阅读说明：本技术 一种莪术中强极性成分的分离制备及分析方法和应用 (Separation preparation and analysis method and application of strong polar components in curcuma zedoary ) 是由 梁鑫淼 相凯婧 周维佳 王纪霞 刘艳芳 于 2019-02-25 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种针对莪术中强极性成分的分离制备及分离分析方法。首先对莪术的极性组分进行制备,以降低样品复杂性。获得极性组分后,使用反相/亲水二维色谱分析方法进行分析：使用极性共聚的反相XAqua C18色谱柱进行第一维分析,酰胺键合的亲水色谱柱XAmide对其进行第二维分析。在发明中,以莪术极性成分为例,开发了二维RPLC×HILIC正交方法,可应用于从植物中分离极性化合物。该方法具有很好的正交性,解决了一般极性化合物在常规色谱填料上的弱保留问题,可以实现莪术中强极性成分的高效制备,为其他天然产物、生物样品以及药物制剂中极性化合物的分离纯化提供了良好的技术方案。(The invention provides a separation preparation and separation analysis method for strong polar components in curcuma zedoary. The polar component of zedoary was prepared first to reduce sample complexity. After obtaining the polar components, analysis was performed using a reverse phase/hydrophilic two-dimensional chromatographic analysis method: the first dimension was performed using a polar copolymerised reversed phase XAqua C18 column, which was subjected to the second dimension by amide-bound hydrophilic column XAmide. In the invention, a two-dimensional RPLC × HILIC orthogonal method is developed by taking the polar component of curcuma zedoary as an example, and the method can be applied to separating polar compounds from plants. The method has good orthogonality, solves the problem of weak retention of common polar compounds on conventional chromatographic packing, can realize high-efficiency preparation of strong polar components in the curcuma zedoary, and provides a good technical scheme for separation and purification of polar compounds in other natural products, biological samples and pharmaceutical preparations.)

一种莪术中强极性成分的分离制备及分析方法和应用

技术领域

本发明涉及莪术中强极性化合物的分离分析或分离制备方法及应用，具体说的是用离线二维的色谱分离方法，利用二维色谱的正交性提高分离度，对极性化合物成分进行分析分离。

本发明方法可用于对莪术极性成分的分离制备以便进行后续活性追踪。

技术背景

传统中药一般使用水煎煮方式服用，溶液中会存在许多极性化合物，这些不同极性的化合物活性作用于不同位置，最终达治疗疾病的作用。实验人员致力于对中药中天然组分的分离分析，以发现其中活性成分，判断作用机制。基于治疗效果在中医中寻找药理活性分子将加速新药物的发现。极性成分的活性作用不应被忽视，因此对中药中极性天然产物的分离显得格外重要。(Y.M,Liu et al.Journal of separation science,32(2009)2871)

高效液相色谱(HPLC)是最有效的分离方法之一。反相液相色谱(RPLC)的固定相通常为颗粒共价键合的烷基链以产生疏水性的技术，对疏水性或极性较小的化合物具有更强的亲和力。在分离极性化合物时，极性化合物容易直接从孔隙中洗脱，最终导致不保留或保留效果差等问题。将反相色谱表面键合极性基团时，对极性化合物的保留可有所改善。亲水作用液相色谱(HILIC)，是通过在硅胶表面键合氨基、酰胺键等极性基团实现，在HILIC中，流动相在极性固定相的表面上形成富含水的层而不是缺水的流动相，与极性较小的化合物相比，极性较大的化合物与固定水层的相互作用更强。一般被用来分离极性化合物如糖、多肽、皂苷等。尽管高效液相色谱(HPLC)是最有效的分离方法之一，但在分析复杂样品时其分离效果受限于色谱柱性能、选择性及峰容量等因素。HILIC分离极性极强化合物揭示了普通RPLC分析中忽略的大量化学信息。然而，极性化合物的复杂性给它们的分离带来了巨大的挑战，超出了单维色谱的能力(Z,Liang et al.Journal of Chromatography A,1224(2012)61)。

二维液相色谱(2D-LC)被认为是一种很有效的分析方法。使用两个具有不同分离机制的色谱柱，可以明显提高分辨率及峰容量(2D-LC峰容量是每个维度的乘积)，又因其良好的正交性被广泛用于天然产物的研究。由于HILIC中的洗脱顺序与RPLC分离中的结果相反，这意味着HILIC适于分析在RPLC中存在不保留或保留效果差等问题的溶质。亲水性溶质在HILIC中的保留增加避免了在RPLC中使用非常低的有机溶剂浓度和离子对添加剂。且高有机改性剂含量为HILIC提供了两个额外的优势：ESI-MS具有高灵敏度，与标准RPLC洗脱液相比，HILIC洗脱液粘度更低，分离速度更快(Y.M,Liu et al.Journal of separationscience,32(2009)2871)。这样，两个维度的不同分离机制会产生良好的正交性。我们将开发这种二维色谱方法对莪术中极性成分进行分析。

莪术是传统中药，广泛分布于我国各地，在民间有广泛使用，其化学成分主要为挥发油和姜黄素类、多糖类、甾醇类、酚酸类、生物碱类等，现代药理学研究表明，莪术具有抗肿瘤、抗血小板聚集、抗血栓、调血脂、抗动脉粥样硬化、抗组织纤维化、抗炎镇痛、抗菌抗病毒、降血糖、抗氧化等多种药理学作用(X.J,Chen et al.Journal of PharmaceuticalResearch,37(2018)664)。很少有报道集中在莪术的极性化合物上，这可能与莪术的极性成分分离纯化困难密切相关。因此，本发明将针对莪术极性成分借助于RPLC和HILIC发展2D-LC的分离分析方法。

发明内容

本发明的目的是提供对莪术中强极性成分的分离分析方法或制备方法的开发。

利用二维色谱良好的正交性及显著提高峰容量的特点，对莪术中极性成分分别进行反相分离与亲水分离，可以使化合物较好的保留并分离，该方法可用于莪术中强极性化合物的分离分析及制备。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：将莪术中的强极性成分分离制备后获得莪术中的强极性成分，然后通过二维RPLC×HILIC正交方法对制备得到的强极性成分进行分离分析。

第一维采用极性反相色谱柱结合第二维亲水色谱柱的二维色谱分析方法分离分析莪术中强极性化合物，流动相为乙腈(A)和水(B)，均添加0.05％-0.1％甲酸，紫外检测器检测波长190-400nm。其中极性反相柱为XAqua C18柱，亲水柱为XAmide柱。色谱操作参数如下：色谱柱内径为2.1-50mm；样品浓度为1mg/mL-140mg/mL；进样量为5μL-9mL；流速为0.2-80mL/min；柱温为30℃。

莪术中的强极性成分分离制备操作步骤为：

所述莪术极性组分的制备方法为：

称取3-10千克的莪术块茎切成片，用其5-20倍量的50-90％乙醇溶液加热回流提取三次，每次回流提取时间为1-3小时，合并提取液后抽滤，在50-70℃真空下旋转蒸发浓缩体积约至5-10升；依次用3-5倍体积正庚烷和乙酸乙酯洗脱旋蒸浓缩液，得到的乙酸乙酯洗脱液在真空下进一步干燥，得到样品；采用体积浓度50％-50％甲醇-水混合溶剂溶解样品至180-220mg/mL的浓度；将溶解后的样品液进行离心，将上清液通过0.45μm膜过滤得到极性馏分，采用Unitary C18柱(50×265mm，7μm，华谱，中国)对该极性馏分进行制备；制备条件为：流动相A为0.05％-0.1％甲酸(v/v)水溶液，B为甲醇，梯度洗脱条件设定如下：0分钟(25％B)-5分钟(30％B)-15分钟(45％B)-40分钟(70％B)-50分钟(95％B)-60分钟(95％B)，进样量8-10mL，流速为70-90mL/min，在波长190-400nm处记录色谱图并收集基于峰的馏分；接取接近“死体积”时间出峰馏分，浓缩备用，完成莪术中的强极性成分分离制备。

二维RPLC×HILIC正交方法对制备得到的强极性成分进行分离分析的方法为：

1)莪术强极性组分先经第一维反相高效液相色谱分离，色谱柱为极性共聚的碳十八柱，洗脱方式为线性梯度洗脱，收集一维制备的馏分；

具体步骤为：制备得莪术强极性组分经第一维极性共聚XAqua C18柱(10×250mm)、XAqua C18柱(4.6×150mm，5μm)、XCharge C18PN柱(4.6×150mm,5μm)、XBridge柱(4.6×150mm,5μm)中的一种进行分离。紫外检测器波长选择为190-400nm，进样50-200μL。流动相由乙腈(A)和水(B)组成，均添加0.05％-0.1％甲酸，梯度洗脱参数：0分钟(0％A)-6分钟(0％A)-13分钟(2％A)-16分钟(8％A)-17分钟(14％A)-20分钟(24％A)-30分钟(40％A)-35分钟(70％A)-40分钟(95％A)-45分钟(95％A)，流速为3-3.5mL/min。根据色谱出峰时间收集馏分，从第3分钟开始，每分钟接取一次馏分，共接取23个一维馏分，氮吹浓缩至1mL以进行第二维亲水色谱分离。

2)莪术一维制备馏分经第二维亲水高效液相色谱分离，流动相由乙腈(A)和水(B)组成，均添加0.05％-0.1％甲酸对馏分进行第二维制备，获得极性化合物二维馏分。

具体步骤为：

1)在由2998光电二极管矩阵检测器(Waters，USA)组成的联合HPLC系统上使用XAmide柱(2.1×250mm，5μm，华谱，中国)、XAmide柱(4.6×150mm，5μm)、Inertsil Diol柱(4.6×150mm，5μm)、BEH Silica柱(4.6×150mm，5μm)中的一种对23个一维馏分进行第二维分析。流动相由乙腈(A)和水(B)组成，均添加0.05％-0.1％甲酸。梯度洗脱条件设置为：0分钟(98％A)-12分钟(98％A)-13分钟(92％A)-30分钟(75％A)-40分钟(50％A)-50分钟(5％A)-55分钟(5％A)。流速为0.2mL/min。在190-400nm处记录色谱图。

本发明的方法可以应用于莪术中强极性成分的分离制备及分离分析中。

该发明优点

提供了莪术中强极性化合物的离线反相/亲水二维色谱分析方法，对反相上保留较弱或者没有保留的化合物提供了很好的分离效果。该方法解决了极性化合物在常规色谱填料上的弱保留问题，可以实现莪术中强极性化合物的高效制备，为其他天然产物、生物样品以及药物制剂中极性化合物的分离纯化提供了良好的技术方案。

附图说明

图1为本发明极性馏分收集色谱图(λ＝254nm)；

图2为本发明反相色谱柱筛选色谱图(λ＝254nm)(a)XAqua C18(b)XCharge C18PN(c)XBridge C18；

图3为本发明反相流动相考察色谱图(λ＝254nm)流动相(a)乙腈(b)甲醇；

图4为本发明一维反相制备色谱图(λ＝254nm)；

图5为本发明亲水色谱柱筛选色谱图(λ＝254nm)(a)XAmide(b)Inertsil Diol(c)BEH Silica；

图6为本发明亲水流动相考察色谱图(λ＝254nm)流动相：(a)不加盐(b)5mM甲酸铵(c)10mM甲酸铵；

图7为本发明莪术23个极性馏分的三维色谱图(λ＝254nm)。

具体实施方式

现结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1：极性馏分的提取和制备

称取5千克的莪术块茎切成片，用10倍量的70％乙醇溶液加热回流提取三次，每次回流提取时间为2小时，合并提取液后抽滤，在60℃真空下旋转蒸发浓缩体积约至5.7升。依次用正庚烷(3×5.7L)和乙酸乙酯(5×5.7L)洗脱旋蒸浓缩液。得到的乙酸乙酯洗脱液在真空下进一步干燥，采用体积浓度50％-50％甲醇-水混合溶剂溶解样品至200mg/mL的浓度。离心，将上清液通过0.45μm膜过滤，采用Unitary C18柱(50×265mm，7μm，华谱，中国)对该极性馏分进行制备。流动相A为0.1％甲酸(v/v)水溶液，B为甲醇。梯度洗脱条件设定如下：0分钟(25％B)-5分钟(30％B)-15分钟(45％B)-40分钟(70％B)-50分钟(95％B)-60分钟(95％B)。进样量9mL，流速为80mL/min。在254nm处记录色谱图并收集基于峰的馏分。接取接近“死体积”时间出峰馏分，浓缩备用，作为莪术的极性成分。收集极性馏分结果见图1。考虑样品的溶解性因素，第一维选择反相分析，第二维选择亲水分析。

实施例2：反相色谱分离条件优化

考察不同反相色谱柱出峰情况：XAqua C18柱(4.6×150mm，5μm)、XCharge C18PN柱(4.6×150mm,5μm)、XBridge柱(4.6×150mm,5μm)。样品：制备得极性馏分。流动相A为0.1％甲酸(v/v)乙腈溶液，B为0.1％甲酸(v/v)水。梯度洗脱设定如下：0分钟(0％A)-6分钟(0％A)-13分钟(2％A)-16分钟(8％A)-17分钟(14％A)-20分钟(24％A)-30分钟(40％A)-35分钟(70％A)-40分钟(95％A)-45分钟(95％A)。流速为1.0mL/min。在254nm处记录色谱图。反相柱筛选结果见图2。反相色谱流动相筛选：梯度条件同上，将流动相更换为A:0.1％甲酸(v/v)甲醇，B：0.1％甲酸(v/v)水。流速为1.0mL/min。在254nm处记录色谱图。结果见图3。色谱图出峰无明显区别，考虑后续二维亲水色谱分析，甲醇为强洗脱溶剂，最终选定流动相为A:0.1％甲酸(v/v)乙腈，B：0.1％甲酸(v/v)水。

实施例3：亲水作用色谱分离条件优化

考察不同亲水色谱柱出峰情况：XAmide柱(4.6×150mm，5μm)、Inertsil Diol柱(4.6×150mm，5μm)、BEH Silica柱(4.6×150mm，5μm)。梯度洗脱设定如下：0分钟(98％A)-12分钟(98％A)-13分钟(92％A)-30分钟(75％A)-40分钟(50％A)-50分钟(5％A)-55分钟(5％A)。流速为1.0mL/min。在254nm处记录色谱图。亲水柱筛选结果见图5。亲水色谱流动相筛选：考察流动相添加不同浓度盐条件下，亲水色谱分离情况，流动相A:0.1％甲酸(v/v)乙腈，B：0.1％甲酸(v/v)水，C：100mM甲酸铵。在254nm下记录5mM甲酸铵(C:5％)、10mM甲酸铵(C:10％)条件下色谱图。结果见图6。

实施例4：莪术极性成分的一维反相色谱分离

制备得莪术强极性组分经第一维极性共聚XAqua C18柱(10×250mm)进行分离制备。检测器波长选择为254nm，进样100μL。流动相为权利要求1中所述流动相。梯度洗脱参数：0分钟(0％A)-6分钟(0％A)-13分钟(2％A)-16分钟(8％A)-17分钟(14％A)-20分钟(24％A)-30分钟(40％A)-35分钟(70％A)-40分钟(95％A)-45分钟(95％A)。流速为3.3mL/min。一维制备结果见图4。根据色谱出峰时间收集馏分，从第3分钟开始，每分钟接取一次馏分，共接取23个一维馏分。氮吹浓缩至1mL以进行第二维亲水色谱分离。

实施例5：莪术极性成分的二维亲水作用色谱分离分析

活性级分由2998光电二极管矩阵检测器(Waters，USA)组成的联合HPLC系统，在XAmide柱(2.1×150mm，5μm)上进行进行二维HPLC分析。流动相A:0.1％甲酸(v/v)乙腈，B：0.1％甲酸(v/v)水。梯度洗脱设定如下：0分钟(98％A)-12分钟(98％A)-13分钟(92％A)-30分钟(75％A)-40分钟(50％A)-50分钟(5％A)-55分钟(5％A)。流速为0.2mL/min。在254nm处记录色谱图。结果见图7。