阅读说明：本技术 卡格列净在制备治疗胰腺癌药物中的应用 (Application of canagliflozin in preparation of medicine for treating pancreatic cancer ) 是由 周长林 何良愿 许世霖 庞树洋 徐兑悦 于 2020-07-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了卡格列净在治疗胰腺癌中的应用。卡格列净化学名为(1S)-1,5-脱氢-1-C-[3-[[5-(4-氟苯基)-2-噻吩基]甲基]-4-甲基苯基]-D-葡萄糖醇。本发明利用胰腺癌肿瘤细胞模型和小鼠胰腺癌移植瘤模型,发现卡格列净能显著抑制胰腺癌细胞Capan-1和PANC-1的生长增殖；同时卡格列净能抑制肿瘤细胞的迁移；此外,经研究发现,卡格列净能干扰胰腺癌细胞糖酵解相关代谢功能,诱导胰腺癌细胞的凋亡。经卡格列净治疗的荷瘤小鼠,其胰腺癌皮下移植瘤PANC-1的肿瘤体积明显减小。因此,卡格列净在临床胰腺癌的治疗中有良好的应用前景。(The invention discloses application of canagliflozin in treating pancreatic cancer. Canagliflozin is chemically known as (1S) -1, 5-dehydro-1-C- [3- [ [5- (4-fluorophenyl) -2-thienyl ] methyl ] -4-methylphenyl ] -D-glucitol. According to the invention, a pancreatic cancer tumor cell model and a mouse pancreatic cancer transplantation tumor model are utilized, and the Kagelagliflozin can obviously inhibit the growth and proliferation of pancreatic cancer cells Capan-1 and PANC-1; meanwhile, the canagliflozin can inhibit the migration of tumor cells; in addition, the study shows that the canagliflozin can interfere the glycolytic related metabolic function of pancreatic cancer cells and induce the apoptosis of the pancreatic cancer cells. The tumor volume of the subcutaneous tumor-transplanted PANC-1 of the pancreatic cancer of the tumor-bearing mice treated by the canagliflozin is obviously reduced. Therefore, the canagliflozin has a good application prospect in the clinical treatment of pancreatic cancer.)

卡格列净在制备治疗胰腺癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种药物的用途，具体涉及卡格列净(化学名：(1S)-1,5-脱氢-1-C-[3-[[5-(4-氟苯基)-2-噻吩基]甲基]-4-甲基苯基]-D-葡萄糖醇，英文名：Canagliflozin,CANA)抗胰腺癌在制备治疗胰腺癌药物中的应用。

背景技术

胰腺癌是最常见的实体恶性肿瘤，其具有临床症状隐匿，进展迅速，预后差等特点，其可能是由于低血管生成，明显的纤维化基质反应，基因组复杂性和代谢改变造成的。胰腺癌的低生存率在很大程度上是由于其在解剖学上的特殊位置妨碍了常规检查，因此患者确诊时已经处于癌症晚期。迄今为止，根治性切除术仍是胰腺癌患者治疗的首选，但是由于大多数患者被发现时已是晚期，只有不到15％的患者有机会进行根治性切除术。吉西他滨是胰腺癌的首选治疗药物，它使患者的生存期延长数月，但是伴有许多不良反应，例如肾毒性、过敏反应、浮肿、造血器官萎缩和免疫抑制等。因此，寻找治疗胰腺癌的新型药物具有临床重要意义。

卡格列净化学名为(1S)-1,5-脱氢-1-C-[3-[[5-(4-氟苯基)-2-噻吩基]甲基]-4-甲基苯基]-D-葡萄糖醇，化学结构式如下。它是是用于治疗糖尿病的口服药物，可通过抑制钠-葡萄糖共转运蛋白2发挥作用，同时也是目前获批的唯一一种具有降低心肌梗死、卒中或心血管死亡率的口服降糖药。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于公开卡格列净抗胰腺癌在制备治疗胰腺癌药物中的应用。

技术方案：本发明所述的卡格列净或其可药用衍生物在制备治疗胰腺癌药物中的应用。

卡格列净或其可药用衍生物在制备与吉西他滨联用治疗胰腺癌的协同增效药物中的应用。

所述卡格列净或其可药用衍生物为卡格列净或其可药用衍生物或含有卡格列净或其可药用衍生物的组合物。

所述组合物由卡格列净或其可药用衍生物添加药学上可接受的辅料制成制剂。

所述制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液、注射剂。

卡格列净能够通过抑制胰腺癌的糖酵解作用进而有效地抑制胰腺癌的生长；同时能抑制胰腺癌细胞的迁移和诱导胰腺癌细胞的凋亡；它与吉西他滨联用能增强吉西他滨抑制胰腺癌细胞的效果。

(1)通过MTT细胞活力实验和平板克隆实验，得到卡格列净可以抑制胰腺癌细胞Capan-1和PANC-1增殖和克隆形成；与吉西他滨联用能增强吉西他滨抑制胰腺癌细胞的效果。

(2)通过划痕实验，得到卡格列净能抑制胰腺癌细胞的迁移。

(3)通过AV/PI双染，得到卡格列净可以有效诱导胰腺癌细胞Capan-1和PANC-1的凋亡。

(4)通过构建PANC-1胰腺癌裸鼠移植瘤模型，得到卡格列净能显著抑制胰腺癌PANC-1肿瘤的生长。

(5)通过检测细胞上清的葡萄糖浓度，得到卡格列净能抑制胰腺癌细胞Capan-1和PANC-1的葡萄糖摄取。

(6)通过检测细胞上清的乳酸浓度，得到卡格列净能抑制胰腺癌细胞Capan-1和PANC-1的乳酸释放。

有益效果：与现有技术相比，本发明通过MTT细胞活力实验和平板克隆实验确认卡格列净具有抑制胰腺癌细胞增殖和克隆形成的活性，联合吉西他滨得到卡格列净能增强吉西他滨治疗胰腺癌的效果；再经过划痕实验和AV/PI双染实验发现卡格列净的抗胰腺癌细胞迁移和诱导凋亡的作用。同时本发明通过构建PANC-1胰腺癌裸鼠移植瘤模型得到卡格列净的体内抗胰腺癌活性；经检测治疗组胰腺癌细胞葡萄糖摄取和乳酸释放变化，发现卡格列净能抑制胰腺癌细胞糖酵解。本发明公开了卡格列净在胰腺癌的治疗药物中有良好的临床应用前景。

附图说明

图1是卡格列净对胰腺癌细胞Capan-1的抑制作用图；

图2是卡格列净对胰腺癌细胞PANC-1的抑制作用图；

图3是卡格列净联合吉西他滨对胰腺癌细胞Capan-1的抑制作用图；

图4是卡格列净联合吉西他滨对胰腺癌细胞PANC-1的抑制作用图；

图5是卡格列净对胰腺癌细胞Capan-1克隆形成的抑制作用图；

图6是卡格列净对胰腺癌细胞PANC-1克隆形成的抑制作用图；

图7是卡格列净对胰腺癌细胞Capan-1迁移的抑制作用图；

图8是卡格列净诱导胰腺癌细胞Capan-1和PANC-1凋亡的结果图；

图9是卡格列净对胰腺癌PANC-1肿瘤的体内抑制作用拍照图；

图10是卡格列净对胰腺癌PANC-1肿瘤的抑制率量化图；

图11是卡格列净对裸鼠体重的影响图；

图12是卡格列净对胰腺癌细胞Capan-1葡萄糖摄取的抑制作用图；

图13是卡格列净对胰腺癌细胞PANC-1葡萄糖摄取的抑制作用图；

图14是卡格列净对胰腺癌细胞Capan-1乳酸释放的抑制作用图；

图15是卡格列净对胰腺癌细胞PANC-1乳酸释放的抑制作用图。

具体实施方式

实验中所用到主要药品和试剂：

其余氯化钠，氯化钾，碳酸氢钠等化学试剂均为国产分析纯，购自南京化学试剂有限公司。

实施例1

卡格列净对胰腺癌细胞的抗肿瘤活性：

1.溶液配制

(1)卡格列净溶液：称取卡格列净原料药，溶于1mL DMSO中，配制成80mmol/L的母液，经0.22μm微孔滤膜后过滤除菌，再分装至多个200μL EP管，放置于-20℃冰箱保存备用。

(2)DMEM培养基：取DMEM培养基冻干粉末，溶于1L双蒸水，磁力搅拌，加入约1.6g碳酸氢钠，将溶液pH调至7.2，在无菌环境下经0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存待用。培养细胞时往培养基中加入10％Gibco胎牛血清和100U/mL的青霉素-链霉素。

(3)胰酶：分别称取NaCl 4.0g，KCl 0.1g，Na₂HPO₄·12H₂O 1.45g，KH₂PO₄ 0.1g，溶于400mL双蒸水中，再加入0.125g EDTA和1.25g胰酶，搅拌，定容至500mL，在无菌环境下经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存待用。

(4)细胞冻存液：将纯胎牛血清与DMSO按体积比9:1混合均匀，置于4℃冰箱保存。

(5)磷酸缓冲液(PBS)：分别称取KCl 0.2g，NaCl 8.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，使用900mL双蒸水溶解，调节pH至7.4，用超纯水定容至1L，过滤除菌，于4℃冰箱保存。

(6)生理盐水(0.9％NaCl溶液)：称取NaCl 4.5g，溶于500mL双蒸水，高压蒸汽灭菌后4℃冰箱保存。

(7)MTT溶液：避光称取MTT 100mg，然后加入20mL PBS，配制成5mg/mL的溶液，磁力搅拌器搅拌30min至完全溶解，经0.22μm滤膜过滤除菌，分装于1mL EP管，避光冻存于-20℃低温冰箱。

2.细胞培养

(1)细胞复苏

将冻存于液氮罐中的细胞冻存管取出，迅速放入37℃水浴快速晃动细胞，待完全溶解后，吸取细胞悬液至新的培养基或PBS中，1300rpm离心5min，弃上清，用完全细胞培养基重悬细胞，转移至细胞培养皿中，随后放置在37℃CO₂细胞培养箱中培养，次日观察细胞的生长情况。

(2)细胞传代

待在显微镜下观察到细胞贴壁密度为80～90％时，进行细胞传代：首先在生物安全柜中使用移液枪小心吸除细胞培养液，加入1mL胰酶洗去残留的培养基；再将1.5mL胰酶均匀覆盖细胞表面，静置消化1min左右，待在显微镜下观察到细胞回缩变圆后，吸除胰酶，加入完全培养基，用移液枪吹打细胞并使其脱落，使其分散均匀。将细胞悬液分装至两个新的细胞培养皿中，分别添加培养基至细胞悬液总体积3mL，标记日期和细胞名称，放于37℃5％CO₂培养箱继续培养，次日观察细胞的生长情况。

(3)细胞冻存

待细胞密度达至80～90％时，可选取生长状态良好的细胞进行冻存：首先在超净台中配制细胞冻存液；再吸除细胞培养液，加入1mL胰酶润洗细胞后弃去。加入1.5mL胰酶，静置消化约1min左右，待细胞形态回缩变圆后，吸除胰酶，加入完全培养基终止消化。吹打细胞使其脱落，均匀分散于培养液中，移取至10mL EP管中，将细胞于1300rpm下离心5min，弃上清，加入1mL细胞冻存液重悬沉淀并移至冻存管，标记日期和细胞名称。将冻存管进行梯度降温(4℃5min，-20℃30min)，最后转至-80℃低温冰箱或液氮罐中。

3.MTT法检测细胞增殖

将密度为5×10⁴个/mL的细胞在超净台中均匀铺于96孔板中。于37℃CO₂细胞培养箱中培养24h，然后对细胞进行分组和药物处理。

单一给药组：药物治疗组分别加入不同浓度的卡格列净，使其终浓度分别达到0、20、40、60、80μM；阳性对照组加入终浓度为0.5μM的吉西他滨。

联合给药组：设置两组药物治疗组，两组均加入不同浓度的吉西他滨，使其终浓度分别达到0、0.12、0.25、0.5μM，其中一组与终浓度为20μM卡格列净联合给药，比较两组药物治疗胰腺癌细胞的效果。

待药物作用48h后，每孔避光加入20μL MTT溶液，放在37℃培养箱孵育4h后，吸尽孔板内的培养液，最后向每孔中各加入150μL DMSO，置于微量振荡器上轻轻震荡5min后，用酶标仪于490nm波长处检测吸光度。

由图1和图2可以看出卡格列净对这两种细胞均具有抑制其增殖和活力的作用，同时抑制效果呈现剂量依赖性。40μM卡格列净对Capan-1和PANC-1细胞的抑制率分别达到了33.8％和38.9％。说明卡格列净能显著抑制胰腺癌细胞的生长。

由图3和图4可以看出卡格列净与吉西他滨联用给药后增强了吉西他滨单独给药对胰腺癌细胞的抑制作用。与0.25μM吉西他滨单独给药相比，联合20μM卡格列净治疗后对Capan-1和PANC-1细胞的抑制率分别从21.5％和26.6％增加到29.8％和36.4％。说明卡格列净与吉西他滨联用能增强吉西他滨抑制胰腺癌细胞的效果。

4.平板克隆检测细胞的集落形成

将对数生长期的细胞消化后，移取至EP管中，吹打均匀后，取出少量至灭菌干燥的细胞计数板中观察计数。将细胞浓度调整至600个/mL后，均匀铺于6孔板中并置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。培养72小时后，将卡格列净配制成不同的浓度(20μM，40μM，60μM)与细胞共孵育，同时设置0.5μM吉西他滨的阳性对照组和阴性对照组。药物作用10天后，取出细胞培养板，吸去并弃掉培养基，用PBS冲洗单层细胞，弃掉冲洗液。加入4％的多聚甲醛固定，静置15min后，弃掉固定液。每孔加入1mL 0.5％的结晶紫染色液，静置15min，吸出染色液，用PBS重复洗涤3～5次直至无背景色，拍摄亮场图像。

见图5和图6，卡格列净能剂量依赖性地抑制两种胰腺癌细胞的集落形成，即细胞集落数减少，染色紫色变浅。说明卡格列净能抑制胰腺癌细胞的集落形成。

5.划痕实验检测细胞迁移

先用marker笔在12孔板背后用直尺比着均匀划横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过2条线。将生长状态良好的Capan-1细胞用胰酶消化后，于12孔板中每孔加入5×10⁵个细胞，置于37℃细胞培养箱过夜培养。待细胞铺满孔板后，用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，用PBS洗细胞3次，洗去划下的细胞，加入无血清培养基。将细胞培养板放入37℃5％CO₂培养箱，培养。在给药治疗0、24和48h后取培养板于光学显微镜下进行拍照。

见图7，Capan-1细胞经过卡格列净处理后，拍摄了24h和48h的细胞图片，从图中可以看出肿瘤细胞的迁移能力随着卡格列净给药浓度的升高不断降低。随着时间的推移，与对照组相比，60μM卡格列净抑制细胞的迁移效果十分明显。说明卡格列净能抑制胰腺癌细胞的迁移。

6.流式细胞术检测细胞凋亡

将处于对数生长期的胰腺癌细胞以密度为2×10⁵个/mL铺于12孔板中，放置于37℃5％CO₂培养箱中培养，待其贴壁后，加入卡格列净，使药物的终浓度为20μM，40μM和60μM，同时设置阴性对照组和阳性药组(0.5μM GEM)。培养48h后，用不含EDTA的胰酶消化细胞，消化约5min后，终止消化，收集细胞于10mL EP管中，1300rpm、4℃离心5min，弃上清。加入预冷的PBS，洗涤细胞两次，每次都在1300rpm、4℃离心5min，弃上清。加入100μL 1×BindingBuffer，轻轻吹匀至单细胞悬液，转移至流式管。加入5μL Annexin V-FITC和5μL PIStaining Solution，轻轻吹匀；避光、室温(20～25℃)孵育10min；加入400μL 1×BindingBuffer，轻轻混匀。染色后样品在1h内用流式细胞仪进行检测。

见图8，经过60μM卡格列净处理后，Capan-1和PANC-1细胞(早期凋亡)的凋亡率较Control组显著提高，分别达到13.1％和12.0％。然而，PANC-1细胞的晚期凋亡率比Capan-1细胞更明显，这表明PANC-1细胞可能对卡格列净的敏感性高于Capan-1细胞。从总凋亡率方面来看，Capan-1和PANC-1细胞的总凋亡率呈剂量依赖性增加，在40μM卡格列净处理组中，Capan-1细胞的凋亡率达到18.4％，而GEM处理组仅14.2％。综合以上数据表明卡格列净能明显诱导胰腺癌细胞凋亡。

因此，从实施例1可以看出本发明中的卡格列净能抑制胰腺癌细胞的生长增殖，迁移并且诱导其凋亡；同时与吉西他滨联用能增强吉西他滨抑制胰腺癌细胞的效果。

实施例2

卡格列净对胰腺癌荷瘤鼠的抗肿瘤活性：

1.胰腺癌PANC-1荷瘤鼠移植瘤模型的建立

Balb/c雄性小鼠均养在温度为22±1℃并伴有每天12h光照的中国药科大学动物实验中心，提供其充分的食物和水，并且动物实验操作均遵循中国药科大学动物伦理委员会。取生长状态良好，处于对数生长期的PANC-1细胞，消化细胞，用生理盐水洗涤3次，洗去细胞表面残留的培养基，加入生理盐水，混悬均匀。通过计数，将PANC-1细胞密度调整至6×10⁶个/mL。每只裸鼠腋下注射100μL细胞混悬液，待一周后，肿瘤长到约为80～100mm³时，将Balb/c雄性裸鼠随机分为6组，每组5只，分别设置为模型组，卡格列净低、中、高(25mg/kg、50mg/kg和100mg/kg)和阳性药治疗组，并开始用药物(卡格列净和吉西他滨)进行治疗。

2.荷瘤鼠给药方法

模型组每天每只裸鼠腹腔注射生理盐水；卡格列净治疗组每天每只裸鼠进行灌胃给药卡格列净混悬液，药物浓度分别设置为25、50、100mg/kg；阳性药组每只裸鼠腹腔注射吉西他滨，一周给药两次，药物浓度10mg/kg。每两天使用游标卡尺测量一次裸鼠肿瘤体积和裸鼠体重，根据裸鼠体重计算药物用量，并给予药物处理。末次给药24h后，分别称重，并脱颈处死小鼠，解剖并取出肿瘤，拍照，并置于10％***固定或者-80℃低温冰箱保存，并进行后续实验。瘤体积和抑瘤率的计算方法如下：

瘤体积＝1/2×a×b²，(a表示为肿瘤相对长度，b表示为肿瘤相对宽度)

抑瘤率＝(1–A/B)×100％,A表示给药组裸鼠的平均瘤重，B表示模型组裸鼠的平均瘤重。

见图9和图10，卡格列净给药组肿瘤体积明显小于对照组，在25、50和100mg/kg的剂量下，肿瘤抑制率分别为20.7％，29.4％和45.1％，与此同时，卡格列净能以剂量依赖性的方式抑制肿瘤的体积。因此我们可以得出，卡格列净在体内能抑制胰腺癌PANC-1肿瘤的生长。

见图11，给药期间隔天测量裸鼠的体重，给药四周后，卡格列净治疗组的体重维持在22g左右，而吉西他滨治疗组的小鼠体重显著降低至17g，表明卡格列净的毒性明显比阳性药物吉西他滨低。说明药物卡格列净的毒性很低。

因此，从实施例2中可以看出，卡格列净在小鼠体内同样能够抑制胰腺癌PANC-1肿瘤的生长，与体外结果一致且药物卡格列净的毒性较低。

实施例3

卡格列净抑制胰腺癌细胞糖酵解的相关研究：

1.葡萄糖摄取实验

通过葡萄糖试剂盒检测葡萄糖含量。实验原理：样品中的葡萄糖可以被葡萄糖氧化酶氧化成为葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的催化作用下，可以将还原性4-氨基安替比林与酚进行偶联缩合成可被分光光度计测得的醌类化合物。将铺好细胞的培养板置于培养箱中培养，待其贴壁后，加入卡格列净处理，分别在给药后6h、12h和24h吸取细胞上清液，加入工作液充分混合后，将样品管放入OD值调为505nm波长处的分光光度计中，测得各个样本管的吸光度值，最后记录数据并处理结果。

由图12和图13所示，卡格列净处理后的Capan-1和PANC-1细胞的葡萄糖摄取率(60μM卡格列净)较Control组分别降低了4.8％和4.9％。说明卡格列净能抑制胰腺癌细胞的葡萄糖摄取。

2.乳酸释放实验

通过乳酸含量试剂盒检测乳酸含量。实验原理：乳酸在乳酸脱氢酶的作用下生成丙酮酸，同时使NAD⁺还原生成NADH和H⁺，H⁺传递给PMS生成的PMSH2还原MTT生成紫色物质，在570nm处有特征吸收峰。胰腺癌细胞贴壁给药后，分别在给药后6h，12h和24h吸取细胞上清液，加入工作液后，将EP管充分混匀，将样品管放入OD值调为530nm波长处的分光光度计中，测得各个样本管的吸光度值，最后记录数据并处理结果。

结果如图14和图15所示，表明卡格列净处理后的Capan-1和PANC-1细胞的乳酸释放率分别降低了25.5％和43.4％。说明卡格列净能抑制胰腺癌细胞的乳酸释放。

因此，从实施例3可以看出卡格列净能通过抑制胰腺癌细胞的糖酵解进而抑制其生长。