阅读说明：本技术 环形rna在系统性红斑狼疮制备治疗药物中的应用 (Application of circular RNA in preparation of therapeutic drugs for systemic lupus erythematosus ) 是由 陈玲玲 杨力 刘楚霄 李响 南芳 于 2019-02-25 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医学领域,具体涉及具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA在系统性红斑狼疮制备治疗药物中的应用。所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA基因作为诊断系统性红斑狼疮的标志物,使系统性红斑狼疮的诊断更加准确、快速。所述环形RNA其基因表达产物作为制备治疗系统性红斑狼疮的药物分子,为治疗系统性红斑狼疮提供了新的治疗途径。(The invention belongs to the field of biomedicine, and particularly relates to application of circular RNA with an incomplete double-chain structure with the length of 16bp-33bp and/or circular RNA with an incomplete double-chain structure with the length of 16bp-33bp in preparation of a therapeutic drug for systemic lupus erythematosus. The circular RNA gene with the incomplete double-chain structure with the length of 16bp-33bp is used as a marker for diagnosing the systemic lupus erythematosus, so that the diagnosis of the systemic lupus erythematosus is more accurate and rapid. The gene expression product of the circular RNA is used for preparing a drug molecule for treating systemic lupus erythematosus, and a new treatment way is provided for treating systemic lupus erythematosus.)

环形RNA在系统性红斑狼疮制备治疗药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及环形RNA在系统性红斑狼疮制备治疗药物中的应用。

背景技术

系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)是一种典型的多器官、多系统的自身免疫性疾病，其临床及免疫学表型极为复杂多样，包括免疫耐受缺陷，淋巴细胞功能调节和凋亡障碍，补体缺陷和免疫复合物清除障碍，细胞因子分泌调节障碍等，几乎覆盖整个免疫系统的紊乱。在临床上，主要表现为肾脏、神经精神系统、血液系统等多器官受损等。如果能够在SLE患者出现重要器官受累前进行早期诊断，对SLE的防治、改善患者的生活质量、提高患者生产率都会具有重大意义。然而，目前用于生物学诊断的标志物大多是在器官受损后出现的生化和免疫学改变，无法对SLE患者器官受累进行早期诊断。

目前，SLE的病因和发病机理尚不完全清楚，受家族遗传、性激素紊乱、环境因素等多方面影响。因此仍缺乏特异的治疗手段，无法从根本上提高该疾病的防治水平。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于对环形RNA在系统性红斑狼疮中的表达及其对系统性红斑狼疮生物学功能的调解作用的研究，提供基于环形RNA其表达产物在系统性红斑狼疮的诊断和治疗方面的用途。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的促进剂在制备系统性红斑狼疮治疗药物中的用途。

本发明的第二方面，提供一种治疗系统性红斑狼疮的方法，为向对象施用有效量的具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的促进剂。

本发明的第三方面，提供一种系统性红斑狼疮治疗药物，包括有效剂量的具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的促进剂。

本发明的第四方面，提供一种系统性红斑狼疮治疗药物组合，包括有效剂量的具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的促进剂，和至少一种其他系统性红斑狼疮治疗药物。

本发明的第五方面，提供一种治疗系统性红斑狼疮的方法，为向对象施用有效量的具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的促进剂，以及向对象施用有效量的其他系统性红斑狼疮治疗药物和/或向对象实施其他系统性红斑狼疮治疗手段。

本发明的第六方面，提供一种具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的促进剂在制备具有以下任一项或多项作用的药物中的用途：

(1)调节所述环形RNA通路以提高所述环形RNA水平；

(2)于细胞内直接增加所述环形RNA水平。

本发明的第七方面，提供所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的促进剂在制备或筛选系统性红斑狼疮治疗药物中的用途。

本发明的第八方面，提供具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA用于制备或筛选系统性红斑狼疮检测试剂的用途。

本发明的第九方面，提供特异性识别具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的试剂在制备系统性红斑狼疮检测试剂盒中的用途。

本发明的第十方面，提供一种系统性红斑狼疮检测试剂盒，所述试剂盒至少包括特异性识别具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的试剂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过设计一对特异性引物检测所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的表达；然后本发明通过检测系统性红斑狼疮病人中所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的表达情况，发现其表达水平明显降低，因此，可以作为系统性红斑狼疮的诊断标志。此外，本发明对所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA基因进行了体外的细胞功能学的研究，通过将所述环形RNA基因序列构建到pZW1载体上，以构建过表达所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA基因的表达载体。过表达所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA基因的系统性红斑狼疮病人单核细胞与转染空载体的对照相比，其磷酸化激酶PKR的磷酸化水平明显下调，下调系统性红斑狼疮病人单核细胞(PBMC)及免疫细胞T细胞中的细胞因子IFN-beta和系统性红斑狼疮诊断基因的表达量。说明了所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA基因及其表达产物可以应用在制备治疗系统性红斑狼疮的药物。综上所述，所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA基因作为诊断系统性红斑狼疮的标志物，使系统性红斑狼疮的诊断更加准确、快速。所述环形RNA其基因表达产物作为制备治疗系统性红斑狼疮的药物分子，为治疗系统性红斑狼疮提供了新的治疗途径。

附图说明

图1：为circPOLR2A在染色体上的位置图。

图2：为使用特异性检测引物检测circPOLR2A在系统性红斑狼疮病人中的表达量。

图3：利用环形RNA circPOLR2A所得受试者工作特征曲线(ROC曲线)。

图4：circPOLR2A及同一类25个具有特殊双链结构的环形RNA及不含有特殊双链结构的环形RNA circSMARCA5二级结构示意图。

图5：过表达circPOLR2A及不含有特殊双链结构的环形RNA circSMARCA5后，检测PKR及PKR下游基因的磷酸化水平。

图6：过表达circPOLR2A后，检测PKR的磷酸化水平及下调系统性红斑狼疮病人单核细胞(PBMC)及免疫细胞T细胞中的细胞因子IFN-beta和系统性红斑狼疮诊断基因MX-1，LY-6E，IFIT3的表达量。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

环形RNA(circRNAs)是一类新近发现的非编码RNA分子。区别于传统线性RNA，环形RNA不具有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴，并以共价键形成闭合环形结构。最新研究表明环形RNA主要是通过反向剪切(back-splicing)产生，广泛存在于各种生物细胞中，具有极高的结构稳定性，难以被外切核酸酶(exonuclease)降解，表达具有组织及时空特异性等特征。这些特征使得circRNA在疾病诊断与治疗方法的开发应用上具有广阔的前景。

本发明实施例提供具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的促进剂在制备系统性红斑狼疮治疗药物中的用途。其中不完整双链结构的定义为RNA形成的一个茎环双链结构中，存在完美的互补配对碱基也存在非配对碱基形成的bulge(突起)或internal loop(内环)。不完整双链结构以互补配对的碱基数目进行不完整双链结构长度计算，如果其中出现bulge(突起)或internal loop(内环)但其中bulge(突起)或internal loop(内环)的非配对碱基数目小于或等于4个，即认为其仍然是一个不完整双链结构而非多个。

本发明中所述的具有特殊双链结构的环形RNA与具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA指代相同物质。

本发明实施例中所述的具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA均选自circARID1B、circCAMSAP1、circCCNB1、circCNN2、circDHX34、circEPHB4、circEZH2、circFCHO2、circFGFR1、circFKBP8、circKIAA0368、circMBOAT2、circPIP5K1C、circPOLR2A、circPPP1CB、circPROSC、circPTK2、circPVT1、circRELL1、circSDHAF2、circSLC22A23、circSNHG4、circTBCD、circTMEM181、circUIMC1、circVAPB中的任一个或多个。

本发明实施例中所述的具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的促进剂均选自circARID1B促进剂、circCAMSAP1促进剂、circCCNB1促进剂、circCNN2促进剂、circDHX34促进剂、circEPHB4促进剂、circEZH2促进剂、circFCHO2促进剂、circFGFR1促进剂、circFKBP8促进剂、circKIAA0368促进剂、circMBOAT2促进剂、circPIP5K1C促进剂、circPOLR2A促进剂、circPPP1CB促进剂、circPROSC促进剂、circPTK2促进剂、circPVT1促进剂、circRELL1促进剂、circSDHAF2促进剂、circSLC22A23促进剂、circSNHG4促进剂、circTBCD促进剂、circTMEM181促进剂、circUIMC1促进剂和circVAPB促进剂中的一个或多个。

所述环形RNA具体信息如下：

circARID1B(data baseID：HSA_CIRCpedia_54093)，其在基因组上的定位为：6号染色体chr6:157,357,968-157,406,039，相应的线性基因为ARID1B(chr6:157,256,600-157,473,538)，环化序列有286个碱基，包含ARID1B基因的第2个和第3个外显子。

circCAMSAP1(data baseID：HSA_CIRCpedia_63397)，其在基因组上的定位为：9号染色体chr9:13,8773,478-138,774,924，相应的线性基因为CAMSAP1(chr9:138,700,333-138,799,005)，环化序列有425个碱基，包含CAMSAP1基因的第2个和第3个外显子。

circCCNB1(data baseID：HSA_CIRCpedia_52305)，其在基因组上的定位为：5号染色体chr5:68,470,703-68,471,364，相应的线性基因为CCNB1(chr5:68,462,837-68,474,070)，环化序列有378个碱基，包含CCNB1基因的第6个和第7个外显子。

circCNN2(data baseID：HSA_CIRCpedia_24560)，其在基因组上的定位为：19号染色体chr19:1,032,390-1,032,695，相应的线性基因为CNN2(chr19:1,026,274-1,039,067)，环化序列有205个碱基，包含CNN2基因的第3个和第4个外显子。

circDHX34(data baseID：HSA_CIRCpedia_26297)，其在基因组上的定位为：19号染色体chr19:47,865,732-47,865,950，相应的线性基因为DHX34(chr19:47,852,538-47,885,961)，环化序列有218个碱基，包含DHX34基因的第6个外显子。

circEPHB4(data baseID：HSA_CIRCpedia_56001)，其在基因组上的定位为：7号染色体chr7:100,410,368-100,410,830，相应的线性基因为EPHB4(chr7:100,400,187-100,423,148)，环化序列有362个碱基，包含EPHB4基因的第10个和第11个外显子。

circEZH2(data baseID：HSA_CIRCpedia_57174)，其在基因组上的定位为：7号染色体chr7:148,543,561-148,544,397，相应的线性基因为EZH2(chr7:148,504,464-148,581,441)，环化序列有253个碱基，包含EZH2基因的第2个和第3个外显子。

circFCHO2(data baseID：HSA_CIRCpedia_52515)，其在基因组上的定位为：5号染色体chr5:72,370,568-72,373,320，相应的线性基因为FCHO2(chr5:72,251,808-72,386,348)，环化序列有268个碱基，包含FCHO2基因的第19个和第20个外显子。

circFGFR1(data baseID：HSA_CIRCpedia_60993)，其在基因组上的定位为：8号染色体chr8:38,314,873-38,315,052，相应的线性基因为FGFR1(chr8:38,268,656-38,325,363)，环化序列有179个碱基，包含FGFR1基因的第2个外显子。

circFKBP8(data baseID：HSA_CIRCpedia_25189)，其在基因组上的定位为：19号染色体chr19:18,650,180-18,650,530，相应的线性基因为FKBP8(chr19:18,642,561-18,654,387)，环化序列有259个碱基，包含FKBP8基因的第3个和第4个外显子。

circKIAA0368(data baseID：HSA_CIRCpedia_62244)，其在基因组上的定位为：9号染色体chr9:114,148,656-114,154,104，相应的线性基因为KIAA0368(chr9:114,122,972-114,246,637)，环化序列有435个碱基，包含KIAA0368基因的第28个,第29个,第30个和第31个外显子。

circMBOAT2(data baseID：HSA_CIRCpedia_42589)，其在基因组上的定位为：2号染色体chr2:9,083,315-9,098,771，相应的线性基因为MBOAT2(chr2:8,992,820-9,143,942)，环化序列有224个碱基，包含MBOAT2基因的第2个和第3个外显子。

circPIP5K1C(data baseID：HSA_CIRCpedia_25726)，其在基因组上的定位为：19号染色体chr19:3,660,963-3,661,999，相应的线性基因为PIP5K1C(chr19:3,630,179-3,700,477)，环化序列有249个碱基，包含PIP5K1C基因的第4个和第5个外显子。

circPOLR2A(data baseID：HSA_CIRCpedia_22419)，其在基因组上的定位为：17号染色体chr17:7,402,357-7,402,810，相应的线性基因为POLR2A(chr17:7,387,685-7,417,933)，环化序列有336个碱基，包含POLR2A基因的第9个和第10个外显子。

circPPP1CB(data baseID：HSA_CIRCpedia_40659)，其在基因组上的定位为：2号染色体chr2:29,006,772-29,011,675，相应的线性基因为PPP1CB(chr2:28,974,612-29,025,806)，环化序列有224个碱基，包含PPP1CB基因的第5个和第6个外显子。

circPROSC(data baseID：HSA_CIRCpedia_60919)，其在基因组上的定位为：8号染色体chr8:37,623,043-37,623,873，相应的线性基因为PROSC(chr8:37,620,101-37,637,286)，环化序列有220个碱基，包含PROSC基因的第2个,第3个和第4个外显子。

circPTK2(data baseID：HSA_CIRCpedia_60281)，其在基因组上的定位为：8号染色体chr8:141,889,569-141,900,868，相应的线性基因为PTK2(chr8:141,667,999-142,011,332)，环化序列有394个碱基，包含PTK2基因的第3个和第4个外显子。

circPVT1(data baseID：HSA_CIRCpedia_60029)，其在基因组上的定位为：8号染色体chr8:128,902,834-128,903,244，相应的线性基因为PVT1(chr8:128,806,779-129,113,499)，环化序列有410个碱基，包含PVT1基因的第2个外显子。

circRELL1(data baseID：HSA_CIRCpedia_48457)，其在基因组上的定位为：4号染色体chr4:37,633,006-37,640,126，相应的线性基因为RELL1(chr4:37,592,422-37,687,998)，环化序列有434个碱基，包含RELL1基因的第4个,第5个和第6个外显子。

circSDHAF2(data baseID：HSA_CIRCpedia_4841)，其在基因组上的定位为：11号染色体chr11:61,205,096-61,205,585，相应的线性基因为SDHAF2(chr11:61,205,096-61,205,585)，环化序列有334个碱基，包含SDHAF2基因的第2个和第3个外显子。

circSLC22A23(data baseID：HSA_CIRCpedia_54791)，其在基因组上的定位为：6号染色体chr6:3,410,421-3,416,089，相应的线性基因为SLC22A23(chr6:3,269,196-3,457,256)，环化序列有259个碱基，包含SLC22A23基因的第2个和第3个外显子。

circSNHG4(data baseID：HSA_CIRCpedia_50464)，其在基因组上的定位为：5号染色体chr5:138,614,015-138,614,818，相应的线性基因为SNHG4(chr5:138,609,441-138,618,873)，环化序列有161个碱基，包含SNHG4基因的第3个和第4个外显子。

circTBCD(data baseID：HSA_CIRCpedia_22969)，其在基因组上的定位为：17号染色体chr17:80,858,526-80,869,665，相应的线性基因为TBCD(chr17:80,709,940-80,881,609)，环化序列有389个碱基，包含TBCD基因的第17个,第18个,第19个,第20个,第21个和第22个外显子。

circTMEM181(data baseID：HSA_CIRCpedia_54188)，其在基因组上的定位为：6号染色体chr6:159,004,985-159,010,814，相应的线性基因为TMEM181(chr6:158,957,468-159,049,522)，环化序列有324个碱基，包含TMEM181基因的第3个,第4个和第5个外显子。

circUIMC1(data baseID：HSA_CIRCpedia_51249)，其在基因组上的定位为：5号染色体chr5:176,370,335-176,385,155，相应的线性基因为UIMC1(chr5:176,332,006-176,433,409)，环化序列有397个碱基，包含UIMC1基因的第7个,第8个,第9个和第10个外显子。

circVAPB(data baseID：HSA_CIRCpedia_34824)，其在基因组上的定位为：20号染色体chr20:57,014,000-57,016,139，相应的线性基因为VAPB(chr20:56,964,175-57,026,156)，环化序列有258个碱基，包含VAPB基因的第4个和第5个外显子。

在一种实施方式中，所述系统性红斑狼疮治疗药物至少具有以下功用之一：

(1)降低系统性红斑狼疮病人单核细胞的PKR磷酸化水平；(2)下调系统性红斑狼疮病人单核细胞及免疫细胞T细胞中的细胞因子IFN-beta和系统性红斑狼疮诊断基因MX-1，LY-6E，IFIT3的表达量。

所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA促进剂是提高所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA水平的物质。具体的，(1)所述circARID1B促进剂是指提高circARID1B水平的物质；(2)circCAMSAP1促进剂是指提高circCAMSAP1水平的物质；(3)circCCNB1促进剂是指提高circCCNB1水平的物质；(4)circCNN2促进剂是指提高circCNN2水平的物质；(5)circDHX34促进剂是指提高circDHX34水平的物质；(6)circEPHB4促进剂是指提高circEPHB4水平的物质；(7)circEZH2促进剂是指提高circEZH2水平的物质；(8)circFCHO2促进剂是指提高circFCHO2水平的物质；(9)circFGFR1促进剂是指提高circFGFR1水平的物质；(10)circFKBP8促进剂是指提高circFKBP8水平的物质；(11)circKIAA0368促进剂是指提高circKIAA0368水平的物质；(12)circMBOAT2促进剂是指提高circMBOAT2水平的物质；(13)circPIP5K1C促进剂是指提高circPIP5K1C水平的物质；(14)circPOLR2A促进剂是指提高circPOLR2A水平的物质；(15)circPPP1CB促进剂是指提高circPPP1CB水平的物质；(16)circPROSC促进剂是指提高circPROSC水平的物质；(17)circPTK2促进剂是指提高circPTK2水平的物质；(18)circPVT1促进剂是指提高circPVT1水平的物质；(19)circRELL1促进剂是指提高circRELL1水平的物质；(20)circSDHAF2促进剂是指提高circSDHAF2水平的物质；(21)circSLC22A23促进剂是指提高circSLC22A23水平的物质；(22)circSNHG4促进剂是指提高circSNHG4水平的物质；(23)circTBCD促进剂是指提高circTBCD水平的物质；(24)circTMEM181促进剂是指提高circTMEM181水平的物质；(25)circUIMC1促进剂是指提高circUIMC1水平的物质；(26)circVAPB促进剂是指提高circVAPB水平的物质。

具体地，所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA水平可以采用各种化学、物理、生物的方法。包括但不限于：

(1)调节所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA通路以提高所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA水平；

(2)于细胞内直接增加所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA水平。

可通过过表达所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的方式直接增加所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA水平。

具体的，(1)可通过过表达circARID1B的方式提高circARID1B水平；(2)可通过过表达circCAMSAP1的方式提高circCAMSAP1水平；(3)可通过过表达circCCNB1的方式提高circCCNB1水平；(4)可通过过表达circCNN2的方式提高circCNN2水平；(5)可通过过表达circDHX34的方式提高circDHX34水平；(6)可通过过表达circEPHB4的方式提高circEPHB4水平；(7)可通过过表达circEZH2的方式提高circEZH2水平；(8)可通过过表达circFCHO2的方式提高circFCHO2水平；(9)可通过过表达circFGFR1的方式提高circFGFR1水平；(10)可通过过表达circFKBP8的方式提高circFKBP8水平；(11)可通过过表达circKIAA0368的方式提高circKIAA0368水平；(12)可通过过表达circMBOAT2的方式提高circMBOAT2水平；(13)可通过过表达circPIP5K1C的方式提高circPIP5K1C水平；(14)可通过过表达circPOLR2A的方式提高circPOLR2A水平；(15)可通过过表达circPPP1CB的方式提高circPPP1CB水平；(16)可通过过表达circPROSC的方式提高circPROSC水平；(17)可通过过表达circPTK2的方式提高circPTK2水平；(18)可通过过表达circPVT1的方式提高circPVT1水平；(19)可通过过表达circRELL1的方式提高circRELL1水平；(20)可通过过表达circSDHAF2的方式提高circSDHAF2水平；(21)可通过过表达circSLC22A23的方式提高circSLC22A23水平；(22)可通过过表达circSNHG4的方式提高circSNHG4水平；(23)可通过过表达circTBCD的方式提高circTBCD水平；(24)可通过过表达circTMEM181的方式提高circTMEM181水平；(25)可通过过表达circUIMC1的方式提高circUIMC1水平；(26)可通过过表达circVAPB的方式提高circVAPB水平。

调节所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA通路可以是具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA激动剂来提高所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA水平。

提高所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA水平是指使所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA提高。优选地，相比提高前所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA水平提高至少10％，较佳的提高至少30％，再佳的提高至少50％，更佳的提高70％，最佳的提高至少90％。

本发明实施例已证实，通过过表达所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的方式，直接增加细胞内所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA水平后，系统性红斑狼疮病人单核细胞的PKR磷酸化水平显著下降；下调系统性红斑狼疮病人单核细胞(PBMC)及免疫细胞T细胞中的细胞因子IFN-beta和系统性红斑狼疮诊断基因MX-1，LY-6E，IFIT3的表达量。由此推知，前述调节所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA通路的方法亦可获得系统性红斑狼疮病人单核细胞的PKR磷酸化水平显著下降；下调系统性红斑狼疮病人单核细胞(PBMC)及免疫细胞T细胞中的细胞因子IFN-beta和系统性红斑狼疮诊断基因MX-1，LY-6E，IFIT3的表达量。进而认为这些方法亦可治疗系统性红斑狼疮。

所述系统性红斑狼疮治疗药物必然包括所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的促进剂，并以所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的促进剂作为前述功用的有效成分。

所述系统性红斑狼疮治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可以仅为所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的促进剂，亦可包含其他可起到类似功用的分子。

亦即，所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的促进剂为所述系统性红斑狼疮治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。

所述系统性红斑狼疮治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。

所述系统性红斑狼疮治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

所述系统性红斑狼疮治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。

本发明提供的治疗系统性红斑狼疮的方法，为向对象施用有效量的具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的促进剂。

所述对象可以为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。

所述对象可以是罹患系统性红斑狼疮的患者或者期待预防或缓解系统性红斑狼疮的个体。或者可以是罹患系统性红斑狼疮的患者或者期待预防或缓解系统性红斑狼疮的个体的离体系统性红斑狼疮细胞。

所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的促进剂可以在接受系统性红斑狼疮治疗前、中、后向对象施用。

本发明提供的系统性红斑狼疮治疗药物，包括有效剂量的具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的促进剂。

在一种实施方式中，所述系统性红斑狼疮治疗药物，包括有效剂量的所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的促进剂及药用载体。

所述系统性红斑狼疮治疗药物必然包括所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的促进剂，并以所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的促进剂作为前述功用的有效成分。

所述系统性红斑狼疮治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可仅仅为所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的促进剂，亦可包含其他可起到类似功用的分子。

亦即，所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的促进剂为所述系统性红斑狼疮治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。

所述系统性红斑狼疮治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。

所述系统性红斑狼疮治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

所述系统性红斑狼疮治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。

本发明提供的系统性红斑狼疮治疗药物组合，包括有效剂量的具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的促进剂，和至少一种其他系统性红斑狼疮治疗药物。

所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

一)将所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA，所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA促进剂，和其他系统性红斑狼疮治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。

当其他系统性红斑狼疮治疗药物为抗体时，一般采用胃肠外给药型。当其他系统性红斑狼疮治疗药物为化学药物时，给药形式可以比较丰富，可以是胃肠道给药亦可以是非胃肠道给药。一般推荐针对各化学药物的已知给药途径给药。

二)将所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA促进剂和其他系统性红斑狼疮治疗药物配置成复方制剂，在所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA促进剂和其他系统性红斑狼疮治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。

本发明提供的治疗系统性红斑狼疮的方法，为向对象实施具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA促进剂以及向对象施用有效量的其他系统性红斑狼疮治疗药物和/或向对象实施其他系统性红斑狼疮治疗手段。

可以同步地或顺序地给予有效量的所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA促进剂，和至少一种有效量的其他系统性红斑狼疮治疗药物。

基于所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA为本发明首次发现的系统性红斑狼疮治疗靶点，在与述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA促进剂以外的其他系统性红斑狼疮治疗药物联合用药中，至少可以起到疗效相加的效果，进一步增强对于系统性红斑狼疮的治疗效果。

其他系统性红斑狼疮治疗药物包括但不限制于：抗体药物、化学药物或靶向型药物等。

所述述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA促进剂以是胃肠道给药或者胃肠外给药。其他的系统性红斑狼疮治疗药物可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。

本发明实施例提供的所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA和/或具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA促进剂的一个或多个在制备具有以下任一项或多项作用的药物中的用途：

(1)降低系统性红斑狼疮病人单核细胞的PKR磷酸化水平；(2)下调系统性红斑狼疮病人单核细胞(PBMC)及免疫细胞T细胞中的细胞因子IFN-beta和系统性红斑狼疮诊断基因MX-1，LY-6E，IFIT3的表达量。

本发明实施例提供的具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA在制备或筛选系统性红斑狼疮治疗药物中的用途。

在一种实施方式中所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA作为作用靶标。具体的，circARID1B、circCAMSAP1、circCCNB1、circCNN2、circDHX34、circEPHB4、circEZH2、circFCHO2、circFGFR1、circFKBP8、circKIAA0368、circMBOAT2、circPIP5K1C、circPOLR2A、circPPP1CB、circPROSC、circPTK2、circPVT1、circRELL1、circSDHAF2、circSLC22A23、circSNHG4、circTBCD、circTMEM181、circUIMC1和circVAPB中的一个或多个作为作用靶标。

所述用途具体是指：将所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA作为作用对象，对候选物质进行筛选，以找到具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的促进剂作为备选的系统性红斑狼疮治疗药物。

所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的促进剂可以是所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的过表达剂。具体的，(1)所述circARID1B促进剂是circARID1B过表达剂；(2)circCAMSAP1促进剂是circCAMSAP1过表达剂；(3)circCCNB1促进剂是circCCNB1过表达剂；(4)circCNN2促进剂是circCNN2过表达剂；(5)circDHX34促进剂是circDHX34过表达剂；(6)circEPHB4促进剂是circEPHB4过表达剂；(7)circEZH2促进剂是circEZH2过表达剂；(8)circFCHO2促进剂是circFCHO2过表达剂；(9)circFGFR1促进剂是circFGFR1过表达剂；(10)circFKBP8促进剂是circFKBP8过表达剂；(11)circKIAA0368促进剂是circKIAA0368过表达剂；(12)circMBOAT2促进剂是circMBOAT2过表达剂；(13)circPIP5K1C促进剂是circPIP5K1C过表达剂；(14)circPOLR2A促进剂是circPOLR2A过表达剂；(15)circPPP1CB促进剂是circPPP1CB过表达剂；(16)circPROSC促进剂是circPROSC过表达剂；(17)circPTK2促进剂是circPTK2过表达剂；(18)circPVT1促进剂是circPVT1过表达剂；(19)circRELL1促进剂是circRELL1过表达剂；(20)circSDHAF2促进剂是circSDHAF2过表达剂；(21)circSLC22A23促进剂是circSLC22A23过表达剂；(22)circSNHG4促进剂是circSNHG4过表达剂；(23)circTBCD促进剂是circTBCD过表达剂；(24)circTMEM181促进剂是circTMEM181过表达剂；(25)circUIMC1促进剂是circUIMC1过表达剂；(26)circVAPB促进剂是circVAPB过表达剂。

本发明提供具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA用于制备或筛选系统性红斑狼疮检测试剂的用途。

在一种实施方式中，具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA作为生物标志物。

在一种实施方式中，所述系统性红斑狼疮检测试剂用于系统性红斑狼疮的判断、诊断。

需要说明的是，系统性红斑狼疮检测试剂包括但不限于液体形式。

在一种实施方式中，所述系统性红斑狼疮检测试剂选自特异性识别具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的试剂。具体的，是指所述系统性红斑狼疮检测试剂选自(1)特异性识别circARID1B的试剂；(2)特异性识别circCAMSAP1的试剂；(3)特异性识别circCCNB1的试剂；(4)特异性识别circCNN2的试剂；(5)特异性识别的circDHX34试剂；(6)特异性识别circEPHB4的试剂；(7)特异性识别circEZH2的试剂；(8)特异性识别circFCHO2的试剂；(9)特异性识别circFGFR1的试剂；(10)特异性识别circFKBP8的试剂；(11)特异性识别circKIAA0368的试剂；(12)特异性识别circMBOAT2的试剂；(13)特异性识别circPIP5K1C的试剂；(14)特异性识别circPOLR2A的试剂；(15)特异性识别circPPP1CB的试剂；(16)特异性识别circPROSC的试剂；(17)特异性识别circPTK2的试剂；(18)特异性识别circPVT1的试剂；(19)特异性识别circRELL1的试剂；(20)特异性识别circSDHAF2的试剂；(21)特异性识别circSLC22A23的试剂；(22)特异性识别circSNHG4的试剂；(23)特异性识别circTBCD的试剂；(24)特异性识别circTMEM181的试剂；(25)特异性识别circUIMC1的试剂和(26)特异性识别circVAPB的试剂中的一种或多种。

在一种实施方式中，特异性识别具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的试剂为具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的特异性检测引物对。具体的，(1)特异性识别circARID1B的试剂为circARID1B的特异性检测引物对；(2)特异性识别circCAMSAP1的试剂为circCAMSAP1的特异性检测引物对；(3)特异性识别circCCNB1的试剂为circCCNB1的特异性检测引物对；(4)特异性识别circCNN2的试剂为circCNN2的特异性检测引物对；(5)特异性识别的circDHX34试剂为circDHX34的特异性检测引物对；(6)特异性识别circEPHB4的试剂为circEPHB4的特异性检测引物对；(7)特异性识别circEZH2的试剂为circEZH2的特异性检测引物对；(8)特异性识别circFCHO2的试剂为circFCHO2的特异性检测引物对；(9)特异性识别circFGFR1的试剂为circFGFR1的特异性检测引物对；(10)特异性识别circFKBP8的试剂为circFKBP8的特异性检测引物对；(11)特异性识别circKIAA0368的试剂为circKIAA0368的特异性检测引物对；(12)特异性识别circMBOAT2的试剂为circMBOAT2的特异性检测引物对；(13)特异性识别circPIP5K1C的试剂为circPIP5K1C的特异性检测引物对；(14)特异性识别circPOLR2A的试剂为circPOLR2A的特异性检测引物对；(15)特异性识别circPPP1CB的试剂为circPPP1CB的特异性检测引物对；(16)特异性识别circPROSC的试剂为circPROSC的特异性检测引物对；(17)特异性识别circPTK2的试剂为circPTK2的特异性检测引物对；(18)特异性识别circPVT1的试剂为circPVT1的特异性检测引物对；(19)特异性识别circRELL1的试剂为circRELL1的特异性检测引物对；(20)特异性识别circSDHAF2的试剂为circSDHAF2的特异性检测引物对；(21)特异性识别circSLC22A23的试剂为circSLC22A23的特异性检测引物对；(22)特异性识别circSNHG4的试剂为circSNHG4的特异性检测引物对；(23)特异性识别circTBCD的试剂为circTBCD的特异性检测引物对；(24)特异性识别circTMEM181的试剂为circTMEM181的特异性检测引物对；(25)特异性识别circUIMC1的试剂为circUIMC1的特异性检测引物对；(26)特异性识别circVAPB的试剂为circVAPB的特异性检测引物对。

本发明首次研究发现，具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA在系统性红斑狼疮病人的外周血单核细胞中的表达量明显低于正常人。

本发明提供特异性识别具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的试剂在制备系统性红斑狼疮检测试剂盒中的用途。

具体的，所述特异性识别具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的试剂选自(1)特异性识别circARID1B的试剂；(2)特异性识别circCAMSAP1的试剂；(3)特异性识别circCCNB1的试剂；(4)特异性识别circCNN2的试剂；(5)特异性识别的circDHX34试剂；(6)特异性识别circEPHB4的试剂；(7)特异性识别circEZH2的试剂；(8)特异性识别circFCHO2的试剂；(9)特异性识别circFGFR1的试剂；(10)特异性识别circFKBP8的试剂；(11)特异性识别circKIAA0368的试剂；(12)特异性识别circMBOAT2的试剂；(13)特异性识别circPIP5K1C的试剂；(14)特异性识别circPOLR2A的试剂；(15)特异性识别circPPP1CB的试剂；(16)特异性识别circPROSC的试剂；(17)特异性识别circPTK2的试剂；(18)特异性识别circPVT1的试剂；(19)特异性识别circRELL1的试剂；(20)特异性识别circSDHAF2的试剂；(21)特异性识别circSLC22A23的试剂；(22)特异性识别circSNHG4的试剂；(23)特异性识别circTBCD的试剂；(24)特异性识别circTMEM181的试剂；(25)特异性识别circUIMC1的试剂和(26)特异性识别circVAPB的试剂中的一种或多种。

具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA作为生物标志物。

在一种实施方式中，所述系统性红斑狼疮检测试剂盒用于系统性红斑狼疮的判断、诊断。

需要说明的是，所述特异性识别具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的试剂包括但不限于液体形式。

在一种实施方式中，所述特异性识别具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的试剂为具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的特异性检测引物对。具体的，(1)特异性识别circARID1B的试剂为circARID1B的特异性检测引物对；(2)特异性识别circCAMSAP1的试剂为circCAMSAP1的特异性检测引物对；(3)特异性识别circCCNB1的试剂为circCCNB1的特异性检测引物对；(4)特异性识别circCNN2的试剂为circCNN2的特异性检测引物对；(5)特异性识别的circDHX34试剂为circDHX34的特异性检测引物对；(6)特异性识别circEPHB4的试剂为circEPHB4的特异性检测引物对；(7)特异性识别circEZH2的试剂为circEZH2的特异性检测引物对；(8)特异性识别circFCHO2的试剂为circFCHO2的特异性检测引物对；(9)特异性识别circFGFR1的试剂为circFGFR1的特异性检测引物对；(10)特异性识别circFKBP8的试剂为circFKBP8的特异性检测引物对；(11)特异性识别circKIAA0368的试剂为circKIAA0368的特异性检测引物对；(12)特异性识别circMBOAT2的试剂为circMBOAT2的特异性检测引物对；(13)特异性识别circPIP5K1C的试剂为circPIP5K1C的特异性检测引物对；(14)特异性识别circPOLR2A的试剂为circPOLR2A的特异性检测引物对；(15)特异性识别circPPP1CB的试剂为circPPP1CB的特异性检测引物对；(16)特异性识别circPROSC的试剂为circPROSC的特异性检测引物对；(17)特异性识别circPTK2的试剂为circPTK2的特异性检测引物对；(18)特异性识别circPVT1的试剂为circPVT1的特异性检测引物对；(19)特异性识别circRELL1的试剂为circRELL1的特异性检测引物对；(20)特异性识别circSDHAF2的试剂为circSDHAF2的特异性检测引物对；(21)特异性识别circSLC22A23的试剂为circSLC22A23的特异性检测引物对；(22)特异性识别circSNHG4的试剂为circSNHG4的特异性检测引物对；(23)特异性识别circTBCD的试剂为circTBCD的特异性检测引物对；(24)特异性识别circTMEM181的试剂为circTMEM181的特异性检测引物对；(25)特异性识别circUIMC1的试剂为circUIMC1的特异性检测引物对；(26)特异性识别circVAPB的试剂为circVAPB的特异性检测引物对。

本发明提供的系统性红斑狼疮检测试剂盒，所述试剂盒至少包括特异性识别具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的试剂。

在一种实施方式中，具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA作为生物标志物。

在一种实施方式中，所述系统性红斑狼疮检测试剂盒用于系统性红斑狼疮的判断、诊断。

需要说明的是，所述特异性识别具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的试剂包括但不限于液体形式。

在一种实施方式中，所述特异性识别具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的试剂为具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的特异性检测引物对。具体的，(1)特异性识别circARID1B的试剂为circARID1B的特异性检测引物对；(2)特异性识别circCAMSAP1的试剂为circCAMSAP1的特异性检测引物对；(3)特异性识别circCCNB1的试剂为circCCNB1的特异性检测引物对；(4)特异性识别circCNN2的试剂为circCNN2的特异性检测引物对；(5)特异性识别的circDHX34试剂为circDHX34的特异性检测引物对；(6)特异性识别circEPHB4的试剂为circEPHB4的特异性检测引物对；(7)特异性识别circEZH2的试剂为circEZH2的特异性检测引物对；(8)特异性识别circFCHO2的试剂为circFCHO2的特异性检测引物对；(9)特异性识别circFGFR1的试剂为circFGFR1的特异性检测引物对；(10)特异性识别circFKBP8的试剂为circFKBP8的特异性检测引物对；(11)特异性识别circKIAA0368的试剂为circKIAA0368的特异性检测引物对；(12)特异性识别circMBOAT2的试剂为circMBOAT2的特异性检测引物对；(13)特异性识别circPIP5K1C的试剂为circPIP5K1C的特异性检测引物对；(14)特异性识别circPOLR2A的试剂为circPOLR2A的特异性检测引物对；(15)特异性识别circPPP1CB的试剂为circPPP1CB的特异性检测引物对；(16)特异性识别circPROSC的试剂为circPROSC的特异性检测引物对；(17)特异性识别circPTK2的试剂为circPTK2的特异性检测引物对；(18)特异性识别circPVT1的试剂为circPVT1的特异性检测引物对；(19)特异性识别circRELL1的试剂为circRELL1的特异性检测引物对；(20)特异性识别circSDHAF2的试剂为circSDHAF2的特异性检测引物对；(21)特异性识别circSLC22A23的试剂为circSLC22A23的特异性检测引物对；(22)特异性识别circSNHG4的试剂为circSNHG4的特异性检测引物对；(23)特异性识别circTBCD的试剂为circTBCD的特异性检测引物对；(24)特异性识别circTMEM181的试剂为circTMEM181的特异性检测引物对；(25)特异性识别circUIMC1的试剂为circUIMC1的特异性检测引物对；(26)特异性识别circVAPB的试剂为circVAPB的特异性检测引物对。

申请人研究发现在模式细胞人源HeLa细胞中过表达前述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA能够抑制其蛋白激酶PKR以及其下游通路的相关蛋白质激酶的磷酸化激活，然而，过表达circSMARCA5这种不具有特殊双链结构的环形RNA不能抑制其蛋白激酶PKR以及其下游通路的相关蛋白质激酶的磷酸化激活。提示前述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA基因及其表达产物可能成为调控自身免疫疾病中参与天然免疫过程蛋白质PKR及其下游通路的相关蛋白质激酶的磷酸化激活的新途径。

申请人研究发现系统性红斑狼疮病人外周血单核细胞(PBMC)中，前述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA的表达量明显下调。在该原代细胞或免疫细胞T细胞中过表达具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA能够抑制其蛋白激酶PKR的磷酸化激活以及细胞因子IFN-beta和系统性红斑狼疮诊断基因的表达量。提示具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形RNA基因及其表达产物可能成为系统性红斑狼疮诊断和治疗的新途径。

本发明以circPOLR2A为例，对本发明中所述的均具有特殊结构的环形RNA的特性与作用进行说明。

实施例1 circPOLR2A在染色体上的位置图

circPOLR2A在染色体上的位置如图1。其序列是在circexplorer数据库(http://yanglab.github.io/CIRCexplorer/)中获得的。该系统性红斑狼疮环形RNA分子标记物的检测试剂为一对特异性引物，分别为：上游引物：aatcggcctgtcatgggtat(SEQ ID NO：1)；下游引物：aaagtctgcattgtacggagt(SEQ ID NO：2)。该对引物是通过对这些环形RNA的环化位点的研究分析设计的，引物由上海博尚生物有限公司合成。

实施例2使用特异性检测引物检测circPOLR2A在系统性红斑狼疮病人中的表达量

步骤1：获取正常人及系统性红斑狼疮病人外周血单核细胞(PBMC)。

我们从上海市仁济医院获得32例正常人和32例系统性红斑狼疮病人的外周血样本。通过密度梯度离心的方法，分离的到了外周血单核细胞进行后续检测。

步骤2：RNA抽提

首先倒掉培养液，PBS洗两遍细胞，吸干液体。细胞置于冰上，加入Trizol试剂(10cm培养皿加1ml；6cm培养皿加0.5ml；6孔板加0.2ml每空)。液体变粘稠，细胞脱壁，充分吹打至澄清。将细胞裂解液吸入DEPC处理后的EP管中，加入0.2倍体积的氯仿，震动15秒，颠倒数次，室温静置2-3分钟。4℃12000g离心15分钟，可见液体分层：底层-红色酚氯仿相；中间层-粉红色的交接相；上层-无色液相，RNA全部在此相中。小心将上清转移至新的EP管中，切勿将中间层吸入，加入等体积的异丙醇，颠倒数次，室温静置10分钟。4℃12000g离心15分钟，弃上清，在EP管底部可见乳白色小沉淀物，即为RNA。加入1ml75％DEPC-乙醇洗2次。吸干上清，风干10分钟。加入DEPC水20-30μl，混匀，溶解RNA。测浓度：A260/280 1.8-2.0之间，A260/230 2.0左右；A260 0.1-1之间，样品保存于-80℃。

步骤3：反转录获取cDNA

(1)DNase处理RNA，反应体系如下：

37℃反应30分钟，加入1μl stop Buffer，65℃反应10分钟。

(2)每个反应中加入0.5μg随机引物，72℃反应5分钟，冰上放置2分钟。

(3)逆转录反应体系如下：

37℃反应60分钟，72℃反应10分钟。

步骤4：荧光定量Q-PCR

实时定量PCR反应在Biorad realtime PCR仪中完成。反应体系如下：

反应条件如下：

数据按照2^-ΔΔCT方法进行分析(Kenneth J.Livak,Thomas D.Schmittgen.Method,25,2001:402-408.)。

从图2中可以看出，环形RNA circPOLR2A在系统性红斑狼疮病人的外周血单核细胞中的表达量明显低于正常人。利用独立样本T检验(t-test)，其中circPOLR2A环形RNA的P值小于0.05，证明有显著性差异。如图3所示，利用这个环形RNA circPOLR2A做受试者工作特征曲线(ROC曲线)，它们的曲线下面积(AUC)在0.89以上，表明将这种环形RNA作为标志物，对于通过外周血单核细胞样品鉴定系统性红斑狼疮病有非常高的诊断敏感性和诊断特异性。

实施例3 circPOLR2A及同一类25个具有特殊双链结构的环形RNA及不含有特殊双链结构的环形RNA circSMARCA5二级结构示意图

步骤1：获取人源模式研究细胞PA-1卵巢癌细胞系。

步骤2：RNA标记及抽提。

首先倒掉培养液，PBS洗两遍细胞，加入SHAPE反应标记化合物NAI对RNA进行标记，标记10分钟后，吸干液体。细胞置于冰上，加入Trizol试剂(10cm培养皿加1ml；6cm培养皿加0.5ml；6孔板加0.2ml每空)。液体变粘稠，细胞脱壁，充分吹打至澄清。将细胞裂解液吸入DEPC处理后的EP管中，加入0.2倍体积的氯仿，震动15秒，颠倒数次，室温静置2-3分钟。4℃12000g离心15分钟，可见液体分层：底层-红色酚氯仿相；中间层-粉红色的交接相；上层-无色液相，RNA全部在此相中。小心将上清转移至新的EP管中，切勿将中间层吸入，加入等体积的异丙醇，颠倒数次，室温静置10分钟。4℃12000g离心15分钟，弃上清，在EP管底部可见乳白色小沉淀物，即为RNA。加入1ml 75％DEPC-乙醇洗2次。吸干上清，风干10分钟。加入DEPC水20-30μl，混匀，溶解RNA。测浓度：A260/2801.8-2.0之间，A260/230 2.0左右；A260 0.1-1之间，样品保存于-80℃。

步骤3：反转录获取cDNA

(1)DNase处理RNA，反应体系如下：

37℃反应30分钟，加入1μl stop Buffer，65℃反应10分钟。

(2)每个反应中加入0.5μg特定引物，72℃反应5分钟，冰上放置2分钟。

(3)逆转录反应体系如下：

37℃反应60分钟，42℃反应180分钟。将反转录产物进行高通量测序RNA-Seq分析，并解析相应RNA的二级结构，绘制27个环形RNA的二级结构图谱。如图4所示，包括26个具有特殊双链结构的环形RNA和1个不具有特殊双链结构的环形RNA circSMARCA5。

实施例4 pZW1-circPOLR2A载体(Zhang et al.Cell 2014)的构建

circPOLR2A成环区域由PCR方法获得。该线性全序列通过多克隆位点***到pZW1载体，重组质粒通过测序进行鉴定，control阴性对照为未***序列的pZW1空载体。构建好的pZW1-circPOL2A载体序列见SEQ ID NO：3，具体为：

tggaagggctaattcactcccaaagaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattagcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagagaacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatgggatggatgacccggagagagaagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccggagtacttcaagaactgctgatatcgagcttgctacaagggactttccgctggggactttccagggaggcgtggcctgggcgggactggggagtggcgagccctcagatcctgcatataagcagctgctttttgcctgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcgccgaattcacaaatggcagtattcatccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagcagagatccagtttggactagtcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacgcccctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaagcggccgcaccggtctgcagctagctcgagtctagaATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGCACGTAGCAGGCCAGGGCCTCTCTCAGCCACCTGAGCAGAAAGCTTTCCAAGATAGGGCAGGCTGGGTTAGGCCATCTGAGTCTGTCTCGTTCATTGGGATCCAGACTTGACTGTCTTGTTAAAGGCTGTTGCTGCCCAGGTGTGCAGGGAGCTGTTGGTCTCTGGCATTCAGGGTGGGGGTGGTATAAACCCGGGGCAGCTTGCATATGGCAGGGAAGAGGGATCCGTGGAGGAACAGTGCAGAAGGCTTTATGTTCAGAATCTCTCTTGCTTTTCTTCTAGACTGAGTTCCTTGAGATTGGTGAATGCTGTGTATTATTCATCCCTGATAACCTGGTGTTTGGCCCAGGGCCTTGTCCAGAGGAGTGTTTGATAAGTGTTTCAAGTGAATTAGCACCACGATGTCATCTCTTTTCAGTTTACAAAGGACggacaccccctgacccggtctcagaaagcctgaaagcagaattagtcattagaagggtggttggcttggtcggcatagactttgagcagaaagaggttgaaaatgttgagcctgatttctcttaggcccctctgcagtgtctgttgtggaggccagatacgtaactgcttccgctttttttggtctcattcaaggtgagcaaatccccttcatgtttctcaccagacaatgcagctgatgaggttccagctttgcaaatgtagtcatccatgaggactgtcttcctgagatttcatcaggCTCGAGGGACTTGCAAAGGACTTTAGGTCCATTGTCCTTTTATTCTTAGATACCTCTTTCACTGAGACCTTTTCCTTACCTCACCTCTCTAGGTGGAACGGCACATGTGTGATGGGGACATTGTTATCTTCAACCGGCAGCCAACTCTGCACAAAATGTCCATGATGGGGCATCGGGTCCGCATTCTCCCATGGTCTACCTTTCGCTTGAATCTTAGGTCAGTCCCTGGCTGAGGGAAGCAGGCTGGAATTGGTGGGAGGCGGGCAGGCTGGGTGGCTCCTCAAGGTTTCGCTGCAGACATCTTCCCAACCCTGACTTTTCTCTTTAACTGTAGTGTGACAACTCCGTACAATGCAGACTTTGACGGGGATGAGATGAACTTGCACCTGCCACAGTCTCTGGAGACGCGAGCAGAGATCCAGGAGCTGGCCATGGTTCCTCGCATGATTGTCACCCCCCAGAGCAATCGGCCTGTCATGGGTATTGTGCAGGACACACTCACAGCAGTGCGCAAATTCACCAAGAGAGACGTCTTCCTGGA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gaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagcaagctcatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctccccgtggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgacatgattacgaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggatcaactggataactcaagctaaccaaaatcatcccaaacttcccaccccataccctattaccactgccaattacctgtggtttcatttactctaaacctgtgattcctctgaattattttcattttaaagaaattgtatttgttaaatatgtactacaaacttagtagt。

实施例5过表达circPOLR2A及不含有特殊双链结构的环形RNA circSMARCA5后，检测PKR及PKR下游基因的磷酸化水平。

通脂质体lipo2000转染的方法将实施例4制备的pZW1-circPOLR2A及pZW1-circSMARCA5表达载体导入人源HeLa细胞，过表达circPOLR2A及circSMARCA5。12-14小时后，加入模拟病毒双链RNA的刺激化合物poly(I:C)进行免疫刺激，按相应时间点收集细胞，进行Western Blot检测和Q-PCR检测。

如图5所示，过表达circPOLR2A后，HeLa细胞的PKR磷酸化水平及PKR下游基因的磷酸化水平在加入模拟病毒双链RNA的刺激化合物poly(I:C)进行免疫刺激时，显著下降，而过表达circSMARCA5后，HeLa细胞的PKR磷酸化水平及PKR下游基因的磷酸化水平在加入模拟病毒双链RNA的刺激化合物poly(I:C)进行免疫刺激时，并无明显变化。

circPOLR2A及同一类25个环形RNA均具有这类特殊双链结构。通过以上实验结果充分说明，过表达circPOLR2A及同一类25个具有特殊双链结构的环形RNA基因及其表达产物可用于调控参与天然免疫通路的蛋白质PKR磷酸化水平及PKR下游基因的磷酸化水平。

实施例6过表达circPOLR2A后，检测PKR的磷酸化水平及细胞因子IFN-beta和系统性红斑狼疮诊断基因MX-1，LY-6E，IFIT3的表达量

通过密度梯度离心的方法分离系统性红斑狼疮病人单核细胞(PBMC)。用电流刺激转染的方法将实施例4制备的pZW1-circPOLR2A导入该原代细胞，过表达circPOLR2A。12-14小时后，收集细胞，进行Western Blot检测和Q-PCR检测。

如图6所示，过表达circPOLR2A后，相对于只过表达线性的POLR2A，系统性红斑狼疮病人单核细胞的PKR磷酸化水平显著下降。细胞因子IFN-beta的表达量及系统性红斑狼疮诊断基因MX-1，LY-6E，IFIT3的表达量均有所下调。充分说明，circPOLR2A可作为作用靶点，过表达circPOLR2A及同一类25个具有特殊双链结构的环形RNA基因及其表达产物可用于治疗系统性红斑狼疮。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 环形RNA在系统性红斑狼疮制备治疗药物中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aatcggcctg tcatgggtat 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaagtctgca ttgtacggag t 21

<210> 3

<211> 11191

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60

cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120

tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180

ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240

agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300

agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360

ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420

cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480

gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540

tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600

agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 660

cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720

caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780

aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 840

aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 900

caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 960

gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 1020

cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 1080

ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 1140

aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag 1200

tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc 1260

aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg 1320

gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc 1380

cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc 1440

gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct 1500

ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1560

actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca 1620

gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt 1680

aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt 1740

ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta 1800

tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860

actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct 1920

cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga 1980

cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccgaa ttcacaaatg 2040

gcagtattca tccacaattt taaaagaaaa ggggggattg gggggtacag tgcaggggaa 2100

agaatagtag acataatagc aacagacata caaactaaag aattacaaaa acaaattaca 2160

aaaattcaaa attttcgggt ttattacagg gacagcagag atccagtttg gactagtcgt 2220

gaggctccgg tgcccgtcag tgggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc gagaagttgg 2280

ggggaggggt cggcaattga accggtgcct agagaaggtg gcgcggggta aactgggaaa 2340

gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg 2400

cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggtaagtg 2460

ccgtgtgtgg ttcccgcggg cctggcctct ttacgggtta tggcccttgc gtgccttgaa 2520

ttacttccac gcccctggct gcagtacgtg attcttgatc ccgagcttcg ggttggaagt 2580

gggtgggaga gttcgaggcc ttgcgcttaa ggagcccctt cgcctcgtgc ttgagttgag 2640

gcctggcctg ggcgctgggg ccgccgcgtg cgaatctggt ggcaccttcg cgcctgtctc 2700

gctgctttcg ataagtctct agccatttaa aatttttgat gacctgctgc gacgcttttt 2760

ttctggcaag atagtcttgt aaatgcgggc caagatctgc acactggtat ttcggttttt 2820

ggggccgcgg gcggcgacgg ggcccgtgcg tcccagcgca catgttcggc gaggcggggc 2880

ctgcgagcgc ggccaccgag aatcggacgg gggtagtctc aagctggccg gcctgctctg 2940

gtgcctggcc tcgcgccgcc gtgtatcgcc ccgccctggg cggcaaggct ggcccggtcg 3000

gcaccagttg cgtgagcgga aagatggccg cttcccggcc ctgctgcagg gagctcaaaa 3060

tggaggacgc ggcgctcggg agagcgggcg ggtgagtcac ccacacaaag gaaaagggcc 3120

tttccgtcct cagccgtcgc ttcatgtgac tccacggagt accgggcgcc gtccaggcac 3180

ctcgattagt tctcgagctt ttggagtacg tcgtctttag gttgggggga ggggttttat 3240

gcgatggagt ttccccacac tgagtgggtg gagactgaag ttaggccagc ttggcacttg 3300

atgtaattct ccttggaatt tgcccttttt gagtttggat cttggttcat tctcaagcct 3360

cagacagtgg ttcaaagttt ttttcttcca tttcaggtgt cgtgaagcgg ccgcaccggt 3420

ctgcagctag ctcgagtcta gaatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt 3480

gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga 3540

gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa 3600

gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag 3660

ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta 3720

cgtccaggca cgtagcaggc cagggcctct ctcagccacc tgagcagaaa gctttccaag 3780

atagggcagg ctgggttagg ccatctgagt ctgtctcgtt cattgggatc cagacttgac 3840

tgtcttgtta aaggctgttg ctgcccaggt gtgcagggag ctgttggtct ctggcattca 3900

gggtgggggt ggtataaacc cggggcagct tgcatatggc agggaagagg gatccgtgga 3960

ggaacagtgc agaaggcttt atgttcagaa tctctcttgc ttttcttcta gactgagttc 4020

cttgagattg gtgaatgctg tgtattattc atccctgata acctggtgtt tggcccaggg 4080

ccttgtccag aggagtgttt gataagtgtt tcaagtgaat tagcaccacg atgtcatctc 4140

ttttcagttt acaaaggacg gacaccccct gacccggtct cagaaagcct gaaagcagaa 4200

ttagtcatta gaagggtggt tggcttggtc ggcatagact ttgagcagaa agaggttgaa 4260

aatgttgagc ctgatttctc ttaggcccct ctgcagtgtc tgttgtggag gccagatacg 4320

taactgcttc cgcttttttt ggtctcattc aaggtgagca aatccccttc atgtttctca 4380

ccagacaatg cagctgatga ggttccagct ttgcaaatgt agtcatccat gaggactgtc 4440

ttcctgagat ttcatcaggc tcgagggact tgcaaaggac tttaggtcca ttgtcctttt 4500

attcttagat acctctttca ctgagacctt ttccttacct cacctctcta ggtggaacgg 4560

cacatgtgtg atggggacat tgttatcttc aaccggcagc caactctgca caaaatgtcc 4620

atgatggggc atcgggtccg cattctccca tggtctacct ttcgcttgaa tcttaggtca 4680

gtccctggct gagggaagca ggctggaatt ggtgggaggc gggcaggctg ggtggctcct 4740

caaggtttcg ctgcagacat cttcccaacc ctgacttttc tctttaactg tagtgtgaca 4800

actccgtaca atgcagactt tgacggggat gagatgaact tgcacctgcc acagtctctg 4860

gagacgcgag cagagatcca ggagctggcc atggttcctc gcatgattgt caccccccag 4920

agcaatcggc ctgtcatggg tattgtgcag gacacactca cagcagtgcg caaattcacc 4980

aagagagacg tcttcctgga gcgggtgtgt ggtccaaatg gaaacctggc ttaagtgggc 5040

agtggggctc tggggtgcaa ggtggaggct agagaggaag agctgtgttt tttttcctga 5100

cttacccagc agtggtctgt gagattgtct tttctggtgg gcgaacaaaa agggggttag 5160

gaaaactcag gccaaaaaag tgtaaggcgt taattcccca tttaattcct taaaatttca 5220

tgtaatacca ggtattgcct gtaaaggaaa gataaaggga aaaataagta agaccttgtt 5280

aaaattttat ttttctattt taaccttcac ttatttccta attattaaaa gaaatttatg 5340

cttattgtta agaacaaaaa aatttcagta ttacaatgaa tttttaatta aaagtttttg 5400

gcctgatgaa atctcaggaa gacagtcctc atggatgact acatttgcaa agctggaacc 5460

tcatcagctg cattgtctgg tgagaaacat gaaggggatt tgctcacctt gaatgagacc 5520

aaaaaaagcg gaagcagtta cgtatctggc ctccacaaca gacactgcag aggggcctaa 5580

gagaaatcag gctcaacatt ttcaacctct ttctgctcaa agtctatgcc gaccaagcca 5640

accacccttc taatgactaa ttctgctttc aggctttctg agaccgggtc agggggtgtc 5700

cttaaaggtt ggaaaaaact tttcctgtca tctttgcctc caaaatctgg ctttctccct 5760

tgggcaggga aacctcccca acatttctct atcatccctg agatgtgggg cctgcactct 5820

gacttctgtc tgccttactc tttgtcttac aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg 5880

gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg 5940

agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca 6000

actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga 6060

acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc 6120

agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc 6180

agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg 6240

tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtaagga tccctccccc 6300

ccccctaacg ttactggccg aagccgcttg gaataaggcc ggtgtgcgtt tgtctatatg 6360

ttattttcca ccatattgcc gtcttttggc aatgtgaggg cccggaaacc tggccctgtc 6420

ttcttgacga gcattcctag gggtctttcc cctctcgcca aaggaatgca aggtctgttg 6480

aatgtcgtga aggaagcagt tcctctggaa gcttcttgaa gacaaacaac gtctgtagcg 6540

accctttgca ggcagcggaa ccccccacct ggcgacaggt gcctctgcgg ccaaaagcca 6600

cgtgtataag atacacctgc aaaggcggca caaccccagt gccacgttgt gagttggata 6660

gttgtggaaa gagtcaaatg gctctcctca agcgtattca acaaggggct gaaggatgcc 6720

cagaaggtac cccattgtat gggatctgat ctggggcctc ggtgcacatg ctttacatgt 6780

gtttagtcga ggttaaaaaa acgtctaggc cccccgaacc acggggacgt ggttttcctt 6840

tgaaaaacac gatgataata tggccacaca tatggcccag tccaagcacg gcctgaccaa 6900

ggagatgacc atgaagtacc gcatggaggg ctgcgtggac ggccacaagt tcgtgatcac 6960

cggcgagggc atcggctacc ccttcaaggg caagcaggcc atcaacctgt gcgtggtgga 7020

gggcggcccc ttgcccttcg ccgaggacat cttgtccgcc gccttcatgt acggcaaccg 7080

cgtgttcacc gagtaccccc aggacatcgt cgactacttc aagaactcct gccccgccgg 7140

ctacacctgg gaccgctcct tcctgttcga ggacggcgcc gtgtgcatct gcaacgccga 7200

catcaccgtg agcgtggagg agaactgcat gtaccacgag tccaagttct acggcgtgaa 7260

cttccccgcc gacggccccg tgatgaagaa gatgaccgac aactgggagc cctcctgcga 7320

gaagatcatc cccgtgccca agcagggcat cttgaagggc gacgtgagca tgtacctgct 7380

gctgaaggac ggtggccgct tgcgctgcca gttcgacacc gtgtacaagg ccaagtccgt 7440

gccccgcaag atgcccgact ggcacttcat ccagcacaag ctgacccgcg aggaccgcag 7500

cgacgccaag aaccagaagt ggcacctgac cgagcacgcc atcgcctccg gctccgcctt 7560

gccctgaatc gatagatcct aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg 7620

gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt 7680

atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc 7740

tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt 7800

ttgctgacgc aacccccact ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga 7860

ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct 7920

gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat 7980

cgtcctttcc ttggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct 8040

gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc 8100

tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg 8160

cctccccgcc tgagatcctt taagaccaat gacttacaag gcagctgtag atcttagcca 8220

ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg gctaattcac tcccaacgaa gacaagatct 8280

gctttttgct tgtactgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg agctctctgg 8340

ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt 8400

gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt 8460

gtggaaaatc tctagcagta gtagttcatg tcatcttatt attcagtatt tataacttgc 8520

aaagaaatga atatcagaga gtgagaggcc cgggttaatt aaggaaaggg ctagatcatt 8580

cttgaagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa 8640

tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt 8700

tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc 8760

ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc 8820

ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa 8880

aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg 8940

gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag 9000

ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgtg ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc 9060

gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta 9120

cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg 9180

cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca 9240

acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac 9300

caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat 9360

taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg 9420

ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata 9480

aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta 9540

agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa 9600

atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag 9660

tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg 9720

tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact 9780

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ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg 10140

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agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg 10260

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atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct 10380

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ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata 10500

accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca 10560

gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc 10620

gttggccgat tcattaatgc agcaagctca tggctgacta atttttttta tttatgcaga 10680

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cctaggcttt tgcaaaaagc tccccgtggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca 10800

gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact 10860

ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa 10920

acagctatga catgattacg aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt 10980

gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg gatcaactgg ataactcaag 11040

ctaaccaaaa tcatcccaaa cttcccaccc cataccctat taccactgcc aattacctgt 11100

ggtttcattt actctaaacc tgtgattcct ctgaattatt ttcattttaa agaaattgta 11160

tttgttaaat atgtactaca aacttagtag t 11191