阅读说明：本技术 特拉万星的纯化方法 (Purification method of telavancin ) 是由 贺元康 王艺 于 2019-11-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种特拉万星的纯化方法。包括如下步骤：将特拉万星粗品加入溶剂中,充分溶解后过滤并保留滤液,得到上样液；将上样液上样至已装填有填料的分离柱,用以分离上样液中的目标组分和杂质组分,上样之后的填料中保留有目标组分；采用洗脱液对填料中的目标组分进行洗脱,得到目标流出液,洗脱液为有机溶剂与水的混合液或者有机溶剂；以及收集目标流出液,即得纯化后的特拉万星。本发明的上述特拉万星的纯化方法无需经过萃取、柱层析、结晶等步骤,工艺简单,生产成本较低,整体有利于应用。经试验证明,采用本发明的特拉万星的纯化方法得到的特拉万星纯品的纯度大于99％,单杂小于0.5％,周期短,具有较好的可行性与实用性,适合工业化生产。(The invention relates to a purification method of telavancin. The method comprises the following steps: adding the crude telavancin into a solvent, fully dissolving, filtering and retaining filtrate to obtain a sample solution; loading the sample loading liquid to a separation column filled with a filler to separate a target component and an impurity component in the sample loading liquid, wherein the target component is remained in the filler after the sample loading; eluting the target component in the filler by using an eluent to obtain a target effluent liquid, wherein the eluent is a mixed liquid of an organic solvent and water or the organic solvent; and collecting the target effluent to obtain the purified telavancin. The purification method of telavancin does not need steps of extraction, column chromatography, crystallization and the like, has simple process and lower production cost, and is integrally beneficial to application. Tests prove that the purity of the purified telavancin product obtained by the purifying method of telavancin is more than 99%, the single impurity content is less than 0.5%, the period is short, and the method has good feasibility and practicability and is suitable for industrial production.)

特拉万星的纯化方法

技术领域

本发明涉及药物领域，特别是涉及一种特拉万星的纯化方法。

背景技术

特拉万星(Telavancin)是美国施万(Theravance)公司和日本安斯泰来(Astellas)制药公司研发的一种新型脂糖肽类抗生素。化学名为N-3”-2-(癸基氨基)乙基-29-[(N-膦酰基甲基)氨甲基]万古霉素盐酸盐。2009年在美国上市，适用于由革兰阳性菌引起的成人复杂性皮肤感染。2011年欧盟增加了使用症，用于治疗已确诊或疑似由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)引起的成人医院获得性肺炎以及呼吸机相关性肺炎。特拉万星是第二代半合成脂糖肽类抗生素，特拉万星的药物母核为万古霉素。相对于万古霉素，特拉万星是在万古霉素糖胺上连接有疏水性基团癸基氨基乙基，这有利于增加其对细菌细胞膜的亲和力有利于锚向膜、延长半衰期以及增加对肠球菌的抗菌活力；而在第7位氨基酸的酰基位上连接了磷酸氨基，增加了水溶性，促进体内组织代谢和清除，减少肾毒性，改善药物在体内的药动学性质。作为新型脂糖肽类抗生素，特拉万星独特的作用机制和良好的临床治疗效果，可以预见其将有广阔的市场前景。

特拉万星的纯度不够，需要进一步纯化。然而，传统的特拉万星的纯化方法比较繁琐，需要经过萃取、柱层析、结晶等步骤，比较耗时，导致成本较高，且工业放大生产困难，不利于应用。

发明内容

基于此，有必要针对特拉万星纯化步骤较繁琐的问题，提供一种工艺简单且纯度较高的特拉万星的纯化方法。

一种特拉万星的纯化方法，包括如下步骤：

将特拉万星粗品加入溶剂中，充分溶解后过滤并保留滤液，得到上样液；

将所述上样液上样至已装填有填料的分离柱，用以分离所述上样液中的目标组分和杂质组分，上样之后的填料中保留有所述目标组分；

采用洗脱液对所述填料中的所述目标组分进行洗脱，得到目标流出液，其中，所述洗脱液为有机溶剂与水的混合液或者有机溶剂；以及收集所述目标流出液，即得纯化后的特拉万星。

与传统的特拉万星的纯化方法相比，本发明的上述特拉万星的纯化方法，只需将上样液上样至分离柱，然后进行洗脱并保留目标流出液，收集即得纯化后的特拉万星。而无需经过萃取、柱层析、结晶等步骤。因此，本发明的特拉万星的纯化方法工艺简单，生产成本较低，整体有利于应用。此外，经试验证明，采用本发明的特拉万星的纯化方法得到的特拉万星纯品的纯度大于99％，单杂小于0.5％，周期短，具有较好的可行性与实用性，非常适合工业化生产。

在其中一个实施例中，将特拉万星粗品加入溶剂中的操作中，所述溶剂为含有机酸体积分数0.05％～0.5％的甲醇水溶液与含有机酸体积分数0.05％～0.5％的乙腈水溶液中的一种或几种；其中，所述有机酸为三氟乙酸、甲酸与乙酸中的一种或几种；所述溶剂中甲醇或者乙腈的体积分数分别为20％～50％。

在其中一个实施例中，所述填料以硅胶为基质，且硅胶上键合十八烷基硅烷和二乙烯基苯，其中，十八烷基硅烷和二乙烯基苯的质量比为(1～6):1。

在其中一个实施例中，所述填料的粒径为10μm～50μm，所述填料的孔径为

在其中一个实施例中，将所述上样液上样至已装填有填料的分离柱的操作中，所述上样液中的溶质与所述填料的质量比为1:100～11:100。

在其中一个实施例中，将所述上样液上样至已装填有填料的分离柱的步骤之前，还包括以下步骤：采用洗脱液对已装填有填料的分离柱进行平衡。

在其中一个实施例中，所述洗脱液为含有机酸体积分数0.05％～0.5％的甲醇水溶液与含有机酸体积分数0.05％～0.5％的乙腈水溶液中的一种或几种；其中，所述有机酸为三氟乙酸、甲酸与乙酸中的一种或几种；所述溶剂中甲醇或者乙腈的体积分数分别为20％～50％。

在其中一个实施例中，采用洗脱液对所述目标组分进行洗脱的操作中，所述洗脱液的流速为100cm/h～500cm/h。

在其中一个实施例中，分段收集所述目标流出液的步骤之后，还包括以下步骤：对所述目标流出液进行检测，对检测后的合格样品进行冻干。

在其中一个实施例中，所述特拉万星粗品的纯度为70％～90％。

附图说明

图1为本发明一实施方式的特拉万星的纯化方法的流程图；

图2为本发明实施例1的对特拉万星粗品纯化后的高效液相色谱图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

请参见图1，本发明一实施方式的特拉万星的纯化方法，包括如下步骤：

S10、将特拉万星粗品加入溶剂中，充分溶解后过滤并保留滤液，得到上样液。

优选地，特拉万星粗品的纯度为70％～90％。也就是说，本发明的特拉万星的纯化方法能够应用于纯度为70％～90％的特拉万星粗品，且经过试验证明，纯化效果较好。

优选地，将特拉万星粗品加入溶剂中的操作中，溶剂为含有机酸体积分数0.05％～0.5％的甲醇水溶液与含有机酸体积分数0.05％～0.5％的乙腈水溶液中的一种或几种；其中，所述有机酸为三氟乙酸、甲酸与乙酸中的一种或几种；所述溶剂中甲醇或者乙腈的体积分数分别为20％～50％。这几类溶剂易得，成本低，不会与特拉万星反应或者产生不良影响，且后续容易去除。

S20、将步骤S10得到的上样液上样至已装填有填料的分离柱，用以分离上样液中的目标组分和杂质组分，上样之后的填料中保留有目标组分。

其中，分离柱为制备液相色谱柱。填料为特拉万星专用填料。

优选地，填料以硅胶为基质，且硅胶上键合十八烷基硅烷和二乙烯基苯，其中，十八烷基硅烷和二乙烯基苯的质量比为(1～6):1。

更优地，填料的粒径为10μm～50μm，填料的孔径为

优选地，将上样液上样至已装填有填料的分离柱的操作中，上样液中的溶质与填料的质量比为1:100～11:100。

优选地，将上样液上样至已装填有填料的分离柱的步骤之前，还包括以下步骤：采用洗脱液对已装填有填料的分离柱进行平衡，等待基线走平后才开始上样。

S30、采用洗脱液对步骤S20填料中的目标组分进行洗脱，得到目标流出液，其中，洗脱液为有机溶剂与水的混合液或者有机溶剂。

优选地，洗脱液为含有机酸体积分数0.05％～0.5％的甲醇水溶液与含有机酸体积分数0.05％～0.5％的乙腈水溶液中的一种或几种；其中，所述有机酸为三氟乙酸、甲酸与乙酸中的一种或几种；所述溶剂中甲醇或者乙腈的体积分数分别为20％～50％。这些种类的洗脱液易得，成本低，不会与特拉万星反应或者产生不良影响，且后续容易去除。

优选地，采用洗脱液对目标组分进行洗脱的操作中，洗脱液的流速为100cm/h～500cm/h；更优选地，洗脱液流速为200cm/h～400cm/h；最优地，洗脱流速为300cm/h。

S40、收集步骤S30得到的目标流出液，即得纯化后的特拉万星。

优选地，分段收集目标流出液的步骤之后，还包括以下步骤：对目标流出液进行检测，对检测后的合格样品进行冻干。

与传统的特拉万星的纯化方法相比，本发明的上述特拉万星的纯化方法，只需将上样液上样至分离柱，然后进行洗脱并保留目标流出液，收集即得纯化后的特拉万星。而无需经过萃取、柱层析、结晶等步骤。因此，本发明的特拉万星的纯化方法工艺简单，生产成本较低，整体有利于应用。此外，经试验证明，采用本发明的特拉万星的纯化方法得到的特拉万星纯品的纯度大于99％，单杂小于0.5％，周期短，具有较好的可行性与实用性，非常适合工业化生产。

下面结合具体实施例和对比例对本发明的特拉万星的纯化方法进行进一步的说明。

实施例1～8中使用的分离柱为：特拉万星制备柱(100mm x 250mm；所用填料为以硅胶为基质，硅胶上键合十八烷基硅烷和二乙烯基苯。其中，十八烷基硅烷和二乙烯基苯的质量比为(1～6):1)。

实施例1

1、样品称取：在分析天平上称取特拉万星粗品40g；

2、溶剂配制：配制含0.1vol％甲酸的30vol％甲醇水溶液400ml，具体操作为：甲醇量取120ml，纯化水量取380ml，移液枪量取400ul甲酸，将三者混合在一起，并搅拌均匀，配制两份，备用；

3、样品溶解：将步骤2配好的溶剂一份加到步骤1的40g特拉万星粗品中，用保鲜膜封口，加入搅拌子，在磁力搅拌器上保持搅拌状态，使其充分溶解；

4、色谱柱平衡：在LC6000仪器上，A通道为0.1％甲酸水溶液，B通道为甲醇(含0.1％甲酸)，在接通特拉万星制备柱的条件下，以400ml/min(即300cm/h线性流速换算而来)的流速冲洗，以70％A(280ml/min)、30％B(120ml/min)平衡柱子，平衡时间为15min；

5、样品上样：步骤4完成后停止所有泵，将A管道***配好溶剂的另一份中，以400ml/min的速度冲洗A管道，0.5min后停泵；将A管道换到配好的特拉万星粗品中，以400ml/min的速度上样1min后停泵，换到步骤2剩下的溶剂中，以400ml/min冲洗0.5min后停泵；

6、样品洗脱：在步骤5完成后将A泵换到纯水中，同时开启制备工作站的在线信号记录，在400ml/min的条件下以30％B(120ml/min)冲洗柱子；

7、样品收集：在见到目标峰出现时开始收集样品，3min收集一次，一共接收10次；如图2所示，收集保留时间为36min～66min的组分；

8、收集样品分析：收集样品在分析柱GP-C18(粒径为5μm，孔径为

)上分析；

9、样品分析合并：取样经过HPLC(高效液相色谱法)检测后收集所有合格组分，合并后真空冷冻冻干。纯化后样品为30.48g，纯度为99.17％，单杂小于0.5％，回收率为76.20％。

实施例2

取特拉万星粗品40g，含量80.09％(m/m)，加入含0.1％三氟乙酸的25％乙腈(V/V)400ml，搅拌使充分溶解。上样至经过含0.1％三氟乙酸的25％乙腈平衡后的特拉万星制备柱，上样流速200ml/min。上样后用含0.1％三氟乙酸的25％乙腈洗脱，洗脱流速400ml/min，共洗脱100min。HPLC检测收集特拉万星组分溶液，合并合格组分，冻干后即得特拉万星纯品30.87g。HPLC检测纯度为99.22％，单杂小于0.5％，回收率77.18％。

实施例3

取特拉万星粗品40g，含量80.09％(m/m)，加入0.1％甲酸的25％乙腈(V/V)400ml，搅拌使充分溶解。上样至经过0.1％甲酸的25％的乙腈平衡后的特拉万星制备柱，上样流速200ml/min。上样后用25％乙腈洗脱，洗脱流速400ml/min，共洗脱100min。HPLC检测收集特拉万星组分溶液，合并合格组分，冻干后即得特拉万星纯品31.27g。HPLC检测纯度为99.09％，单杂小于0.5％，回收率78.18％。

实施例4

取特拉万星粗品40g，含量80.09％(m/m)，加入0.1％三氟乙酸的30％甲醇(V/V)400ml，搅拌使充分溶解。上样至经过含0.1％三氟乙酸的30％的甲醇平衡后的特拉万星制备柱，上样流速200ml/min。上样后用30％甲醇(含0.1％三氟乙酸)洗脱，洗脱流速400ml/min，共洗脱100min。HPLC检测收集特拉万星组分溶液，合并合格组分，冻干后即得特拉万星纯品31.51g。HPLC检测纯度为99.15％，单杂小于0.5％，回收率78.78％。

实施例5

取特拉万星粗品78.1g(填料重量的11％)，含量85.25％(m/m)，加入0.1％甲酸的30％甲醇(V/V)400ml，搅拌使充分溶解。上样至经过含0.1％甲酸的30％的甲醇平衡后的特拉万星制备柱，上样流速200ml/min。上样后用30％甲醇(含0.1％甲酸)洗脱，洗脱流速400ml/min，共洗脱100min。HPLC检测收集特拉万星组分溶液，合并合格组分，冻干后即得特拉万星纯品53.81g。HPLC检测纯度为99.19％，单杂小于0.5％，回收率75.79％。

实施例6

取特拉万星粗品78.1g(填料重量的11％)，含量80.09％(m/m)，加入0.1％甲酸的30％甲醇(V/V)400ml，搅拌使充分溶解。上样至经过含0.1％甲酸的30％的甲醇平衡后的特拉万星制备柱，上样流速200ml/min。上样后用30％甲醇(含0.1％甲酸)洗脱，洗脱流速400ml/min，共洗脱100min。HPLC检测收集特拉万星组分溶液，合并合格组分，冻干后即得特拉万星纯品24.35g。HPLC检测纯度为99.03％，单杂小于0.5％，回收率31.18％。

实施例7

取特拉万星粗品40g，含量80.09％(m/m)，加入0.1％甲酸的55％甲醇(V/V)400ml，搅拌使充分溶解。上样至经过含0.1％甲酸的55％的甲醇平衡后的特拉万星制备柱，上样流速200ml/min。上样后用55％甲醇(含0.1％甲酸)洗脱，洗脱流速400ml/min，共洗脱100min。HPLC检测收集特拉万星组分溶液，合并合格组分，冻干后即得特拉万星纯品13.57g。HPLC检测纯度为99.08％，单杂小于0.5％，回收率33.93％。

实施例8

取特拉万星粗品40g，含量80.09％(m/m)，加入0.1％三氟乙酸的55％乙腈(V/V)400ml，搅拌使充分溶解。上样至经过含0.1％三氟乙酸的55％的乙腈平衡后的特拉万星制备柱，上样流速200ml/min。上样后用55％乙腈(含0.1％三氟乙酸)洗脱，洗脱流速400ml/min，共洗脱100min。HPLC检测收集特拉万星组分溶液，合并合格组分，冻干后即得特拉万星纯品12.96g。HPLC检测纯度为99.12％，单杂小于0.5％，回收率32.40％。

对比例1

取40g特拉万星粗品，含量80.09％(m/m)，加入240ml甲醇—甲酸—水溶液(体积比为2：1：1)搅拌均匀后过滤，滤液过层析柱纯化。层析介质为萘基键合硅胶，重量2600g，用pH值为2.4、含0.04mol/L磷酸二氢铵的20％乙醇，以2BV/h的流速进行洗脱。收集纯度95％以上组分进行浓缩，并在浓缩过程中加入pH值为4.0的盐酸水溶液去除缓冲盐，浓缩至原体积的1/10。将浓缩液加热至45℃，加入7倍体积的乙醇后搅拌均匀，然后再加入0.9倍体积的***，搅拌降温至5℃，过滤后用乙醇—***—水溶液(体积比4：2：1)洗涤数次后得特拉万星纯品20.12g。检测所得纯品，特拉万星纯品纯度为98.83％，收率50.30％。

将实施例1的特拉万星纯品与对比例1的特拉万星纯品进行对比，数据对比如表1所示：

表1

	液相纯度(％)	回收率(％)	耗时
				实施例1	99.17	76.20	2h
对比例1	98.83	50.30	6h

通过表1可以看出：

(1)本发明实施例1的特拉万星的纯化方法得到的特拉万星纯品的液相纯度高达99.17％，比对比例1的特拉万星纯品高出0.34，表明本发明实施例1的特拉万星的纯化方法能够得到纯度更高的特拉万星；

(2)本发明实施例1的特拉万星的纯化方法得到的特拉万星纯品的回收率高达76.20％，比对比例1的特拉万星纯品高出25.90，表明本发明实施例1的特拉万星的纯化方法的回收率更高；

(3)本发明实施例1的特拉万星的纯化方法只需耗时2h，是对比例1的特拉万星纯品的纯化方法耗时的三分之一，表明本发明实施例1的特拉万星的纯化方法耗时更短。

此外，通过对比本发明的实施例1～8与对比例1，还可以得到以下结论：

(1)经试验证明，本发明实施例1～8的特拉万星的纯化方法得到的特拉万星的纯度均为99％以上；

(2)经试验证明，实施例1～5的特拉万星的纯化方法得到的特拉万星的回收率均大于75％；

(3)将实施例5与实施例6进行对比，可以看出：上样液中的溶质与所述填料的质量比超过11:100时，纯化效果(收率)有可能会下降，因此纯化上样载量优选的为上样液中的溶质与填料的质量比优选为1:100～11:100。

(4)将实施例1～4与实施例7、8进行对比，可以看出：当溶剂与洗脱液中有效组分的体积分数为20％～50％时，得到的特拉万星纯品的回收率较高。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。