包括但不限于天然存在的核苷酸碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶。

如本文所用，“CpG寡核苷酸”、“CpG寡聚脱氧核苷酸”和“CpG ODN”可互换使用，并且是指包含至少一个CpG基序的寡核苷酸。本公开的CpG ODN可包括一类或多类CpG ODN，诸如A类、B类、C类或P类ODN，如Bode等人,2011,Expert Rev Vaccines,10(4):499–511中有所描述。A类CpG ODN也称为D型，含有中心的含CpG回文基序以及5’和/或3’端的聚-G基序。B类CpG ODN也称为K型，通常由全硫代磷酸酯主链完全稳定化，并在某些优选的碱基范围内包含一个或多个CpG二核苷酸。C类CpG ODN通常由全硫代磷酸酯主链完全稳定化，并且包含中心回文CpG基序以及其他CpG二核苷酸。P类CpG ODN通常由全硫代磷酸酯主链完全稳定化，并且包含两个回文序列和多个CpG二核苷酸。

如本文所用，术语“核苷酸间键”是指通过其糖连接两个相邻核苷酸的化学键，所述糖由相邻核苷之间的磷原子和带电或中性基团构成。核苷酸间键的示例包括磷酸二酯(po)、硫代磷酸酯(ps)、氨基磷酸酯(np)、二硫代磷酸酯(ps2)、甲基磷酸酯(mp)和甲基硫代磷酸酯(rp)。硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯和甲基硫代磷酸酯是稳定的核苷酸间键，而磷酸二酯是天然存在的核苷酸间键。

寡核苷酸硫代磷酸酯通常合成为Rp和Sp硫代磷酸酯键的随机外消旋混合物。然而，根据具体实施方案，所公开的ODN构建体的硫代磷酸酯键含有Rp和Sp硫代磷酸酯键的混合物。根据具体实施方案，ODN构建体的CpG ODN具有立体限定的ps核苷酸间键，即ps键在CpG ODN中所存在的寡核苷酸分子的至少75％，诸如至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％，诸如至少99％中为Rp或Sp。

根据具体实施方案，CpG ODN中的一个至四个，优选地三个或四个CpG二核苷酸各自具有磷酸二酯(po)核苷酸间键，并且CpG ODN的剩余核苷酸间键中的每者为硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施方案中，CpG ODN中的CpG二核苷酸中的每者具有磷酸二酯(po)核苷酸间键，并且CpG ODN中剩余核苷酸中的每者具有硫代磷酸酯(ps)核苷酸间键。

如本文所用，术语“载体”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、类脂、含脂质囊泡、微球体、脂质体包囊、或本领域公知的用于药物制剂的其他材料。应当理解，载体、赋形剂或稀释剂的特征将取决于具体应用的施用途径。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指不干扰根据本公开的组合物的效果或根据本公开的组合物的生物活性的非毒性材料。鉴于本公开，根据具体实施方案，适用于基于CpG ODN的激动剂药物组合物的任何药学上可接受的载体均可用于本公开。

如本文所用，术语“受治疗者”是指动物。根据特定实施方案，受治疗者是哺乳动物，包括非灵长类(例如骆驼、驴、斑马、牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、犬、大鼠、兔子、豚鼠或小鼠)或灵长类(例如猴、黑猩猩或人)。在特定实施方案中，受治疗者是人。

如本文所用，术语“治疗有效量”是指在受治疗者中引起期望的生物学或药物学应答的活性成分或组分的量。治疗有效量可相对于指定目的根据经验以常规方式进行确定。例如，可任选地采用体外测定来帮助确定最佳剂量范围。基于若干因素的考虑，包括要治疗或预防的疾病、所涉及的症状、患者的体重、患者的免疫状态以及技术人员已知的其他因素，本领域的技术人员可确定具体有效剂量的选择(例如，经由临床试验)。在制剂中待采用的精确剂量也将取决于施用途径以及疾病的严重程度，并且应该根据医生的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可通过源自体外或动物模型测试体系的剂量响应曲线来推导。

如本文所用，术语“治疗”和“处理”均旨在意指与其中TLR9活性的调节将会有益的疾病，诸如免疫疾病、障碍或病症有关的至少一种可测量物理参数的改善或逆转，其不一定是受治疗者中可识别的，但能够在受治疗者中识别。术语“处理”和“治疗”也可指导致消退，预防发展，或至少延缓疾病、障碍或病症的发展。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指减轻、预防发展或发作，或缩短与其中TLR9活性的调节将会有益的疾病，诸如免疫疾病、障碍或病症(包括病毒感染或癌症)相关的一种或多种症状的持续时间。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指预防疾病、障碍或病症的复发。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指患有疾病、障碍或病症的受治疗者的存活提高。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指受治疗者中疾病、障碍或病症的消除。

如本文所用，“其中TLR9活性的调节将会有益的疾病”包括TLR9信号转导的刺激将有益于受治疗者的疾病。例如，其中TLR9活性的调节将会有益的疾病可包括免疫疾病、障碍或病症。根据具体实施方案，待治疗的疾病、障碍或病症为癌症，炎性疾病、障碍或病症，自身免疫疾病、障碍或病症，或由病原体引起的疾病、障碍或病症，诸如病毒感染。

根据具体实施方案，病毒感染为RNA或DNA病毒诸如腺病毒、细胞巨化病毒、甲型肝炎病毒(HAV)、嗜肝病毒(包括HBV、慢性HBV)、黄病毒(包括黄热病病毒)、肝炎病毒(包括丙型肝炎病毒(HCV))、1型和2型单纯疱疹病毒、带状疱疹病毒、人疱疹病毒6型、人免疫缺陷病毒(HIV)、人***瘤病毒(HPV)、甲型流感病毒、乙型流感病毒、麻疹病毒、副流感病毒、瘟病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、鼻病毒、冠状病毒、呼吸道合胞体病毒(RSV)、引起出血热的多个家族的病毒(包括沙粒病毒、布尼亚病毒和丝状病毒)，以及由RNA和DNA病毒引起的一系列病毒性脑炎。

根据具体实施方案，癌症或肿瘤为实体瘤或血癌。根据具体实施方案，癌症或肿瘤为恶性肿瘤、恶性毒瘤、黑素瘤、淋巴瘤、或白血病。根据具体实施方案，癌症或肿瘤为恶性肿瘤、恶性毒瘤、白血病、或由病毒引起的癌症。根据具体实施方案，癌症为乳腺癌、结肠癌、膀胱癌、肺癌、***癌、胃癌、或胰腺癌或成淋巴细胞性白血病或骨髓性白血病。

如本文所用，在将两种或更多种疗法施用于受治疗者的上下文中，术语“联合”是指使用多于一种疗法。术语“联合”的使用并不限制疗法施用于受治疗者的次序或此类施用之间的时间。例如，第一疗法(例如，本文所述的组合物)可在第二疗法施用于受治疗者之前(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以前)，与此同时，或之后(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以后)施用。

ODN构建体

在一个实施方案中，CpG ODN构建体具有下式：

式I：5’M₁-L₁-CpG ODN]-L₂-M₂3’，

其中：

M₁和M₂中的每者独立地表示脂质部分，优选地脂质部分包括选自胆固醇、生育酚、棕榈酰基和硬脂酰基的至少一种脂质部分，任选地M₁和M₂中的一者不存在；

优选地，CpG ODN包含至少一个具有磷酸二酯(po)核苷酸间键的CpG基序。

在一个实施方案中，本公开涉及具有下式的CpG ODN构建体：

式(IIa)：5’M-L-[CpG ODN]3’，或

式(IIb)：5’[CpG ODN]-L-M 3’

其中：

M表示脂质部分，优选地脂质部分包括选自胆固醇、生育酚、棕榈酰基和硬脂酰基中的至少一种；

L表示包含至少10个选自碳、氮、氧、氢、硫和磷的原子的接头，并且L经由可裂解键，优选地经由酯或酰胺键共价连接至CpG ODN；并且

CpG ODN包含至少一个具有po核苷酸间键的CpG基序，优选地包含至少两个、三个或四个各自具有po核苷酸间键的CpG基序。

根据具体方面，接头L在长度上含有5-100个原子，更优选地20-80个原子、20-40个原子、或30-60个原子，所述原子选自碳、氮、氧、氢、硫和磷。根据具体方面，接头包括磷酸二酯(po)或硫代磷酸酯(ps)键，并且包括((CH₂)₂O)_m，其中m为1至15，优选地5至10，更优选地6的整数。

在一个实施方案中，式(IIa)或(IIb)中的接头L包括-(((CH₂)₂O)_m-X)_n-，其中m为1至15的整数，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15，X独立地为磷酸二酯(po)或硫代磷酸酯(ps)键，并且n为1至5的整数，诸如1、2、3、4、或5。

在另一个实施方案中，式(IIa)或(IIb)中的接头L通过磷酸二酯(po)键或硫代磷酸酯(ps)键连接至脂质部分M。

在另一个实施方案中，式(IIa)或(IIb)中的接头L经由磷酸二酯(po)键或氨基磷酸酯键，优选地po键连接至CpG ODN。

在一个实施方案中，L为-Y₁-(((CH₂)₂O)_m-X)_n-Y₂-；或者L为-Y₂-(((CH₂)₂O)_m-X)_n-Y₁-

其中，

Y₁为化学键或接头，优选地具有式((CH₂)₂O)_o(其中o为1-15)的乙二醇，其经由磷酸二酯(po)键、硫代磷酸酯(ps)键或化学键共价连接至(((CH₂)₂O)_m-X)_n；

Y₂为可裂解键，包括酯或酰胺键；

每个X独立地为化学键、po键或ps键；

m为1至15的整数；并且

n为1至5的整数。

在一些实施方案中，Y₂为po键或np键。

在另一方面，本公开涉及具有以下结构的ODN构建体：

式(IIIa)：5’M₁-Y₁-(((CH₂)₂O)_m-X)_n-Y₂-CpG ODN]-Y₃-M₂3’，或

式(IIIb)：5’M₂-Y₃-CpG ODN]-Y₂-(((CH₂)₂O)_m-X)_n-Y₁-M₁3’

其中：

M₁表示脂质部分，优选地所述脂质部分包括选自胆固醇、生育酚、棕榈酰基和硬脂酰基中的至少一种，

M₂表示脂质部分、靶向部分，或者不存在，

Y₁为化学键或接头，优选地具有式((CH₂)₂O)_o的乙二醇，其中o为1-15，其经由磷酸二酯(po)键、硫代磷酸酯(ps)键或化学键共价连接至(((CH₂)₂O)_m-X)_n，

X独立地为化学键、po键或ps键，

CpG ODN包含至少一个具有po核苷酸间键的CpG基序，优选地包含至少两个、三个或四个各自具有po核苷酸间键的CpG基序；

m为1至15的整数，并且

n为1至5的整数。

在一个实施方案中，本公开涉及具有下式的CpG ODN构建体：

式(IVa)：5’M-Y₁-(((CH₂)₂O)_m-X)_n-Y₂-[CpG ODN]3’，或

式(IVb)：5’[CpG ODN]-Y₂-(((CH₂)₂O)_m-X)_n-Y₁-M 3’

其中：

M表示脂质部分，优选地脂质部分包括选自胆固醇、生育酚、棕榈酰基和硬脂酰基中的至少一种，

Y₁为化学键或接头，优选地1-5个乙二醇部分，其经由磷酸二酯(po)键、硫代磷酸酯(ps)键或化学键共价连接至(((CH₂)₂O)_m-X)_n，

X独立地为化学键、磷酸二酯(po)键或硫代磷酸酯(ps)键，

Y₂为可裂解键，优选地包括酯或酰胺键，更优选地包括po键或氨基磷酸酯键，最优选地po键；

CpG ODN包含至少一个具有po核苷酸间键的CpG基序，优选地包含至少两个、三个或四个各自具有所述po核苷酸间键的CpG基序；

m为1至15的整数，优选地为6；并且

n为1至5的整数，优选地为2；

根据一个具体实施方案，X独立地为磷酸二酯(po)键或不存在，Y为po键，m为6，n为2，M表示包括生育酚或棕榈酰基的脂质部分。

根据一个具体实施方案，ODN构建体具有选自以下的结构：

5’M-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN]3’、

5’M-ps(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN]3’、

5’M-ps(HEG)ps(HEG)po-[CpG ODN]3’、

5’M-po(HEG)ps(HEG)po-[CpG ODN]3’、

5’[CpG ODN]-po(HEG)po(HEG)po-M 3’、

5’[CpG ODN]-po(HEG)ps(HEG)po-M 3’、

5’[CpG ODN]-po(HEG)ps(HEG)ps-M 3’和

5’[CpG ODN]-po(HEG)po(HEG)ps-M 3’，

其中：

M表示脂质部分，所述脂质部分包括选自胆固醇、生育酚、棕榈酰基和硬脂酰基中的至少一种；

po表示磷酸二酯键；

HEG表示((CH₂)₂O)₆；

ps表示硫代磷酸酯键；并且

CpG ODN包含至少一个具有po核苷酸间键的CpG基序，优选地包含至少两个、三个或四个各自具有所述po核苷酸间键的CpG基序，

其中M经由po或ps键直接地或经由第二接头间接地共价连接至(HEG)，所述第二接头经由po或ps键直接地连接至(HEG)。

根据一个具体实施方案，ODN构建体具有选自以下的结构：

5’Toco-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN]3’，其中Toco表示生育酚，

5’Chol-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN]3’，其中Chol表示胆固醇，

5’Palm-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN]3’，其中Palm表示棕榈酰基，

5’[CpG ODN]-po(HEG)ps-Chol 3’，其中Chol表示胆固醇，

5’[CpG ODN]-po(HEG)ps-Toco 3’，其中Toco表示生育酚，以及

5’[CpG ODN]-po(HEG)ps-Palm 3’，其中Palm表示棕榈酰基，

其中：

po表示磷酸二酯键；

HEG表示((CH₂)₂O)₆；

ps表示硫代磷酸酯键；并且

CpG ODN包含至少一个具有po核苷酸间键的CpG基序，优选地包含至少两个、三个或四个各自具有所述po核苷酸间键的CpG基序，

其中所述生育酚、所述胆固醇或所述棕榈酰基经由po或ps键直接地或经由第二接头间接地共价连接至(HEG)，所述第二接头经由po或ps键直接地连接至(HEG)。

在一个实施方案中，CpG ODN含有多个适于激活TLR9的CpG二核苷酸。在一个实施方案中，CpG ODN含有至少一个CpG二核苷酸。在一个实施方案中，CpG ODN含有至少两个CpG二核苷酸。在一个实施方案中，CpG ODN含有至少三个CpG二核苷酸。在一个实施方案中，CpGODN含有至少四个CpG二核苷酸。在一个实施方案中，CpG ODN含有一个CpG二核苷酸。在一个实施方案中，CpG ODN含有两个CpG二核苷酸。在一个实施方案中，CpG ODN含有三个CpG二核苷酸。在一个实施方案中，CpG ODN含有四个CpG二核苷酸。

在一个实施方案中，CpG ODN的CpG二核苷酸位于CpG ODN内以激活TLR9。在一个实施方案中，CpG ODN的第一CpG二核苷酸与第二CpG二核苷酸间隔至少一个核苷酸。在一个实施方案中，CpG ODN的第一CpG二核苷酸与第二CpG二核苷酸间隔至少两个核苷酸。在一个实施方案中，CpG ODN的第一CpG二核苷酸与第二CpG二核苷酸间隔至少三个核苷酸。在一个实施方案中，CpG ODN的第一CpG二核苷酸与第二CpG二核苷酸间隔至少四个核苷酸。在一个实施方案中，CpG ODN的第一CpG二核苷酸与第二CpG二核苷酸间隔至少五个核苷酸。在一个实施方案中，CpG ODN的第一CpG二核苷酸与第二CpG二核苷酸间隔至少六个核苷酸。在一个实施方案中，CpG ODN的第一CpG二核苷酸与第二CpG二核苷酸间隔一个核苷酸。在一个实施方案中，CpG ODN的第一CpG二核苷酸与第二CpG二核苷酸间隔两个核苷酸。在一个实施方案中，CpG ODN的第一CpG二核苷酸与第二CpG二核苷酸间隔三个核苷酸。在一个实施方案中，CpG ODN的第一CpG二核苷酸与第二CpG二核苷酸间隔四个核苷酸。在一个实施方案中，CpGODN的第一CpG二核苷酸与第二CpG二核苷酸间隔五个核苷酸。在一个实施方案中，CpG ODN的第一CpG二核苷酸与第二CpG二核苷酸间隔六个核苷酸。

在一个实施方案中，CpG二核苷酸与CpG ODN的3’端间隔至少一个核苷酸。在一个实施方案中，CpG二核苷酸与CpG ODN的3’端间隔至少两个核苷酸。在一个实施方案中，CpG二核苷酸与CpG ODN的3’端间隔至少三个核苷酸。在一个实施方案中，CpG二核苷酸与CpGODN的3’端间隔至少四个核苷酸。在一个实施方案中，CpG二核苷酸与CpG ODN的3’端间隔至少五个核苷酸。在一个实施方案中，CpG二核苷酸与CpG ODN的3’端间隔一个核苷酸。在一个实施方案中，CpG二核苷酸与CpG ODN的3’端间隔两个核苷酸。在一个实施方案中，CpG二核苷酸与CpG ODN的3’端间隔三个核苷酸。在一个实施方案中，CpG二核苷酸与CpG ODN的3’端间隔四个核苷酸。在一个实施方案中，CpG二核苷酸与CpG ODN的3’端间隔五个核苷酸。

在一个实施方案中，CpG二核苷酸与CpG ODN的5’端间隔至少一个核苷酸。在一个实施方案中，CpG二核苷酸与CpG ODN的5’端间隔至少两个核苷酸。在一个实施方案中，CpG二核苷酸与CpG ODN的5’端间隔至少三个核苷酸。在一个实施方案中，CpG二核苷酸与CpGODN的5’端间隔至少四个核苷酸。在一个实施方案中，CpG二核苷酸与CpG ODN的5’端间隔至少五个核苷酸。在一个实施方案中，CpG二核苷酸与CpG ODN的5’端间隔一个核苷酸。在一个实施方案中，CpG二核苷酸与CpG ODN的5’端间隔两个核苷酸。在一个实施方案中，CpG二核苷酸与CpG ODN的5’端间隔三个核苷酸。在一个实施方案中，CpG二核苷酸与CpG ODN的5’端间隔四个核苷酸。在一个实施方案中，CpG二核苷酸与CpG ODN的5’端间隔五个核苷酸。

根据具体方面，ODN构建体的CpG ODN具有硫代磷酸酯(ps)核苷酸间键。根据具体方面，ODN构建体的CpG ODN具有立体限定的硫代磷酸酯(ps)核苷酸间键。根据具体方面，ODN构建体的CpG ODN中的一个至四个，优选地三个或四个CpG二核苷酸各自具有磷酸二酯(po)核苷酸间键，并且CpG ODN的剩余核苷酸间键中的每者为硫代磷酸酯(ps)核苷酸间键。根据其他具体方面，CpG ODN中的两个核苷酸间键各自具有磷酸二酯(po)核苷酸间键，并且CpG ODN的剩余核苷酸间键中的每者为硫代磷酸酯(ps)键。根据其他具体方面，CpG ODN中的三个核苷酸间键各自具有磷酸二酯(po)核苷酸间键，并且CpG ODN的剩余核苷酸间键中的每者为硫代磷酸酯(ps)键。根据其他具体方面，CpG ODN中的四个核苷酸间键各自具有磷酸二酯(po)核苷酸间键，并且CpG ODN的剩余核苷酸间键中的每者为硫代磷酸酯(ps)键。根据另一些具体方面，CpG ODN中的五个或更多个核苷酸间键各自具有磷酸二酯(po)核苷酸间键，并且CpG ODN的剩余核苷酸间键中的每者为硫代磷酸酯(ps)键。

根据一些实施方案，本公开的ODN构建体包括包含CpG ODN的TLR9激动剂，该CpGODN包含以下，优选地由以下组成：选自以下的多核苷酸序列：

5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3’(SEQ ID NO:1)；

5’GGGGGACGATCGTCGGGGGG 3’(SEQ ID NO:2)；

5’GGGGTCAACGTTGAGGGGGG 3’(SEQ ID NO:3)；

5’TCCATGACGTTCCTGACGTT 3’(SEQ ID NO:4)；

5’TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO:5)；

5’TCGTCGTTACGTAACGACGACGTT 3’(SEQ ID NO:6)；和

5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGT 3’(SEQ ID NO:7)。

根据一些实施方案，本公开的ODN构建体包括包含CpG ODN的TLR9激动剂，该CpGODN包含以下，优选地由以下组成：与SEQ ID NO:1-7之一具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％、或此类值之间的任何百分比的同一性的多核苷酸序列。

根据具体方面，本公开的ODN构建体包含CpG ODN，该CpG ODN包含以下，优选地由以下组成：选自以下的多核苷酸序列：

(1)5’TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3’(SEQ ID NO:8)；

(2)5’TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3’(SEQ ID NO:9)；

(3)5’TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3’(SEQ ID NO:10)；

(4)5’TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3’(SEQ ID NO:11)；

(5)5’TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3’(SEQ ID NO:12)；

(6)5’TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3’(SEQ ID NO:13)；

(7)5’TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3’(SEQ ID NO:14)；

(8)5’TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsApsCpsGpsTpsApsApsCpsGpsApsCpsGpsApsCpsGpsTpsT 3’(SEQ ID NO:15)；

(9)5’TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsApsCpsGpsTpsApsApsCpsGpsApsCpsGpsApsCpsGpsTpsT 3’(SEQ ID NO:16)；

(10)5’TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsApsCpoGpsTpsApsApsCpsGpsApsCpsGpsApsCpsGpsTpsT 3’(SEQ ID NO:17)；

(11)5’TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsApsCpoGpsTpsApsApsCpoGpsApsCpsGpsApsCpsGpsTpsT 3’(SEQ ID NO:18)；

(12)5’TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsApsCpoGpsTpsApsApsCpoGpsApsCpoGpsApsCpsGpsTpsT 3’(SEQ ID NO:19)；

(13)5’GpsGpsGpsGpsGpsApsCpoGpsApsTpsCpoGpsTpsCpoGpsGpsGpsGpsGpsG 3’(SEQ ID NO:20)；

(14)5'GpsGpsGpsGpsTpsCpsApsApsCpoGpsTpsTpsGpsApsGpsGpsGpsGpsGpsG 3’(SEQ ID NO:21)；

(15)5’TpsCpsCpsApsTpsGpsApsCpsGpsTpsTpsCpsCpsTpsGpsApsCpsGpsTpsT 3’(SEQ ID NO:22)；

(16)5’TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsCpsGpsGpsCpsGpsCpsGpsCpsGpsCpsCpsG 3’(SEQ ID NO:23)；

(17)5’TpsCpoGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsT 3’(SEQ ID NO:24)；

(18)5’TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsT 3’(SEQ ID NO:25)；和

(19)5’TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsT 3’(SEQ ID NO:26)；

其中：

po表示磷酸二酯核苷酸间键；并且

ps表示硫代磷酸酯核苷酸间键。

根据一些实施方案，本公开的ODN构建体包括包含CpG ODN的TLR9激动剂，该CpGODN包含以下，优选地由以下组成：与SEQ ID NO:8-26之一具有或至少具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％、或此类值之间的任何百分比的同一性的多核苷酸序列。

根据具体方面，本公开的ODN构建体包含选自以下的结构：

(1)5’Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3’(SEQ ID NO:27)；

(2)5’Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3’(SEQ ID NO:28)；

(3)5’TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT-(HEG)po(HEG)po-Toco 3’(SEQ ID NO:29)；

(4)5’TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT-(HEG)po(HEG)po-Toco 3’(SEQ ID NO:30)；

(5)5’Chol-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3’(SEQ ID NO:31)；

(6)5’Chol-po(HEG)po(HEG)poTpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3’(SEQ ID NO:32)；

(7)5’Chol-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3’(SEQ ID NO:33)；

(8)5’Chol-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3’(SEQ ID NO:34)；

(9)5’Chol-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3’(SEQ ID NO:35)；

(10)5’Chol-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3’(SEQ ID NO:36)；

(11)5’TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Chol 3’(SEQ ID NO:37)；

(12)5’TpsCpoGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Chol 3’(SEQ ID NO:38)；

(13)5’TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Chol 3’(SEQ ID NO:39)；

(14)5’TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Chol 3’(SEQ ID NO:40)；

(15)5’TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Toco 3’(SEQ ID NO:41)；

(16)5’Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3’(SEQ ID NO:42)；

(17)5’TpsCpoGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Toco 3’(SEQ ID NO:43)；

(18)5’TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Toco 3’(SEQ ID NO:44)；

(19)5’TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Toco 3’(SEQ ID NO:45)；

(20)5’TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Toco 3’(SEQ ID NO:46)；

(21)5’Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3’(SEQ ID NO:47)；

(22)5’Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3’(SEQ ID NO:48)；

(23)5’Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3’(SEQ ID NO:49)；

(24)5’Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3’(SEQ ID NO:50)；

(25)5’-TpsCpoGpsTpsCGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTps-HEGps-Chol 3’(SEQ ID NO:51)；

(26)5’-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps(HEG)po(HEG)po-Chol 3’(SEQ ID NO:52)；

(27)5'-GpsGpsGpsGpsTpsCpsApsApsCpoGpsTpsTpsGpsApsGpsGpsGpsGpsGpsGps-HEGps-Chol 3’(SEQ ID NO:53)；

(28)5’-TpsCpsCpsApsTpsGpsApsCpsGpsTpsTpsCpsCpsTpsGpsApsCpsGpsTpsTps-HEGps-Chol 3’(SEQ ID NO:54)；

(29)5’-TpsCpsCpsApsTpsGpsApsCpsGpsTpsTpsCpsCpsTpsGpsApsCpsGpsTpsTps-HEGps-Toco 3’(SEQ ID NO:55)；

(30)5’Palmitoyl-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3’(SEQ ID NO:56)；

其中：

Chol表示胆固醇；

Toco表示生育酚；

Palmitoyl表示棕榈酰基；

HEG表示((CH₂)₂O)₆；

po表示磷酸二酯键；并且

ps表示硫代磷酸酯键。

其中所述生育酚、所述胆固醇或所述棕榈酰基经由po或ps键直接地或经由第二接头间接地共价连接至(HEG)，所述第二接头经由po或ps键直接地连接至(HEG)。

在一个实施方案中，ODN构建体具有以下结构：

或其外消旋或另选的手性形式，其中“寡核苷酸”表示对TLR9具有激动活性的CpGODN。

在一个实施方案中，ODN构建体具有以下结构：

或其外消旋或另选的手性形式，其中“寡核苷酸”表示对TLR9具有激动活性的CpGODN。

在一个实施方案中，CpG ODN含有SEQ ID NO:1，优选地SEQ ID NO:8：

5’

TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3’。

在一个实施方案中，CpG ODN含有以下结构：

根据具体方面，本公开的ODN构建体可进一步缀合至靶向部分。如本文所用，术语“靶向部分”是指适于将其缀合的激动剂递送至靶细胞的任何部分。靶向部分的示例包括例如碳水化合物、肽、蛋白质、小分子、脂质部分、或毒素，其被细胞表面受体特异性识别。可用的碳水化合物部分包括但不限于半乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、岩藻糖、甘露糖、以及唾液酸(N-乙酰神经氨酸)。根据具体实施方案，靶向部分结合至所感兴趣的特定靶细胞类型上存在的受体。靶向部分有助于使ODN构建体靶向所需的靶位点。一种靶向部分可改善递送的方式是通过受体介导的内吞活性。该摄取机制涉及结合到膜受体的ODN构建体经由膜结构的内陷或者通过递送体系与细胞膜的融合而移动到膜包裹的区域的内部。该过程经由在特异性配体与受体结合之后激活细胞表面或膜受体而引发。许多受体介导的内吞系统是已知的并且已有研究，包括识别糖诸如半乳糖、甘露糖、甘露糖-6-磷酸，肽和蛋白质诸如转铁蛋白、脱唾液酸糖蛋白，维生素B12、胰岛素和表皮生长因子(EGF)的那些。脱唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)是一种高容量受体，其在肝细胞上高度丰富。ASGP-R示出对N-乙酰基-D-半乳糖基胺(GalNAc)的亲和力比D-Gal高50倍。先前的工作示出，多价是实现nM亲和力所必需的，同时糖之间的间距也很关键。对D-甘露糖具有高亲和力的甘露糖受体代表了另一种重要的基于碳水化合物的配体-受体对。甘露糖受体在特定细胞类型诸如巨噬细胞和可能的树突细胞上高度表达。甘露糖缀合物以及甘露糖化药物载体已经成功地用于将药物分子靶向那些细胞。例如，参见Biessen等人(1996)J.Biol.Chem.271,28024-28030；Kinzel等人(2003)J.Peptide Sci.9,375-385；Barratt等人(1986)Biochim.Biophys.Acta 862,153-64；Diebold等人(2002)Somat.Cell Mol.Genetics 27,65-74。根据一些实施方案，靶向部分是脂质部分。例如，生育酚可充当维生素E受体的靶向部分，并且棕榈酰基可充当LDL受体的靶向部分。

根据具体实施方案，靶向部分结合至所感兴趣的特定靶细胞类型上存在的受体。

本公开的ODN构建体可直接地或经由接头间接地缀合至靶向部分。

合成

鉴于本公开，本公开的ODN构建体可以使用本领域已知的方法进行制备。例如，根据本公开使用的寡核糖核苷酸和寡核糖核苷可以采用固相合成来制备，参见例如“Oligonucleotide synthesis,a practical approach”,M.J.Gait编辑,IRL Press,1984；“Oligonucleotides and Analogues,A Practical Approach”,F.Eckstein编辑,IRLPress,1991(例如第1章：Modern machine-aided methods of ODN synthesis，第2章：Oligoribonucleotide synthesis，第4章：Phosphorothioate oligonucleotides，第5章：Synthesis of oligonucleotide phosphorodithioates)。其他特别有用的合成方法、试剂、封端基团和反应条件描述于Martin,P.,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504；Beaucage,S.L.和Iyer,R.P.,Tetrahedron,1992,48,2223-2311以及Beaucage,S.L.和Iyer,R.P.,Tetrahedron,1993,49,6123-6194，或其中引用的参考文献。可以制备具有例如交替的PO或PS键的混合骨架化合物，如美国专利5,378,825、5,386,023、5,489,677中以及公布的PCT申请PCT/US92/04294和PCT/US92/04305(分别作为WO 92/20822和WO 92/20823公布)中所述。

可用于制备本公开的ODN构建体的合成方案的示例示于图17中并且描述于实施例1中。

药物组合物及治疗方法

根据具体方面，本公开涉及一种诱导TLR9活性的ODN构建体。对TLR9具有激动活性的ODN构建体对TLR依赖性免疫应答的效应可以通过测量与激动剂接触的免疫细胞(例如，外周血单核细胞(PBMC)，主要由淋巴细胞和单核细胞组成)或报告细胞(例如，表达针对TLR9的报告构建体的HEK293细胞)的应答而在体外进行测定。对TLR9具有激动活性的ODN构建体对TLR依赖性免疫应答的效应也可在体内测定，例如通过测量注射激动剂之后动物中的细胞因子诱导。示例性方法在本文中描述于例如以下实施例中。

本公开的ODN构建体可用于治疗免疫疾病、障碍或病症，诸如病毒感染或癌症。

因此，在另一个总的方面，本公开涉及一种药物组合物，该药物组合物包含本公开的ODN构建体和药学上可接受的载体。

在另一个总的方面，本公开涉及一种在对其有需要的受治疗者中刺激免疫应答的方法，该方法包括向受治疗者施用包含本公开的ODN构建体和药学上可接受的载体的药物组合物。

在另一个总的方面，本公开涉及一种在对其有需要的受治疗者中治疗或减轻疾病、障碍或病症，诸如免疫疾病、障碍或病症(诸如病毒感染或癌症)的症状的方法，该方法包括向受治疗者施用本公开的药物组合物。

根据本公开的实施方案，药物组合物包含治疗有效量的ODN构建体。如本文关于ODN构建体所用，治疗有效量意指在对其有需要的受治疗者中刺激免疫应答的ODN构建体的量。另外如本文关于ODN构建体所用，治疗有效量意指导致如下情况的ODN构建体的量：治疗免疫疾病、障碍或病症(诸如病毒感染或癌症)；阻止或减缓免疫疾病、障碍或病症(诸如病毒感染或癌症)的进展；减轻或完全缓解与免疫疾病、障碍或病症(诸如病毒感染或癌症)相关联的症状。

根据具体实施方案，治疗有效量是指足以实现以下作用中的一者、两者、三者、四者、或更多者的治疗量：(i)减小或改善所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的严重性；(ii)减少所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的持续时间；(iii)预防所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状发展；(iv)引起所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状消退；(v)预防所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状发展或发作；(vi)预防所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状复发；(vii)减少患有所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的受治疗者的住院治疗；(viii)减少患有所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的受治疗者的住院时间；(ix)提高患有所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的受治疗者的存活；(x)抑制或减少受治疗者中所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状；和/或(xi)增强或改善另一种疗法的预防或治疗效果。

根据特定实施方案，所治疗的疾病、障碍或病症是免疫疾病、障碍或病症。根据具体实施方案，待治疗的疾病、障碍或病症为癌症，炎性疾病、障碍或病症，自身免疫疾病、障碍或病症，或由病原体引起的疾病、障碍或病症，诸如病毒感染。根据具体实施方案，癌症或肿瘤是由病毒引起的癌症、恶性肿瘤、恶性毒瘤、或白血病。根据具体实施方案，癌症为乳腺癌、结肠癌、膀胱癌、肺癌、***癌、胃癌、或胰腺癌或成淋巴细胞性白血病或骨髓性白血病。根据具体实施方案，病毒感染为RNA或DNA病毒诸如腺病毒、细胞巨化病毒、甲型肝炎病毒(HAV)、嗜肝病毒(包括HBV、慢性HBV)、黄病毒(包括黄热病病毒)、肝炎病毒(包括丙型肝炎病毒(HCV))、1型和2型单纯疱疹病毒、带状疱疹病毒、人疱疹病毒6型、人免疫缺陷病毒(HIV)、人***瘤病毒(HPV)、甲型流感病毒、乙型流感病毒、麻疹病毒、副流感病毒、瘟病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、鼻病毒、冠状病毒、呼吸道合胞体病毒(RSV)、引起出血热的多个家族的病毒(包括沙粒病毒、布尼亚病毒和丝状病毒)，以及由RNA和DNA病毒引起的一系列病毒性脑炎。根据更具体的实施方案，待治疗的疾病是HBV感染或慢性HBV感染。

慢性HBV优选地特征在于在受治疗者中超过6个月可检测到HBV的存在。更优选地，本文提及的慢性HBV感染遵循疾病控制和预防中心(Centers for Disease Control andPrevention，CDC)所公布的定义，根据该定义，慢性HBV感染的特征在于以下实验室标准：(i)对乙型肝炎核心抗原IgM抗体(IgM抗HBc)呈阴性，并且对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、或乙型肝炎病毒DNA的核酸测试呈阳性，或者(ii)对HBsAg或HBV DNA的核酸测试呈阳性，或对HBeAg呈阳性(两次，间隔至少6个月)。

根据具体实施方案，治疗有效量是指足以治疗慢性HBV感染的治疗量。因此，治疗有效量是指足以实现以下效应中的一者、两者、三者、四者、或更多者的治疗量：(i)减少或改善HBV感染或与之相关联的症状的严重程度；(ii)减少HBV感染或与之相关联的症状的持续时间；(iii)阻止HBV感染或与之相关联的症状进展；(iv)引起HBV感染或与之相关联的症状消退；(v)预防HBV感染或与之相关联的症状发展或发作；(vi)预防HBV感染或与之相关联的症状复发；(vii)减少患有HBV感染的受治疗者的住院治疗；(viii)减少患有HBV感染的受治疗者的住院时间；(ix)提高患有HBV感染的受治疗者的存活；(x)消除受治疗者的HBV感染；(xi)抑制或减少受治疗者中的HBV复制；和/或(xii)增强或改善另一种疗法的预防或治疗效果。

根据具体实施方案，治疗有效量是指足以实现以下效应中的一者、两者、三者或四者的治疗量：(i)使受治疗者中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的量下降10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多；(ii)使受治疗者中乙型肝炎e抗原(HBeAg)的量下降10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多；(iii)使受治疗者中乙型肝炎病毒DNA的量下降10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多；和/或(iv)使受治疗者中抗HBsAg抗体的量下降10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。

根据具体实施方案，治疗有效量是指足以治疗癌症的治疗量。因此，治疗有效量是指足以实现以下效应中的一者、两者、三者、四者、或更多者的治疗量：(i)减少或改善癌症或与之相关联的症状的严重程度；(ii)减少癌症或与之相关联的症状的持续时间；(iii)阻止癌症或与之相关联的症状进展；(iv)引起癌症或与之相关联的症状消退；(v)预防癌症或与之相关联的症状发展或发作；(vi)预防癌症或与之相关联的症状复发；(vii)减少患有癌症的受治疗者的住院治疗；(viii)减少患有癌症的受治疗者的住院时间；(ix)提高患有癌症的受治疗者的存活；(x)消除受治疗者的癌症；和/或(xi)增强或改善另一种疗法的预防或治疗效果。

治疗有效量或剂量可根据各种因素，诸如施用方式、目标部位、受治疗者的生理状态(包括例如年龄、体重、健康状态)而变化，不论受治疗者是人或动物、施用的其他药物，以及是否为预防性或治疗性治疗。最佳地滴定治疗剂量以优化安全性和功效。

本公开的ODN构建体的治疗用途的施用模式可以是将该试剂递送至宿主的任何合适途径。例如，本文所述的组合物可被配制成适用于肠胃外施用，例如真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或颅内施用，或它们可施用到脑或脊柱的脑脊髓液中。

根据特定实施方案，本文所述组合物被配制成适于施用于受治疗者的预期途径。例如，本文所述的组合物可被配制成适于静脉内、皮下、瘤内或肌内施用。根据优选的实施方案，本文所述的组合物被配制成适于静脉内、皮下、或瘤内施用。

治疗可在单剂量时间表或作为多剂量时间表给予，在该多剂量时间表中，初步疗程可使用1-10个独立的剂量，然后在维持和/或增强响应所需的后续时间间隔给予其他剂量，例如在1-4个月给予第二剂量，并且如果需要，在几个月后给予一个或多个后续剂量。合适的疗程的示例包括：(i)0、1个月和6个月，(ii)0、7天和1个月，(iii)0和1个月，(iv)0和6个月，或其他足以引起预期会减轻疾病症状或减轻疾病严重程度的期望响应的计划表。

根据具体实施方案，用于治疗免疫疾病、障碍或病症、或病毒疾病诸如慢性HBV、或癌症的组合物可以与有效治疗相关疾病、障碍或病症的其他试剂联合使用。此类试剂的示例包括但不限于CAM、DAA、其他TLR、ASO/siRNA、检查点抑制剂、其他化疗药物、CAR-T。

在另一个总的方面，本公开涉及一种产生包含本公开的ODN构建体的药物组合物的方法，该方法包括使ODN构建体与药学上可接受的载体组合，以获得药物组合物。

在另一个总的方面，本公开涉及一种在对其有需要的受治疗者中治疗慢性HBV感染的方法，该方法包括向受治疗者施用包含本公开的ODN构建体的药物组合物。

在另一个总的方面，本发明涉及一种在对其有需要的受治疗者中***，优选地癌症的方法，该方法包括向受治疗者施用包含本公开的ODN构建体的药物组合物。

本专利申请中所有引用的参考文献的内容(包括参考文献、公布的专利、公布的专利申请以及共同未决的专利申请)在此明确地以引用方式并入。

实施方案

本公开还提供以下非限制性实施方案。

实施方案1是一种ODN构建体，其具有式I的化学式：

5’M₁-L₁-[CpG ODN]-L₂-M₂3’，

其中：

M₁和M₂中的每者独立地表示脂质部分，优选地所述脂质部分包括选自胆固醇、生育酚、棕榈酰基和硬脂酰基中的至少一种，任选地M₁和M₂中的一者不存在；

优选地，CpG ODN包含至少一个具有磷酸二酯(po)核苷酸间键的CpG基序；

任选地，所述式(I)的CpG ODN构建体进一步共价缀合至靶向部分，所述靶向部分优选地选自半乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、岩藻糖、甘露糖、唾液酸、N-乙酰神经氨酸。

实施方案2是一种CpG ODN构建体，其具有下式：

式(IIa)：5’M-L-[CpG ODN]3’，或

式(IIb)：5’[CpG ODN]-L-M 3’

其中：

M表示脂质部分，优选地所述脂质部分包括选自胆固醇、生育酚、棕榈酰基和硬脂酰基中的至少一种；

L表示包含至少1个选自碳、氮、氧、氢、硫和磷的原子的接头，并且L经由可裂解键，优选地经由酯或酰胺键共价连接至所述CpG ODN；并且

CpG ODN包含至少一个具有po核苷酸间键的CpG基序，优选地包含至少两个、三个或四个各自具有所述po核苷酸间键的CpG基序；

实施方案2a是根据实施方案1或2所述的ODN构建体，其中所述接头包含10-100个选自碳、氮、氧、氢、硫和磷的原子。

实施方案2b是根据实施方案2a所述的ODN构建体，其中所述接头含有20-100个选自碳、氮、氧、氢、硫和磷的原子。

实施方案2c是根据实施方案2a所述的ODN构建体，其中所述接头含有30-100个选自碳、氮、氧、氢、硫和磷的原子。

实施方案2d是根据实施方案2a所述的ODN构建体，其中所述接头包含40-100个选自碳、氮、氧、氢、硫和磷的原子。

实施方案2e是根据实施方案2a所述的ODN构建体，其中所述接头包含50-100个选自碳、氮、氧、氢、硫和磷的原子。

实施方案2f是根据实施方案2a所述的ODN构建体，其中所述接头包含60-100个选自碳、氮、氧、氢、硫和磷的原子。

实施方案2g是根据实施方案2a所述的ODN构建体，其中所述接头包含70-100个选自碳、氮、氧、氢、硫和磷的原子。

实施方案2h是根据实施方案2a所述的ODN构建体，其中所述接头包含80-100个选自碳、氮、氧、氢、硫和磷的原子。

实施方案3是根据实施方案1或2所述的ODN构建体，其中所述接头包括((CH₂)₂O)_m，其中m为1至15的整数，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。

实施方案4是根据实施方案3所述的ODN构建体，其中所述接头包括(((CH₂)₂O)_m-X)_n，其中n为1至5的整数，诸如1、12、3、4、或5，并且X独立地为磷酸二酯(po)或硫代磷酸酯(ps)键。

实施方案4a是根据实施方案4所述的ODN构建体，其中所述接头包括(((CH₂)₂O)₆-X)_n。

实施方案4b是根据实施方案4a所述的ODN构建体，其中所述接头包括((CH₂)₂O)₆-po。

实施方案4c是根据实施方案4a所述的ODN构建体，其中所述接头包括((CH₂)₂O)₆-po-((CH₂)₂O)₆-po。

实施方案4d是根据实施方案4a所述的ODN构建体，其中所述接头包括((CH₂)₂O)₆-ps-((CH₂)₂O)₆-po。

实施方案5是一种CpG ODN构建体，其具有以下结构：

式(IIIa)：5’M₁-Y₁-(((CH₂)₂O)_m-X)_n-Y₂-[CpG ODN]-Y₃-M₂3’，或

式(IIIb)：5’M₂-Y₃-[CpG ODN]-Y₂-(((CH₂)₂O)_m-X)_n-Y₁-M₁3’

其中：

M₁表示脂质部分，优选地所述脂质部分包括选自胆固醇、生育酚、棕榈酰基和硬脂酰基中的至少一种，

M₂表示脂质部分、靶向部分，或者不存在，

Y₁为化学键或接头，优选地具有式((CH₂)₂O)_o的乙二醇，其中o为1-15，其经由磷酸二酯(po)键、硫代磷酸酯(ps)键或化学键共价连接至(((CH₂)₂O)_m-X)_n，

X独立地为化学键、po键或ps键，

CpG ODN包含至少一个具有po核苷酸间键的CpG基序，优选地包含至少两个、三个或四个各自具有所述po核苷酸间键的CpG基序；

m为1至15的整数，并且

n为1至5的整数。

实施方案6是根据实施方案5所述的ODN构建体，其中M2是靶向性的。

实施方案6a是根据实施方案6所述的ODN构建体，其中M2是靶向性的，选自半乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、岩藻糖、甘露糖、唾液酸、N-乙酰神经氨酸。

实施方案6b是根据实施方案5所述的ODN构建体，其中M2和Y₃不存在。

实施方案7是一种CpG ODN构建体，其具有下式：

式(IVa)：5’M-Y₁-(((CH₂)₂O)_m-X)_n-Y₂-[CpG ODN]3’，或

式(IVb)：5’[CpG ODN]-Y₂-(((CH₂)₂O)_m-X)_n-Y₁-M 3’

其中：

M表示脂质部分，优选地所述脂质部分包括选自胆固醇、生育酚、棕榈酰基和硬脂酰基中的至少一种，

Y₁为化学键或接头，优选地具有式((CH₂)₂O)_o的乙二醇，其中o为1-15，其经由磷酸二酯(po)键、硫代磷酸酯(ps)键或化学键共价连接至(((CH₂)₂O)_m-X)_n，

X独立地为化学键、磷酸二酯(po)键或硫代磷酸酯(ps)键，

Y₂为可裂解键，优选地包括酯或酰胺键，更优选地包括po键或氨基磷酸酯键，最优选地po键；

CpG ODN包含至少一个具有po核苷酸间键的CpG基序，优选地包含至少两个、三个或四个各自具有所述po核苷酸间键的CpG基序；

m为1至15的整数，优选地为6；并且

n为1至5的整数，优选地为2；

实施方案8是根据实施方案5至7中任一项所述的ODN构建体，其中Y₂包括酯键。

实施方案8a是根据实施方案8所述的ODN构建体，其中Y₂为磷酸二酯(po)键。

实施方案8b是根据实施方案5至7中任一项所述的ODN构建体，其中Y₂包括酰胺键。

实施方案8c是根据实施方案8b所述的ODN构建体，其中Y₂为氨基磷酸酯键。

实施方案9是根据实施方案5至8c中任一项所述的ODN构建体，其中Y₁包括经由化学键共价连接至(((CH₂)₂O)_m-X)_n的具有式((CH₂)₂O)_o的乙二醇，其中o为1-15。

实施方案9a是根据实施方案9所述的ODN构建体，其中Y₁包括经由po键共价连接至(((CH₂)₂O)_m-X)_n的具有式((CH₂)₂O)_o的乙二醇，其中o为1-15。

实施方案9b是根据实施方案9所述的ODN构建体，其中Y₁包括经由ps键共价连接至(((CH₂)₂O)_m-X)_n的具有式((CH₂)₂O)_o的乙二醇，其中o为1-15。

实施方案10是根据实施方案4至9b中任一项所述的ODN构建体，其中m为1至15的整数。

实施方案10a是根据实施方案10所述的ODN构建体，其中m为1。

实施方案10b是根据实施方案10所述的ODN构建体，其中m为2。

实施方案10c是根据实施方案10所述的ODN构建体，其中m为3。

实施方案10d是根据实施方案10所述的ODN构建体，其中m为4。

实施方案10e是根据实施方案10所述的ODN构建体，其中m为5。

实施方案10f是根据实施方案10所述的ODN构建体，其中m为6。

实施方案10g是根据实施方案10所述的ODN构建体，其中m为7。

实施方案10h是根据实施方案10所述的ODN构建体，其中m为8。

实施方案10i是根据实施方案10所述的ODN构建体，其中m为9。

实施方案10j是根据实施方案10所述的ODN构建体，其中m为10。

实施方案10k是根据实施方案10所述的ODN构建体，其中m为11。

实施方案10l是根据实施方案10所述的ODN构建体，其中m为12。

实施方案10m是根据实施方案10所述的ODN构建体，其中m为11。

实施方案10n是根据实施方案10所述的ODN构建体，其中m为14。

实施方案10o是根据实施方案10所述的ODN构建体，其中m为15。

实施方案11是根据实施方案4至10o中任一项所述的ODN构建体，其中n为1至5的整数。

实施方案11a是根据实施方案11所述的ODN构建体，其中n为1。

实施方案11b是根据实施方案11所述的ODN构建体，其中n为2。

实施方案11c是根据实施方案11所述的ODN构建体，其中n为3。

实施方案11d是根据实施方案11所述的ODN构建体，其中n为4。

实施方案11e是根据实施方案11所述的ODN构建体，其中n为5。

实施方案12是根据实施方案4-10和11中任一项所述的ODN构建体，其中m为6且n为2。

实施方案13是一种ODN构建体，其具有选自以下的结构：

5’M-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN]3’、

5’M-ps(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN]3’、

5’M-ps(HEG)ps(HEG)po-[CpG ODN]3’、

5’M-po(HEG)ps(HEG)po-[CpG ODN]3’、

5’[CpG ODN]-po(HEG)po(HEG)po-M 3’、

5’[CpG ODN]-po(HEG)ps(HEG)po-M 3’、

5’[CpG ODN]-po(HEG)ps(HEG)ps-M 3’和

5’[CpG ODN]-po(HEG)po(HEG)ps-M 3’，

其中：

M表示脂质部分，所述脂质部分包括选自胆固醇、生育酚、棕榈酰基和硬脂酰基中的至少一种；

po表示磷酸二酯键；

HEG表示((CH₂)₂O)₆；

ps表示硫代磷酸酯键；并且

CpG ODN包含至少一个具有po核苷酸间键的CpG基序，优选地包含至少两个、三个或四个各自具有所述po核苷酸间键的CpG基序，

其中M经由po或ps键直接地或经由第二接头间接地共价连接至(HEG)，所述第二接头经由po或ps键直接地连接至(HEG)。

实施方案14是根据实施方案1至13中任一项所述的ODN构建体，其中所述脂质部分是胆固醇。

实施方案14a是根据实施方案1至13中任一项所述的ODN构建体，其中所述脂质部分是生育酚。

实施方案14b是根据实施方案1至13中任一项所述的ODN构建体，其中所述脂质部分是棕榈酰基。

实施方案14c是根据实施方案1至13中任一项所述的ODN构建体，其中所述脂质部分是硬脂酰基。

实施方案15是一种ODN构建体，其具有选自以下的结构：

5’Toco-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN]3’，其中Toco表示生育酚，

5’Chol-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN]3’，其中Chol表示胆固醇，

5’Palm-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN]3’，其中Palm表示棕榈酰基，

5’[CpG ODN]-po(HEG)ps-Chol 3’，其中Chol表示胆固醇，

5’[CpG ODN]-po(HEG)ps-Toco 3’，其中Toco表示生育酚，以及

5’[CpG ODN]-po(HEG)ps-Palm 3’，其中Palm表示棕榈酰基，

其中：

po表示磷酸二酯键；

HEG表示((CH₂)₂O)₆；

ps表示硫代磷酸酯键；并且

CpG ODN包含至少一个具有po核苷酸间键的CpG基序，优选地包含至少两个、三个或四个各自具有所述po核苷酸间键的CpG基序，

其中所述生育酚、所述胆固醇或所述棕榈酰基经由po或ps键直接地或经由第二接头间接地共价连接至(HEG)，所述第二接头经由po或ps键直接地连接至(HEG)。

实施方案15a是根据实施方案15所述的ODN构建体，其中所述生育酚、所述胆固醇、或所述棕榈酰基共价连接至所述第二接头，并且所述第二接头经由po或ps键直接地共价连接至所述(HEG)。

实施方案16是一种ODN构建体，其具有以下结构：

或其外消旋或另选的手性形式，其中“寡核苷酸”表示CpG ODN，所述CpG ODN包含至少一个具有po核苷酸间键的CpG基序，优选地包含至少两个、三个或四个各自具有po核苷酸间键的CpG基序，任选地，所述ODN构建体直接地或经由接头进一步缀合至靶向部分。

实施方案16a是一种ODN构建体，其具有以下结构：

实施方案16b是一种ODN构建体，其具有以下结构：

或其外消旋或另选的手性形式。

实施方案16c是一种ODN构建体，其具有以下结构：

实施方案16d是一种ODN构建体，其具有以下结构：

或其外消旋或另选的手性形式。

实施方案17是根据实施方案1至16中任一项所述的ODN构建体，其中所述CpG ODN具有硫代磷酸酯(ps)核苷酸间键。

实施方案18是根据实施方案1至17中任一项所述的ODN构建体，其中所述CpG ODN具有立体限定的硫代磷酸酯(ps)核苷酸间键。

实施方案19是根据实施方案1至18中任一项所述的ODN构建体，其中所述CpG ODN中的一至四个CpG二核苷酸各自具有磷酸二酯(po)核苷酸间键。

实施方案19a是根据实施方案19所述的ODN构建体，其中所述CpG ODN包含至少两个各自具有po核苷酸间键的CpG基序。

实施方案19b是根据实施方案19所述的ODN构建体，其中所述CpG ODN包含至少三个各自具有po核苷酸间键的CpG基序。

实施方案19c是根据实施方案19所述的ODN构建体，其中所述CpG ODN包含至少四个各自具有po核苷酸间键的CpG基序。

实施方案20是根据实施方案19至19c中任一项所述的ODN构建体，其中所述CpGODN的剩余核苷酸间键中的每者为硫代磷酸酯(ps)核苷酸间键。

实施方案21是根据实施方案1至20中任一项所述的ODN构建体，其中所述CpG ODN包含以下，优选地由以下组成：选自以下的多核苷酸序列：

(1)5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3’(SEQ ID NO:1)；

(2)5’GGGGGACGATCGTCGGGGGG 3’(SEQ ID NO:2)；

(3)5’GGGGTCAACGTTGAGGGGGG 3’(SEQ ID NO:3)；

(4)5’TCCATGACGTTCCTGACGTT 3’(SEQ ID NO:4)；

(5)5’TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO:5)；

(6)5’TCGTCGTTACGTAACGACGACGTT 3’(SEQ ID NO:6)；和

(7)5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGT 3’(SEQ ID NO:7)。

实施方案21a是根据实施方案21所述的ODN构建体，其中所述CpG ODN包含以下，优选地由以下组成：与SEQ ID NO:1-7之一具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多核苷酸序列。

实施方案22是根据实施方案1至21中任一项所述的ODN构建体，其中所述CpG ODN包含以下，优选地由以下组成：选自以下的多核苷酸序列：