阅读说明：本技术 一种地西他滨在制备治疗炎症性肠病药物中的用途 (Application of decitabine in preparation of medicine for treating inflammatory bowel disease ) 是由 苏畅 曹奕鸥 茅安炜 饶龙华 于 2020-06-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种地西他滨在制备治疗炎症性肠病药物中的用途,所述地西他滨能够提高炎症性肠病小鼠脾脏调节性T细胞比例；能够提高炎症性肠病小鼠结肠组织中调节性T细胞相关细胞因子含量；能够提高炎症性肠病小鼠结肠组织紧密连接蛋白的表达；能够明显控制小鼠炎性肠病的结肠病变。本发明的地西他滨可诱导炎性肠病患者对肠道非致病性抗原的免疫耐受、恢复肠屏障功能,提高有效率及缓解率,降低复发率。(The invention discloses an application of decitabine in preparing a medicament for treating inflammatory bowel disease, wherein the decitabine can improve the proportion of splenic regulatory T cells of mice with inflammatory bowel disease; can improve the content of regulatory T cell related cytokines in colon tissues of mice with inflammatory bowel diseases; can improve the expression of the tight junction protein of the colon tissue of the mice with the inflammatory bowel diseases; can obviously control colon lesion of the inflammatory bowel disease of mice. The decitabine can induce immune tolerance of inflammatory bowel disease patients to intestinal non-pathogenic antigens, recover intestinal barrier function, improve effective rate and remission rate, and reduce recurrence rate.)

一种地西他滨在制备治疗炎症性肠病药物中的用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种地西他滨在制备治疗炎症性肠病药物中的用途。

背景技术

炎症性肠病通常指病因尚不清楚的非特异性肠道炎性疾病，包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。既往该病在欧美国家较为多见，但随着近年来国内各家医院报道病例数的显著增多，炎症性肠病已成为我国一种较常见的消化道疾病。炎症性肠病的病因尚未明确，考虑与遗传因素、环境因素、免疫缺陷及微生物暴露等有关。目前治疗炎症性肠病的常用药物为柳氮磺吡啶和英孚利昔单抗，柳氮磺吡啶治疗炎性肠病有效率50~70%，缓解率40~60%，复发率15~30%；而英孚利昔单抗则价格高昂。炎性肠病的病理过程系由肠道免疫系统对肠道非致病性抗原的反复免疫激活所致，其中调节性T细胞(Treg)在抑制免疫反应、介导免疫耐受等过程中起重要作用。Treg细胞在体内仅占外周CD4⁺T细胞的5％～10％，绝对数量少，必须通过人工手段诱导扩增达一定数量后方可成功诱导免疫耐受。转录因子Foxp3特异性高表达是Treg细胞发育和功能的决定因素，而Foxp3基因的表达受其启动子区上游的CPG模体甲基化程度调节，CPG模体甲基化程度越低，Foxp3基因表达程度越高，相应的Treg细胞数量也越多。地西他滨（5-aza-2’-deoxycytidine，5AZA)为嘧啶核苷类似物，在DNA复制过程中，可以与细胞内DNA甲基转移酶结合形成共价复合物，抑制该酶的甲基转移活性，而达到去甲基化，使因甲基化而失活的基因重新表达，恢复基因的功能，促使细胞的转化，临床上已被批准用于对骨髓增生异常综合征等血液系统疾病的治疗。

发明内容

本发明针对现有柳氮磺吡啶和英孚利昔单抗在治疗炎性肠病中所存在的问题，所提出的一种地西他滨在制备治疗炎症性肠病药物中的用途。

本发明是按照以下技术方案实现的。

一种地西他滨在制备治疗炎症性肠病药物中的用途。

进一步的，地西他滨提高炎症性肠病小鼠脾脏调节性T细胞比例。

进一步的，地西他滨提高炎症性肠病小鼠结肠组织中调节性T细胞相关细胞因子含量。

进一步的，地西他滨提高炎症性肠病小鼠结肠组织紧密连接蛋白的表达。

进一步的，地西他滨明显控制小鼠炎性肠病的结肠病变。

本发明获得了如下有益效果：

本发明利用地西他滨的去甲基化作用，降低Foxp3基因启动子区上游的CPG模体甲基化程度，促进Foxp3表达，体内扩增Treg细胞，诱导肠道免疫系统对肠道非致病性抗原的免疫耐受，从而治疗炎性肠病，有效率及缓解率高、复发率低，且成本相对低廉，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1 是本发明流式细胞术检测结果图；

图2是本发明ELISA法测定小鼠结肠组织TH l7/Treg相关细胞因子IL-17和TGF-β、IL-10水平变化图；

图3是本发明免疫荧光法定位紧密连接蛋白的表达图；

图4是本发明小鼠疾病活动指数、结肠大体形态损伤指数、结肠病理组织学指数评分结果图；

图5是本发明地西他滨治疗炎症性肠病的作用原理图。

具体实施方式

为了进一步阐释本发明的技术方案及其所实现的技术效果，下面将结合附图及实施例对本发明进行进一步的说明。

造模与治疗：予3%葡聚糖硫酸钠口服7天制备小鼠炎性肠病模型，分为DSS、SASP、5AZA三组，分别予以生理盐水、柳氮磺吡啶(100 mg/kg体重)、地西他滨(0.5 mg/kg体重)一天两次腹腔注射，连续治疗7天。

实施例1

切取小鼠脾脏，以PBS为匀浆介质研磨粉碎，经70um尼龙网过滤，1500rpm离心5min，去上清液，沉淀中加入2ml 0.83% NH₄CL 裂解红细胞，2min后加入15ml PBS 终止裂解作用，1500rpm离心5min，去上清液，沉淀中加入1ml PBS，计数，调整细胞密度至10⁶/ml，加入24孔板，1ml/wall。加入相应浓度的抗CD3抗体（0.5 μg/ml）、抗CD28抗体（1μg/ml），设三个复孔，并设PBS阴性对照孔，于5% CO₂、37℃培养72小时，PBS洗涤2次后，加入0.05μg/μl APC- Ratanti-mouse CD4 抗体50μl，4℃避光染色30min，PBS洗涤2次，加入1 ml 3：1稀释的破膜固定液，4 ℃避光放置1 h；加入2 ml破膜液，离心洗2次；重悬至100 μl，加入PE- Rat anti-mouse Foxp3抗体，4 ℃避光孵育1 h，加入2 ml破膜液，离心洗涤，加入200 μl的PBS用流式细胞仪检测细胞，流式数据使用Flowjo（Three Star）软件分析。

实验结果显示（图1）：地西他滨（5AZA）提高炎症性肠病小鼠脾脏调节性T细胞比例，效果优于柳氮磺吡啶（SASP）。

实施例2

ELISA法测定小鼠结肠组织TH l7/Treg相关细胞因子IL-17和TGF-β、IL-10水平变化：将结肠组织放在冰的PBS上冲洗，滤纸拭干后称取约10 mg结肠组织，加入l mL PBS(pH:6.0，内含1μg抑肽酶和亮肽素胃酶抑素A)，用眼科剪剪碎后放人匀浆器进行匀浆，4℃，12000 r/min离心20 min，取上清液，按ELISA试剂盒说明书检测IL-17和TGF-β、IL-10的浓度。

实验结果显示（图2）：地西他滨(5AZA)提高炎症性肠病小鼠结肠组织中调节性T细胞相关细胞因子含量，效果优于柳氮磺吡啶（SASP）。

实施例3

免疫荧光法定位紧密连接蛋白的表达：将小鼠新鲜结肠组织经PBS冲洗后用组织包埋剂包埋(Sakura，USA)，并置于-80℃保存。将冰冻组织10μm切片后在95℃ 10 mmol/L枸橼酸钠溶液中孵育5 min，冷却至室温。用含有5％牛血清白蛋白和5％胎牛血清的PBS室温下孵育30 min以消除非特异性背景。将以上切片与紧密连接蛋白ZO-1、Occludin一抗在4℃下孵育过夜，用异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽室温下染色1 h，再经相应荧光素标记的二抗孵育后，在激光共聚焦显微镜下观察蛋白定位。

实验结果显示（图3）：地西他滨(5AZA)提高炎症性肠病小鼠结肠组织紧密连接蛋白的表达，效果优于柳氮磺吡啶（SASP）。

实施例4

小鼠疾病活动指数、结肠大体形态损伤指数、结肠病理组织学指数评分：

小鼠疾病活动指数(DAI)观察及评分:根据相关标准行小鼠DAI评分: 观察小鼠的精神状态，大便的性质，有无血便，每天记录小鼠的的体重变化情况。0分：大便性质正常，无血便及隐血便，体重无下降；1分：大便松散，隐血便阳性弱阳性，体重下降>0～5％；2分：大便松散，隐血阳性，体重下降>5％～10％；3分：呈稀便，肉眼血便，体重下降>10％～15％；4分：呈稀便。大量肉眼血便．体重下降>15％。DAI评分=大便性质评分+血便评分+体重变化评分。

小鼠结肠大体形态损伤指数(CHDI)观察及评分:造模后第7d处死小鼠后，取全段结肠组织在解剖显微镜下观察溃疡及炎症情况，根据Wallace等标准进行评分：0分：基本正常；1分：无溃疡，局部可见充血；2分：可见溃疡，但无充血；3分：仅1处溃疡和炎症；4分：2处或更多处的溃疡和炎症；5分：溃疡长于2 cm；6～10分：大于2 cm的溃疡，每增加lcm加1分，有轻度粘连时(结肠较易与周围组织剥离)加1分．粘连较严重时加2分．

小鼠结肠病理组织学指数(TDI)观察及评分：在解剖显微镜下取病变较严重处，用4％多聚甲醛固定后行石蜡包埋．切片和HE染色，根据Dieleman等标准如下：炎症细胞浸润：无为0分，轻度为1分，中度为2分，重度为3分；浸润深度无为0分，黏膜层为1分，黏膜下层及肌层为2分，结肠全层为3分；溃疡深度：无为0分，上皮层为1分，黏膜层为2分，黏膜肌层为3分。TDI评分=炎症细胞浸润程度+浸润深度+溃疡深度评分。

实验结果显示（图4）：地西他滨(5AZA)可明显控制小鼠炎性肠病的结肠病变，效果优于柳氮磺吡啶（SASP）。

综上，地西他滨治疗炎症性肠病的作用原理如图5所示。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。