阅读说明：本技术 一种超高效液相色谱-串联质谱测定水产品中三嗪类除草剂残留的方法 (Method for determining triazine herbicide residue in aquatic product by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry ) 是由 彭婕 何力 居小倩 甘金华 陈建武 于 2020-07-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种超高效液相色谱-串联质谱测定水产品中三嗪类除草剂残留的方法,包括如下步骤：1、配制混合标准溶液；2、UPLC分析检测；3、HESI-MS/MS分析检测；4、建立标准曲线；5、水产样品的前处理；6、待检测样品的检测。该方法简单,能快速准确检测水产品中三嗪类除草剂的残留量,基质干扰少,测定结果准确。(The invention discloses a method for determining triazine herbicide residue in an aquatic product by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, which comprises the following steps: 1. preparing a mixed standard solution; 2. UPLC analysis and detection; 3. HESI-MS/MS analysis detection; 4. establishing a standard curve; 5. pretreatment of aquatic product samples; 6. and (5) detecting the sample to be detected. The method is simple, can quickly and accurately detect the residual quantity of the triazine herbicide in the aquatic product, has less matrix interference and accurate determination result.)

一种超高效液相色谱-串联质谱测定水产品中三嗪类除草剂 残留的方法

技术领域

本发明涉及水产品中农药残留的理化检验技术领域，具体涉及一种超高效液相色谱- 串联质谱测定水产品中三嗪类除草剂残留的方法。

背景技术

三嗪类除草剂(Triazine herbicides)是一类通过抑制植物光合作用而发挥作用的高效选择性除草剂，早在20世纪50年代就已开始使用。这类除草剂被广泛应用于各种草害的防治，用量大、性质稳定、持效期长，对人类健康和环境造成的危害越来越为人们关注。据报道，这类化合物可能引起人类癌症及先天性缺陷，同时能够干扰荷尔蒙的正常功能，世界多国已将其列入内分泌干扰剂化合物名单。目前，三嗪类除草剂残留的检测主要集中在谷物、蔬菜和环境样品中，而对于水产品中三嗪类除草剂残留的检测方法相对较少。

现有技术中，水产品中三嗪类除草剂残留检测主要采用的技术方法分为两部分：样品前处理和仪器分析测定，其中样品前处理多采用固相萃取小柱净化，净化步骤繁琐，且耗时；仪器分析测定报道较多的是气相色谱串联质谱法(GC-MS/MS)，但是气相色谱串联质谱法的稳定性和准确度较差。

发明内容

为了解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种超高效液相色谱-串联质谱测定水产品中三嗪类除草剂残留的方法，该方法简单，能快速准确检测水产品中三嗪类除草剂的残留量，基质干扰少，测定结果准确。

实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

一种超高效液相色谱-串联质谱测定水产品中三嗪类除草剂残留的方法，包括如下步骤

1、配制混合标准溶液：

配制N份梯度浓度的混合标准溶液，每份混合标准溶液中含有的三嗪类除草剂的种类相同，且每份混合标准溶液中各三嗪类除草剂的浓度相同，各混合溶液中含内标物莠去津-D₅，各混合标准溶液中内标物莠去津-D₅的浓度相同，内标物莠去津-D₅的浓度在各三嗪类除草剂的梯度浓度范围内；

2、UPLC分析检测：

将各混合标准溶液分别进行UPLC分析检测，UPLC条件如下：

色谱柱采用C₁₈色谱柱，流动相采用有机相和水相的混合液，有机相为乙腈，水相为0.1wt％甲酸溶液，流动相流速为0.3-0.4mL/min，流动相采用梯度洗脱的方式进行洗脱；

3、HESI-MS/MS分析检测：

HESI-MS/MS分析检测条件如下：

离子源为加热大气压电喷雾源，正离子模式扫描，选择反应监测模式测定，喷雾电压3000-4000V，蒸发温度300-350℃，离子传输毛细管温度300-350℃，鞘气流速20-40 L/min，辅助气为5-15L/min，碰撞气及压力：氩气纯度≥99.999，2.0mTorr，Q1的半峰宽为0.7，Q3的半峰宽为0.7；

经HESI-MS/MS分析检测后，可以得到各浓度下各三嗪类除草剂的子离子峰面积与内标物莠去津-D₅子离子峰面积的比值；

4、建立标准曲线：

以各三嗪类除草剂的浓度为横坐标，各浓度下各三嗪类除草剂的子离子峰面积与内标物莠去津-D₅子离子峰面积的比值为纵坐标，根据各三嗪类除草剂检测的数据进行绘图，拟合后得到各三嗪类除草剂的标准曲线，从而得到各三嗪类除草剂的标准曲线的函数关系式；

5、水产样品的前处理：

取均质的水产动物的肌肉样品，加入内标物莠去津-D₅，依次加入乙腈、氯化钠和无水硫酸镁，涡旋振荡，离心后取上清液，重复提取并合并上清液，将合并后所得的上清液蒸干，残渣用溶剂溶解，再加入净化剂，所述的净化剂为乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、十八烷基硅烷键合硅胶(C₁₈)和EMR-Lipid粉的混合物，涡旋振荡后离心，将所得的上清液用微孔滤膜过滤，得到待检测样品；

6、待检测样品的检测：

将待检测样品按照步骤2-3的方法进行分析检测，得到各三嗪类除草剂的子离子峰面积与内标物莠去津-D₅子离子峰面积的比值，将各三嗪类除草剂的子离子峰面积与内标物莠去津-D₅子离子峰面积的比值代入对应的三嗪类除草剂的标准曲线的函数关系中，得到对应的三嗪类除草剂的浓度。

进一步，所述的色谱柱的柱长100mm，内径为2.1mm，填充粒径为1.7μm，柱温为30℃。

进一步，所述梯度洗脱的条件为：

第一阶段：洗脱时间为0-2min，其中有机相的体积百分含量为15-25％，水相的体积百分含量为75-85％；

第二阶段：洗脱时间为3-5min，其中有机相的体积百分含量从15-25％逐渐增加至90-95％，水相的体积百分含量从75-85％逐渐减少至5-10％；

第三阶段：洗脱时间为2-3min，其中有机相的体积百分含量为90-95％，水相的体积百分含量为5-10％；

第四阶段：洗脱时间为0.1-0.5min，其中有机相的体积百分含量从90-95％逐渐减少至15-25％，水相的体积百分含量从5-10％逐渐增加至75-85％；

第五阶段：洗脱时间为1.5-4min，其中有机相的体积百分含量为15-25％，水相的体积百分含量为75-85％。

进一步，步骤5中，溶剂为甲醇或乙腈。

进一步，所述的微孔滤膜为有机微孔滤膜，其孔径不大于0.22μm。

与现有技术相比，本发明的优点与有益效果在于：

1、本发明采用QuEChERS方法来净化样品，大大缩短了每个水产品样品净化的时间，同时摒弃了常规净化剂，采用了特殊的净化剂，明显减少了基质的干扰，提高了灵敏度和准确度，能够准确反应水产品中三嗪类除草剂残留情况。

2、本发明采用内标法，采用特殊的内标物莠去津-D₅，相比较普通的外标法，能够消除由于仪器、操作条件的波动而对分析结果产生的影响，从而提高测量的精密度，提高结果的准度度和可靠性。

附图说明

图1是采用实施例1和对比例1回收空白草鱼肌肉组织中添加浓度为20μg/kg的11种三嗪类除草剂的结果比较图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

1、配制混合标准溶液：

用初始流动相(即洗脱第一阶段使用的流动相)配制6份梯度浓度的混合标准溶液，每份混合标准溶液均含有11种三嗪类除草剂，11种三嗪类除草剂分别为西玛津、敌草净、西草净、莠去津、莠灭净、环草津、特丁津、扑灭津、草净津、特丁净和扑草净，每份混合标准溶液中各三嗪类除草剂的浓度相同，6份混合标准溶液中各三嗪类除草剂的浓度分别为1.0μg/L、5.0μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L，向每份混合溶液中加入内标物莠去津-D₅，各混合标准溶液中内标物莠去津-D₅的浓度均为5μg/L；

2、UPLC分析检测：

将各混合标准溶液进行UPLC分析检测，UPLC条件如下：

色谱柱采用Waters ACQUITY BEH Shield RP18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7 μm)，柱温：30℃，进样量：10μL；流动相采用有机相和水相的混合液，有机相为乙腈，水相为0.1wt％甲酸溶液，流动相流速为0.4mL/min，流动相采用梯度洗脱的方式进行洗脱，具体如下：

第一阶段：洗脱时间2min，其中有机相的体积百分含量为20％，水相的体积百分含量为80％；

第二阶段：洗脱时间4min，其中有机相的体积百分含量从20％逐渐增加至90％，水相的体积百分含量从80％逐渐减少至10％；

第三阶段：洗脱时间2min，其中有机相的体积百分含量为90％，水相的体积百分含量为10％；

第四阶段：洗脱时间0.1min，其中有机相的体积百分含量从90％逐渐减少至20％，水相的体积百分含量从10％逐渐增加至80％；

第五阶段：洗脱时间1.9min，其中有机相的体积百分含量为20％，水相的体积百分含量为80％；

3、HESI-MS/MS分析检测：

HESI-MS/MS分析检测条件如下：

离子源为加热大气压电喷雾源，正离子模式扫描，选择反应监测模式测定，喷雾电压3500V，蒸发温度350℃，离子传输毛细管温度330℃，鞘气流速40L/min，辅助气为10L/min，碰撞气及压力：氩气纯度≥99.999，2.0mTorr，Q1的半峰宽为0.7，Q3的半峰宽为0.7，各三嗪类除草剂的检测参数如下表1所示：

表1 11种三嗪类除草剂及其内标物的母离子、子离子和碰撞能量

根据各三嗪类除草剂的检测参数可以得到各三嗪类除草剂和莠去津-D₅的子离子峰面积，进而得到各浓度下各三嗪类除草剂的子离子峰面积与内标物莠去津-D₅子离子峰面积的比值；

4、建立标准曲线：

以各三嗪类除草剂的浓度为横坐标，各浓度下各三嗪类除草剂的子离子峰面积与内标物莠去津-D₅子离子峰面积的比值为纵坐标，根据各三嗪类除草剂检测的数据进行绘图，拟合后得到各三嗪类除草剂的标准曲线，从而得到各三嗪类除草剂的标准曲线的函数关系式(线性方程)，以不小于3倍信噪比(S/N≥3)确定方法的检测限(LOD)，以不小于10倍信噪比(S/N≥10)确定方法的定量限(LQD)，具体结果如下表2：

表2 11种除草剂的线性方程、线性范围、相关系数、检测限和定量限

5、水产样品的前处理：

称取5g(精确至0.01g)均质的草鱼肌肉样品，置于50mL离心管中，加入100μL0.1mg/L内标物莠去津-D₅，接着依次加入10mL乙腈、3g氯化钠和2g无水硫酸镁，涡旋振荡2min后超声5min，然后在5000r/min下离心5min，取上清液至鸡心瓶中，重复提取1次，并合并上清液至鸡心瓶中，将鸡心瓶中的上清液于40℃下蒸发至干，向残渣中加入2mL甲醇，涡旋震荡至残留物溶解，得到混合液，待用；

将上述的混合液置于10mL离心管中，依次加入0.1g PSA，0.1g C₁₈和0.1g EMR-Lipid粉(安捷伦公司)，涡旋振荡1min，接着在10000r/min下冷冻离心5min，取1mL上清液用0.22μm尼龙滤膜过滤，得到待检测样品；

6、待检测样品的检测：

将待检测样品按照步骤2-3的方法进行分析检测，得到各三嗪类除草剂的子离子峰面积与内标物莠去津-D₅子离子峰面积的比值，将各三嗪类除草剂的子离子峰面积与内标物莠去津-D₅子离子峰面积的比值代入对应的三嗪类除草剂的标准曲线的函数关系式中，得到对应的三嗪类除草剂的浓度。

7、回收率与精密度检测；

取三份均质的空白草鱼肌肉组织样品，分别加入低、中、高3种浓度的11种三嗪类除草剂的混合标准溶液，得到三份待处理试验样品，将三份待处理样品按照实施例1步骤5的方法进行前处理，得到三份待测试验样品；

将三份待测试验样品按照实施例步骤6的方法进行检测，并计算回收率、日内精密度和日间精密度：

回收率(％)＝加标样品实际测定浓度÷加标浓度×100％；

精密度包括日内精密度和日间精密度。日内精密度是指一天内相同添加浓度不同批次加标样品测定间的符合程度，日间精密度是指一周内连续测定加标样品浓度计算日间精密度；

精密度(％)＝标准偏差÷加标样品实测浓度平均值×100％。

检测结果：

检测结果如表3所示，表3为11种三嗪类除草剂采用内标法在草鱼肌肉组织中的加标回收率和精密度的检测结果，具体如下：

表3 11种除草剂在草鱼肌肉组织中的加标回收率和精密度(n＝6)

由表3可知，三嗪类除草剂的回收率在80％-112％之间，由此表明，采用内标法检测水产品中的三嗪类除草剂，准确性高，非常可靠。

对比例1

1、配制混合标准溶液：

用初始流动相配制6份梯度浓度的混合标准溶液，每份混合标准溶液均含有11种三嗪类除草剂，11种三嗪类除草剂分别为西玛津、敌草净、西草净、莠去津、莠灭净、环草津、特丁津、扑灭津、草净津、特丁净和扑草净，每份混合标准溶液中各三嗪类除草剂的浓度相同，6份混合标准溶液中各三嗪类除草剂的浓度分别为1.0μg/L、5.0μg/L、 10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L；

2、UPLC分析检测：

将各混合标准溶液进行UPLC分析检测，UPLC条件如下：

色谱柱采用Waters ACQUITY BEH Shield RP18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7 μm)，柱温：30℃，进样量：10μL；流动相采用有机相和水相的混合液，有机相为乙腈，水相为0.1wt％甲酸溶液，流动相流速为0.4mL/min，流动相采用梯度洗脱的方式进行洗脱，具体如下：

第一阶段：洗脱时间2min，其中有机相的体积百分含量为20％，水相的体积百分含量为80％；

第二阶段：洗脱时间4min，其中有机相的体积百分含量从20％逐渐增加至90％，水相的体积百分含量从80％逐渐减少至10％；

第三阶段：洗脱时间2min，其中有机相的体积百分含量为90％，水相的体积百分含量为10％；

第四阶段：洗脱时间0.1min，其中有机相的体积百分含量从90％逐渐减少至20％，水相的体积百分含量从10％逐渐增加至80％；

第五阶段：洗脱时间1.9min，其中有机相的体积百分含量为20％，水相的体积百分含量为80％；

3、HESI-MS/MS分析检测：

HESI-MS/MS分析检测条件如下：

离子源为加热大气压电喷雾源，正离子模式扫描，选择反应监测模式测定，喷雾电压3500V，蒸发温度350℃，离子传输毛细管温度330℃，鞘气流速40L/min，辅助气为10L/min，碰撞气及压力：氩气纯度≥99.999，2.0mTorr，Q1的半峰宽为0.7，Q3的半峰宽为0.7，各三嗪类除草剂的检测参数如下表4所示：

表4 11种三嗪类除草剂的母离子、子离子和碰撞能量

根据各三嗪类除草剂的检测参数可以得到各浓度下各三嗪类除草剂的子离子峰面积；

4、建立标准曲线：

以各三嗪类除草剂的浓度为横坐标，各浓度下各三嗪类除草剂的子离子峰面积为纵坐标，根据各三嗪类除草剂检测的数据进行绘图，拟合后得到各三嗪类除草剂的标准曲线，从而得到各三嗪类除草剂的标准曲线的函数关系式(线性方程)，以不小于3倍信噪比(S/N≥3)确定方法的检测限(LOD)，以不小于10倍信噪比(S/N≥10)确定方法的定量限(LQD)，具体结果如下表5：

表5 11种除草剂的线性范围、线性方程、相关系数、检测限和定量限

5、水产样品的前处理：

称取5g(精确至0.01g)均质的草鱼肌肉样品，置于50mL离心管中，依次加入10mL乙腈、3g氯化钠和2g无水硫酸镁，涡旋振荡2min后超声5min，然后在5000r/min 下离心5min，取上清液至鸡心瓶中，重复提取1次，并合并上清液至鸡心瓶中，将鸡心瓶中的上清液于40℃下蒸发至干，向残渣中加入2mL甲醇，涡旋震荡至残留物溶解，得到混合液，待用；

将上述的混合液置于10mL离心管中，依次加入0.1g PSA，0.1C₁₈和0.1g EMR-Lipid，涡旋振荡1min，接着在10000r/min下冷冻离心5min，取1mL上清液用 0.22μm尼龙滤膜过滤，得到待检测样品；

6、待检测样品的检测：

将待检测样品按照步骤2-3的方法进行分析检测，得到各三嗪类除草剂的子离子峰面积，将各三嗪类除草剂的子离子峰面积代入对应的三嗪类除草剂的标准曲线的函数关系式中，得到对应的三嗪类除草剂的浓度。

7、回收率与精密度检测：

取三份均质的空白草鱼肌肉组织样品，分别加入低、中、高3种浓度的11种三嗪类除草剂的混合标准溶液，得到三份待处理试验样品，将三份待处理样品按照对比例1步骤5的方法进行前处理，得到三份待测对照样品；

将三份待测对照样品按照对比例1步骤6的方法进行检测，并计算回收率、日内精密度和日间精密度：

检测结果：

结果如表6所示，表6为11种三嗪类除草剂采用外标法在草鱼肌肉组织中的加标回收率和精密度的检测结果，具体如下：

表6 11种除草剂在草鱼肌肉组织中的加标回收率和精密度(n＝6)

由表6可知，三嗪类除草剂的回收率在50％-88％之间，由此表明，采用外标法检测水产品中的三嗪类除草剂，准确性偏低，无法满足检测需求。

向空白草鱼肌肉组织加入不同浓度的11种三嗪类除草剂的混合标准溶液，采用实施例1和对比例1的方法进行回收，根据表4和表6的结果，当加入20μg/kg的11种三嗪类除草剂时，各三嗪类除草剂的回收率比较如图1所示，由图1可知，采用实施例1 内标法进行回收，回收率为80-112％，而采用对比例1外标法进行回收，回收率为50-88％，特丁津的加标回收率最高仅54.5％，无法满足检测需求，由此可见，采用实施例1的方法进行检测，其准确性高，更准确可靠。

试验一、本发明超高效液相色谱-串联质谱测定水产品中三嗪类除草剂残留方法的基质效应评估试验

试验方法：

1、试验组采用净化试剂为PSA、C₁₈和EMR-Lipid进行试验，具体如下：

1.1、取均质的空白草鱼肌肉组织样品，按照对比例1步骤5的方法进行前处理，净化试剂选取0.1g PSA，0.1g C₁₈和0.1g EMR-Lipid，得到空白草鱼基质提取液1；

1.2、用空白草鱼基质提取液1配制6份梯度浓度的混合标准溶液，每份混合标准溶液均含有11种三嗪类除草剂，11种嗪类除草剂分别为西玛津、敌草净、西草净、莠去津、莠灭净、环草津、特丁津、扑灭津、草净津、特丁净和扑草净，每份混合标准溶液中各三嗪类除草剂的浓度相同，6份混合标准溶液中各三嗪类除草剂的浓度分别为1.0 μg/L、5.0μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L，向每份混合溶液中加入内标物莠去津-D₅，各混合标准溶液中内标物莠去津-D₅的浓度均为5μg/L，根据实施例1步骤 2-4的方法建立基质标准曲线；

1.3、基质效应(ME)评估：

采用公式ME＝[1-(基质标准曲线的斜率/溶剂标准曲线斜率)]×100％，考察方法的基质效应，结果如表7所示，表7为净化试剂选取PSA、C₁₈和EMR-Lipid时各物质的ME值，具体如下：

表7净化试剂为PSA、C₁₈和EMR-Lipid时的ME值

2、对照组1采用净化试剂为PSA和C₁₈进行试验，具体如下：

2.1、取均质的空白草鱼肌肉组织样品，按照对比例1步骤5的方法进行前处理，净化试剂选取0.1g PSA和0.1g C₁₈，得到空白草鱼基质提取液2；

2.2、用空白草鱼基质提取液2配制6份梯度浓度的混合标准溶液，每份混合标准溶液均含有11种三嗪类除草剂，11种嗪类除草剂分别为西玛津、敌草净、西草净、莠去津、莠灭净、环草津、特丁津、扑灭津、草净津、特丁净和扑草净，每份混合标准溶液中各三嗪类除草剂的浓度相同，6份混合标准溶液中各三嗪类除草剂的浓度分别为1.0 μg/L、5.0μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L，向每份混合溶液中加入内标物莠去津-D₅，各混合标准溶液中内标物莠去津-D₅的浓度均为5μg/L，根据实施例1步骤 2-4的方法建立基质标准曲线；

2.3、基质效应(ME)评估：

采用公式ME＝[1-(基质标准曲线的斜率/溶剂标准曲线斜率)]×100％，考察方法的基质效应，结果如表8所示，表8为净化试剂选取PSA和C₁₈时各物质的ME值，具体如下：

表8净化试剂为PSA和C₁₈时的ME值

3、对照组2采用净化试剂为EMR-Lipid进行试验，具体如下：

3.1、取均质的空白草鱼肌肉组织样品，按照对比例1步骤5的方法进行前处理，净化试剂选取0.1g EMR-Lipid，得到空白草鱼基质提取液3；

3.2、用空白草鱼基质提取液3配制6份梯度浓度的混合标准溶液，每份混合标准溶液均含有11种三嗪类除草剂，11种嗪类除草剂分别为西玛津、敌草净、西草净、莠去津、莠灭净、环草津、特丁津、扑灭津、草净津、特丁净和扑草净，每份混合标准溶液中各三嗪类除草剂的浓度相同，6份混合标准溶液中各三嗪类除草剂的浓度分别为1.0 μg/L、5.0μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L，向每份混合溶液中加入内标物莠去津-D₅，各混合标准溶液中内标物莠去津-D₅的浓度均为5μg/L，根据实施例1步骤 2-4的方法建立基质标准曲线；

3.3、基质效应(ME)评估：

采用公式ME＝[1-(基质标准曲线的斜率/溶剂标准曲线斜率)]×100％，考察方法的基质效应，结果如表9所示，表9为净化试剂选取EMR-Lipid时各物质的ME值，具体如下：

表9净化试剂为EMR-Lipid时的ME值

ME值越大说明基质效应越明显，当|ME|≥15％时说明存在明显基质效应。通过试验一可以看出，三组净化试剂的净化效果存在明显差异，使用PSA+C₁₈或EMR-Lipid净化时，部分目标除草剂的|ME|大于15％，存在明显基质效应，说明净化效果不太理想，导致水产品中脂肪等杂质干扰分析结果，而采用PSA、C₁₈和EMR-Lipid三种试剂混合净化时，所有目标除草剂|ME|均小于15％，说明采用PSA、C₁₈和EMR-Lipid三种物质的混合物作为净化剂时净化效果最佳，能够有效消除不同水产品基质带来的基质效应，从而提高结果的准确性。