诱导软骨发生的方法
阅读说明：本技术 诱导软骨发生的方法 (Method of inducing chondrogenesis ) 是由 彼得·G·舒尔茨 阿纳布·K·查特吉 蒂莫西·M·莱特 约翰·威斯勒 瓦迪姆·克拉什尼尘克 于 2018-04-23 设计创作，主要内容包括：本文描述了用于通过采用关节内施用将间充质干细胞诱导成软骨细胞以减轻关节炎或关节损伤的化合物和组合物。(Described herein are compounds and compositions for reducing arthritis or joint damage by inducing mesenchymal stem cells into chondrocytes using intra-articular administration.)
交叉引用
本申请要求于2017年4月24日提交的美国临时申请序列号62/489,397的权益，其通过引用整体并入本文。
背景技术
骨关节炎(OA)代表最常见的肌肉骨骼疾病。目前约有4000万美国人受到影响，并且由于人口老龄化和预期寿命延长，预计这一数字将在未来20年内增加到6000万，这将使其成为残疾的第四大原因。OA的特征是包括关节软骨(包含对关节产生润滑和缓冲作用的细胞和基质)和位于关节软骨下的软骨下骨在内的关节的退行性破坏。目前的OA治疗包括通过口服NSAID或选择性环氧合酶2(COX-2)抑制剂、关节内(IA)注射皮质类固醇和透明质酸等药物以及手术方法来缓解疼痛。
间充质干细胞(MSC)存在于成人间软骨中，并且分离后可以在体外被编程，以经历向软骨细胞和其他间充质细胞谱系的分化。间充质干细胞部分受生长因子(TGF、BMP)、血清条件和细胞-细胞接触的调节。
发明内容
本文提供了用于减轻受试者的关节炎或关节损伤的方法，该方法包括向受试者的膝关节间隙施用约10μg至约1000μg的N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
用于减轻受试者的关节炎或关节损伤的方法可以包括向膝关节间隙施用约10μg至约400μg的N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
用于减轻受试者的关节炎或关节损伤的方法可以包括向膝关节间隙施用约50μg至约400μg的N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
本文提供了用于减轻受试者的关节炎或关节损伤的方法，该方法包括对受试者的膝关节间隙施用不超过约1000μg的N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
用于减轻受试者的关节炎或关节损伤的方法可以包括向膝关节间隙施用不超过约400μg的N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
本文提供了用于在受试者中诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，该方法包括向受试者的膝关节间隙施用约10μg至约1000μg的N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
用于在受试者中诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法可以包括向膝关节间隙施用约10μg至约400μg的N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
用于在受试者中诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法可以包括向膝关节间隙施用约50μg至约400μg的N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
本文公开了用于在受试者中诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，该方法包括对受试者的膝关节间隙施用不超过约1000μg的N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
用于在受试者中诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法可以包括向膝关节间隙施用不超过约400μg的N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在用于在受试者中减轻关节炎或关节损伤或诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法中，N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以每年施用于受试者。
在用于在受试者中减轻关节炎或关节损伤或诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法中，N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以每十一个月施用于受试者。
在用于在受试者中减轻关节炎或关节损伤或诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法中，N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以每十个月施用于受试者。
在用于在受试者中减轻关节炎或关节损伤或诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法中，N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以每九个月施用于受试者。
在用于在受试者中减轻关节炎或关节损伤或诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法中，N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以每八个月施用于受试者。
在用于在受试者中减轻关节炎或关节损伤或诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法中，N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以每七个月施用于受试者。
在用于在受试者中减轻关节炎或关节损伤或诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法中，N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以每六个月施用于受试者。
在用于在受试者中减轻关节炎或关节损伤或诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法中，N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以每五个月施用于受试者。
在用于在受试者中减轻关节炎或关节损伤或诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法中，N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以每四个月施用于受试者。
在用于在受试者中减轻关节炎或关节损伤或诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法中，N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以每三个月施用于受试者。
在用于在受试者中减轻关节炎或关节损伤或诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法中，N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以每两个月施用于受试者。
在用于在受试者中减轻关节炎或关节损伤或诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法中，N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以每月或每周施用于受试者。
在用于在受试者中减轻关节炎或关节损伤或诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法中，可以施用约25μg的N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在用于在受试者中减轻关节炎或关节损伤或诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法中，可以施用约50μg的N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在用于在受试者中减轻关节炎或关节损伤或诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法中，可以施用约100μg的N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在用于在受试者中减轻关节炎或关节损伤或诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法中，可以施用约150μg的N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在用于在受试者中减轻关节炎或关节损伤或诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法中，可以施用约200μg的N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在用于在受试者中减轻关节炎或关节损伤或诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法中，可以施用约250μg的N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在用于在受试者中减轻关节炎或关节损伤或诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法中，可以施用约300μg的N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在用于在受试者中减轻关节炎或关节损伤或诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法中，可以施用约350μg的N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在用于在受试者中减轻关节炎或关节损伤或诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法中，可以施用约400μg的N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在用于在受试者中减轻关节炎或关节损伤或诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法中，N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以以约1mL至约5mL的体积施用。
在用于在受试者中减轻关节炎或关节损伤或诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法中，N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以以约5mL或不超过约5mL的体积施用。
附图说明
图1显示了用10μM的化合物A治疗后的实质性软骨变性宽度。
图2显示了用10μM的化合物A每两周一次治疗后的组合软骨变性宽度。
图3显示了与媒介物处理的动物相比，用化合物A治疗的动物的没有股骨的总关节评分。
图4显示了犬胫骨平台和股骨的骨关节炎病变的组织学分析示意图。
图5显示了用化合物A治疗后的软骨变性宽度。
图6显示了用化合物A治疗后的股骨软骨病变的深度。
图7显示了用化合物A治疗后的骨硬化水平。
图8显示了用化合物A治疗后的胶原形成标志物PIINP的循环水平。
图9显示了体外化合物A与FLNA的结合。
图10显示了通过化合物A诱导的CBFβ核定位。
援引并入
本说明书中所提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同特别且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。
具体实施方式
骨关节炎(OA)的特征是关节软骨的进行性破坏，并最终导致滑膜关节的功能衰竭[Reginster,J.Y.和N.G.Khaltaev,Introduction and WHO perspective on the globalburden of musculoskeletal conditions.Rheumatology(Oxford),2002.41Supp 1:p.1-2]。OA由几种致病机制介导，包括细胞外基质的酶促降解、新基质形成不足、细胞死亡以及软骨细胞的异常激活和肥大分化[Goldring,M.B.和S.R.Goldring,Articular cartilageand subchondral bone in the pathogenesis of osteoarthritis.Ann N Y Acad Sci,2010.1192(1):p.230-7]。目前治疗OA的唯一选择是疼痛管理和手术干预[Hunter,D.J.,Pharmacologic therapy for osteoarthritis-the era of disease modification.NatRev Rheumatol,2011.7(1):p.13-22]。
间充质干细胞(MSC)位于骨髓和大多数成年组织中，能够自我更新并分化成多种细胞谱系，包括软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞[Pittenger,M.F.,等人,Multilineagepotential of adult human mesenchymal stem cells.Science,1999.284(5411):p.143-7]。最近的研究发现，成人的关节软骨包含能够进行多谱系分化的MSC(约占细胞的3％)。在OA软骨中，这些细胞的数目大约增加一倍。这些定居的干细胞仍保持分化为软骨细胞的能力，从而具有修复受损软骨的能力[Grogan,S.P.,等人,Mesenchymal progenitor cellmarkers in human articular cartilage:normal distribution and changes inosteoarthritis.Arthritis Res Ther,2009.11(3):p.R85；Koelling,S.,等人,Migratorychondrogenic progenitor cells from repair tissue during the later stages ofhuman osteoarthritis.Cell Stem Cell,2009.4(4):p.324-35]。
本发明部分基于本发明的化合物刺激间充质干细胞的软骨细胞分化的发现。因此，本发明提供了用于诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法。此外，本发明提供了施用本发明的化合物和组合物来预防或减轻关节炎或关节损伤，这是通过将该化合物或组合物施用于关节、椎骨、椎间盘或全身施用而实现。特别地，本公开内容的化合物以约10μg至约1000μg的剂量在关节内施用于膝盖中。化合物可以作为单剂量或最多四个剂量的疗程施用。可以重复给药，例如，每周、每两周、每月或每3-12个月给药。作为非限制性实例，每周给药，持续不超过五周。如本文所用，对膝盖或膝关节的施用是指对一个膝盖的施用。然而，双膝都可以被施用本文的化合物。例如，向每个膝盖施用约10μg至约1000μg的本文提供的化合物。
定义
在以下描述中，对某些具体的细节进行了阐述，以便透彻地理解各实施方案。然而，本领域技术人员将理解，本发明可以在没有这些细节的情况下实施。在其他情形下，没有详细示出或描述公知的结构，以避免对实施方案的不必要的模糊描述。除非上下文另有要求，在整个说明书及其后的权利要求书中，词语“包含”及其变体，诸如“包括”和“含有”应当解释为开放式、包括性含义，即作为“包括但不限于”。此外，本文提供的标题仅为了方便，并不解释所请求保护的发明的范围或含义。
在整个说明书中提到“一个实施方案”或“实施方案”意指与该实施方案结合描述的特定的特征、结构或特性包含在至少一个实施方案中。因此，在整个说明书的各个位置出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”不一定是指相同的实施方案。此外，特定的特征、结构或特性可在一个或多个实施方案中以任何合适的方式进行组合。另外，如在本说明书和所附的权利要求书中所使用的，除非内容另有明确说明，单数形式的“一”、“一个”及“该(所述)”包括复数对象。还应指出的是，除非内容另有明确说明，术语“或(或者)”通常以其包括“和/或”的含义使用。
术语“患者”、“受试者”或“个体”可互换使用。如本文所用，它们是指患有病症的个体，诸如此类，包括哺乳动物和非哺乳动物。所有这些术语都不要求个人在医疗专业人员的照料和/或监督下。哺乳动物是哺乳动物纲的任何成员，包括但不限于人、非人的灵长类动物，如黑猩猩及其他猿类和猴类物种；农场动物，如牛、马、绵羊、山羊，猪；家养动物，如兔、狗和猫；实验动物，包括啮齿动物，如大鼠、小鼠和豚鼠等。非哺乳动物的实例包括但不限于鸟、鱼等。在本文提供的方法和组合物的一些实施方案中，个体是哺乳动物。在优选的实施方案中，个体是人。
如本文所用，术语“治疗”(“treat”、“treating”或“treatment”)或其他语法上的等同物包括缓解、减弱或减轻疾病或病况或其一种或多种症状，预防另外的症状，减轻或预防症状的潜在代谢原因，抑制疾病或病况，例如，阻止疾病或病况的发展，缓和疾病或病况，引起疾病或病况的消退，缓和由疾病或病况引起的状况或终止疾病或病况的症状，并且旨在包括预防。该术语还包括获得治疗益处和/或预防益处。治疗益处是指根除或减轻所治疗的潜在病症。同样，治疗益处通过根除或减轻与潜在病症有关的一种或多种生理症状而获得，使得尽管个体仍患有该潜在病症，但在该个体中观察到了改善。对于预防益处，将组合物施用于有发展特定疾病的风险的个体，或施用于报告疾病的一种或多种生理症状的个体，即使没有确诊该疾病。
如本文所用，术语“施用”(“administer”、“administering”、“administration”)等是指可用于使化合物或组合物递送至期望的生物作用部位的方法。这些方法包括但不限于口服途径、十二指肠内途径、肠胃外注射(包括静脉内、皮下、腹膜内、肌内、血管内或输注)、局部和直肠施用。本领域技术人员熟悉可与本文所述的化合物和方法一起使用的施用技术。在优选的实施方案中，本文所述的化合物和组合物口服施用。
如本文所用，术语“有效量”、“治疗有效量”或“药学有效量”是指所施用的足够量的至少一种药剂或化合物，其将在一定程度上减轻所治疗疾病或病况的一种或多种症状。结果可以是疾病的体征、症状或原因的减少和/或减轻，或对生物系统的任何其他期望的改变。例如，用于治疗用途的“有效量”是包含N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺的组合物对于提供疾病的临床显著减轻所需的量。适当的“有效”量可能因人而异。在任何个别情况下，均可以使用诸如剂量递增研究等技术来确定适当的“有效”量。
如本文所用，就制剂、组合物或成分而言，术语“可接受的”是指对所治疗个体的总体健康没有持续的有害影响。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指如载体或稀释剂等物质，其不会消除N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺的生物活性或性质，并且相对无毒，即该物质可以施用于个体而不会引起不良的生物效应或以有害的方式与包含该物质的组合物中的任何组分相互作用。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指保留N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺的游离酸和碱的生物有效性且在生物学或其他方面符合期望的盐。N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺可以与无机或有机碱以及无机和有机酸反应，以形成药学上可接受的盐。这些盐可以在最终的分离和纯化过程中原位制备，或者通过单独使纯化的游离碱形式的化合物与合适的有机或无机酸反应并分离由此形成的盐来制备。
如本文所用，术语“药物组合物”是指任选地与至少一种药学上可接受的化学组分混合的生物活性化合物，该化学组分诸如但不限于载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂、赋形剂等。
如本文所用，术语“载体”是指相对无毒的化学化合物或促进化合物掺入细胞或组织的药剂。
如本文所用，术语“药物组合”、“施用另外的疗法”、“施用另外的治疗剂”等是指一种以上活性成分混合或组合而成的药物疗法，并且包括活性成分的固定和非固定组合。术语“固定组合”是指将N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺和至少一种助剂以单独实体或剂量的形式同时施用于个体。术语“非固定组合”是指将N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺和至少一种助剂作为单独实体同时、并行或以可变的间隔时限顺序施用于个体，其中这种施用在个体体内提供了两种或更多种化合物的有效水平。这也适用于鸡尾酒疗法，例如三种或三种以上活性成分的施用。
如本文所用，术语“共同施用”、“与……联合施用”及其在语法上的等同物等意在包括将选择的治疗剂施用于单个个体，并且旨在包括其中药剂通过相同或不同的施用途径或在相同或不同时间施用的治疗方案。在一些实施方案中，将N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺与其他药剂共同施用。这些术语包括向动物施用两种或更多种药剂，使得药剂和/或其代谢产物同时存在于动物中。它们包括在单独的组合物中同时施用，在单独的组合物中在不同时间施用和/或在两种药剂都存在的组合物中施用。因此，在一些实施方案中，N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺和其他药剂以单一组合物施用。在一些实施方案中，将N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺和其他药剂混合在组合物中。
“西安大略和麦克马斯特大学关节炎指数(Western Ontario and McMasterUniversities Arthritis Index)”或“WOMAC”是指一组广泛使用的、专有的标准化调查问卷，被卫生专业人士用来评估膝盖和髋骨关节炎患者的状况，包括疼痛、僵硬和关节的身体机能。WOMAC还被用于评估背痛、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和纤维肌痛。它可以自行填写，并于1982年在西安大略和麦克马斯特大学开发。WOMAC衡量五个疼痛项目(评分范围0-20)、两个僵硬项目(评分范围0-8)和17个功能受限项目(评分范围0-68)。身体机能问题涵盖日常活动，如使用楼梯、从坐着或躺着的姿势站起来、站立、弯曲、行走、上下车、购物、穿袜或脱袜、卧床、进出洗浴室、坐，以及重度和轻度家务。
化合物A
本文提供了N-(4-(2-甲氧基乙基)苯基)-2-(甲基磺酰胺基)苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
化合物A的其他形式
异构体
在一些实施方案中，本文所述的化合物A以几何异构体的形式存在。在一些实施方案中，本文所述的化合物A具有一个双键。本文所述的化合物A包括所有顺式(cis)、反式(trans)、顺式(syn)、反式(anti)、反式(entgegen(E))和顺式(zusammen(Z))异构体及其相应的混合物。
标记的化合物
在一些实施方案中，本文所述的化合物A以其同位素标记的形式存在。在一些实施方案中，本文公开的方法包括通过施用此类同位素标记的化合物来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开的方法包括通过以药物组合物形式施用此类同位素标记的化合物A来治疗疾病的方法。因此，在一些实施方案中，本文公开的化合物A包括同位素标记的化合物A，除了其中一个或多个原子被替换成具有与在自然界中通常发现的原子质量或质量数不同的原子质量或质量数的原子的事实以外，该同位素标记的化合物与化合物A相同。可引入本发明化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分别如2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、31P、32P、35S、18F和36Cl。含有上述同位素和/或其他原子的其他同位素的本文所述的化合物A在本公开内容的范围内。某些同位素标记的化合物A，例如其中引入了放射性同位素如3H和14C的那些化合物A，可用于药物和/或基质组织分布分析。氚标记(即3H)和碳-14(即14C)同位素由于其容易制备和可检测性而尤其优选。此外，用重同位素如氘(即2H)取代产生了由较高代谢稳定性引起的某些治疗优势，例如体内半衰期的延长或剂量需求的减少。在一些实施方案中，同位素标记的化合物A或其药学上可接受的盐或溶剂化物通过任何合适的方法制备。
在一些实施方案中，本文所述的化合物A通过其他方式标记，包括但不限于使用发色团或荧光部分、生物发光标记或化学发光标记。
药学上可接受的盐
在一些实施方案中，本文所述的化合物A以药学上可接受的盐的形式存在。在一些实施方案中，本文公开的方法包括通过施用此类药学上可接受的盐来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开的方法包括通过以药物组合物形式施用此类药学上可接受的盐来治疗疾病的方法。
药学上可接受的盐的实例包括通过化合物A与无机酸、有机酸或无机碱反应制备的那些盐，此类盐包括乙酸盐、丙烯酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸氢盐、溴化物、丁酸盐、丁炔-1,4-二酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、己酸盐、辛酸盐、氯苯甲酸盐、氯化物、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、癸酸盐、二葡糖酸盐、磷酸二氢盐、二硝基苯甲酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡糖庚酸盐、甘油磷酸盐、乙醇酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、己炔-1,6-二酸盐、羟基苯甲酸盐、γ-羟基丁酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、碘化物、异丁酸盐、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲烷磺酸盐、扁桃酸盐、偏磷酸盐、甲烷磺酸盐、甲氧基苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、磷酸单氢盐、1-萘磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、焦硫酸盐、焦磷酸盐、丙炔酸盐、邻苯二甲酸盐、苯基乙酸盐、苯基丁酸盐、丙烷磺酸盐、水杨酸盐、丁二酸盐、硫酸盐、亚硫酸盐、丁二酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、磺酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐和二甲苯磺酸盐。
此外，本文所述的化合物A可制备为通过化合物的游离碱形式与药学上可接受的无机或有机酸反应而形成的药学上可接受的盐，此类药学上可接受的无机或有机酸包括但不限于无机酸，诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、偏磷酸等；和有机酸，诸如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、丁二酸、苹果酸、马来酸、富马酸、对甲苯磺酸、酒石酸、三氟乙酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、芳基磺酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、1,2-乙烷二磺酸、2-羟基乙烷磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲基双环-[2.2.2]辛-2-烯-1-甲酸、葡糖庚酸、4,4'-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-甲酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸和粘康酸。在一些实施方案中，诸如草酸的其他酸虽然本身并非药学上可接受的，但用于制备可用作获得本发明化合物及其药学上可接受的酸加成盐中的中间体的盐。
在一些实施方案中，包含游离酸基团的本文所述的那些化合物与以下化合物反应：合适的碱，诸如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐、硫酸盐，氨，或药学上可接受的有机伯胺、仲胺、叔胺或季胺。代表性的盐包括碱金属盐或碱土金属盐，如锂盐、钠盐、钾盐、钙盐和镁盐和铝盐等。碱的说明性实例包括氢氧化钠、氢氧化钾、胆碱氢氧化物、碳酸钠、N+(C1-4烷基)4等。
可用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。应当理解，本文所述的化合物也包括其所含有的任何碱性含氮基团的季铵化。在一些实施方案中，通过此类季铵化获得水溶性或油溶性或可分散性产物。
溶剂化物
在一些实施方案中，化合物A以溶剂化物的形式存在。本发明提供通过施用此类溶剂化物来治疗疾病的方法。本发明进一步提供通过以药物组合物形式施用此类溶剂化物来治疗疾病的方法。
溶剂化物含有化学计量或非化学计量的量的溶剂，并且在一些实施方案中，在与药学上可接受的溶剂如水、乙醇等结晶的过程中形成。当溶剂是水时形成水合物，或者当溶剂是醇时形成醇化物。本文所述化合物的溶剂化物可方便地在本文所述的过程中制备或形成。仅举例来说，可方便地使用包括但不限于二氧杂环己烷、四氢呋喃或甲醇的有机溶剂，通过从水性/有机溶剂混合物中再结晶来制备化合物A的水合物。此外，本文提供的化合物可以以非溶剂化以及溶剂化的形式存在。一般而言，对于本文提供的化合物A和方法而言，溶剂化形式被视为与非溶剂化形式等同。
互变异构体
“互变异构体”是指从分子的一个原子到同一分子的另一个原子的质子转移。本文提出的化合物A可作为互变异构体存在。互变异构体为通过氢原子的迁移(伴随单键和相邻双键的转换)可相互转化的化合物。在可能发生互变异构化的键合排列中，将存在互变异构体的化学平衡。考虑了本文所公开的化合物A的所有互变异构形式。互变异构体的确切比例取决于若干因素，包括温度、溶剂和pH。在一些情况下，化合物A可能以以下形式存在：
方法
本文提供了治疗哺乳动物的关节炎的方法，该方法包括通过向哺乳动物的关节进行关节内注射而施用约10μg至约1000μg的化合物A，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。例如，将化合物A，或其药学上可接受的盐或溶剂化物注射到关节中。例如，将化合物A，或其药学上可接受的盐或溶剂化物注射到膝盖中。在一些情况下，化合物A在施用后约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时或约10小时不被全身吸收。在一些情况下，施用约10μg至约800μg、约10μg至约600μg、约10μg至约400μg、约10μg至约200μg、约10μg至约100μg的化合物A，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。化合物A，或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以作为单剂量或至多四个剂量的疗程施用。可以重复给药，例如每周、每两周、每月或每3-12个月给药。作为非限制性实例，每3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复给药。作为另一个非限制性实例，每周给药，持续不超过五周。作为另一个非限制性实例，给药为每两周一次。
本文提供了治疗哺乳动物的骨关节炎的方法，该方法包括通过向哺乳动物的关节进行关节内注射而施用约10μg至约1000μg的化合物A，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。例如，将化合物A，或其药学上可接受的盐或溶剂化物注射到关节中。例如，将化合物A，或其药学上可接受的盐或溶剂化物注射到膝盖中。在一些情况下，化合物A在施用后约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时或约10小时不被全身吸收。在一些情况下，施用约10μg至约800μg、约10μg至约600μg、约10μg至约400μg、约10μg至约200μg、约10μg至约100μg的化合物A，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。化合物A，或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以作为单剂量或至多四个剂量的疗程施用。可以重复给药，例如每周、每两周、每月或每3-12个月给药。作为非限制性实例，每3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复给药。作为另一个非限制性实例，每周给药，持续不超过五周。作为另一个非限制性实例，给药为每两周一次。
本文提供了减轻哺乳动物的关节炎或关节损伤的方法，该方法包括通过向哺乳动物的关节进行关节内注射而施用约10μg至约1000μg的化合物A，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。例如，将化合物A，或其药学上可接受的盐或溶剂化物注射到关节中。例如，将化合物A，或其药学上可接受的盐或溶剂化物注射到膝盖中。在一些情况下，化合物A在施用后约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时或约10小时不被全身吸收。在一些情况下，施用约10μg至约800μg、约10μg至约600μg、约10μg至约400μg、约10μg至约200μg、约10μg至约100μg的化合物A，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。化合物A，或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以作为单剂量或至多四个剂量的疗程施用。可以重复给药，例如每周、每两周、每月或每3-12个月给药。作为非限制性实例，每3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复给药。作为另一个非限制性实例，每周给药，持续不超过五周。作为另一个非限制性实例，给药为每两周一次。
本文提供了诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，该方法包括通过关节内注射，在有此需要的受试者中将间充质干细胞暴露于约10μg至约1000μg的化合物A，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，从而诱导干细胞向软骨细胞分化。例如，将化合物A，或其药学上可接受的盐或溶剂化物注射到关节中。例如，将化合物A，或其药学上可接受的盐或溶剂化物注射到膝盖中。在一些情况下，化合物A在施用后约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时或约10小时不被全身吸收。在一些情况下，施用约10μg至约800μg、约10μg至约600μg、约10μg至约400μg、约10μg至约200μg、约10μg至约100μg的化合物A，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。化合物A，或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以作为单剂量或至多四个剂量的疗程施用。可以重复给药，例如每周、每两周、每月或每3-12个月给药。作为非限制性实例，每3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复给药。作为另一个非限制性实例，每周给药，持续不超过五周。作为另一个非限制性实例，给药为每两周一次。
在一些实施方案中，哺乳动物没有关节炎或关节损伤，但关节炎或关节损伤的风险增加中。预期本发明的化合物、组合物和方法可用于改善任何类型的关节炎或关节损伤。进一步预期本发明的化合物、组合物和方法可用于改善各种软骨病症。在一些实施方案中，施用本发明的化合物和组合物以预防关节炎或关节损伤，例如，在有关节炎或关节损伤的遗传或家族史的情况下，或在关节手术之前或期间，或在关节炎或关节损伤的风险增加的其他情况下。用本发明的化合物、组合物和方法治疗或预防的示例性病况或病症包括但不限于系统性类风湿性关节炎、青少年慢性关节炎、骨关节炎、退行性椎间盘疾病、脊椎关节病和系统性硬化症(硬皮病)。在本发明的一些实施方案中，本发明的化合物、组合物和方法可用于治疗骨关节炎。在一些实施方案中，关节炎可以是骨关节炎、创伤性关节炎、退行性椎间盘疾病、掌腱膜挛缩症或肌腱疾病。
在一些实施方案中，本发明的化合物、组合物和方法提供用于在由于创伤性损伤或软骨病而受损的软骨组织中刺激软骨细胞增殖和软骨产生的方法。创伤性损伤可以包括但不限于关节的钝伤或韧带受损，如前交叉韧带撕裂、内侧副韧带或半月板撕裂。表现出关节表面并因此特别易受治疗影响的组织的实例包括但不限于脊柱、肩、肘、腕、手指关节、髋、膝盖、踝和脚关节。可受益于治疗的疾病的实例包括骨关节炎、类风湿性关节炎、其他自身免疫性疾病或剥脱性骨软骨炎。此外，软骨畸形通常在人的侏儒症形式中出现，表明该化合物、组合物和方法对这些患者将会是有用的。
预期本发明的化合物、组合物和方法可用于治疗哺乳动物。本文所用，“哺乳动物”是指归类为哺乳动物的任何哺乳动物，包括人、家养动物和农场动物，以及动物园动物、运动动物或宠物，如牛(例如奶牛)、马、狗、绵羊、猪、兔、山羊、猫等。在一些实施方案中，该哺乳动物可以是人、狗、猫或马。在本发明的一些实施方案中，该哺乳动物是人。在一些实施方案中，该哺乳动物是狗、猫或马。在一些实施方案中，该哺乳动物是牛、绵羊、猪、山羊或兔。在一些实施方案中，该哺乳动物是家养动物或牲畜。在进一步的实施方案中，该家养动物或牲畜是狗、猫或马。在一些实施方案中，该哺乳动物是伴侣动物。如本文所用，“伴侣动物”是指狗、猫、啮齿动物和兔。在一些实施方案中，该哺乳动物是伴侣动物或牲畜。在一些实施方案中，该哺乳动物是牲畜。
本发明的化合物还可用于诱导间充质干细胞(MSC)向软骨细胞的分化。在一些实施方案中，本发明提供了诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，该方法包括将间充质干细胞暴露于足够量的本发明化合物，从而诱导干细胞向软骨细胞的分化。
MSC是多能干细胞，其可以分化成几种不同类型的细胞，包括但不限于成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。分化是从低特化细胞类型形成特化细胞类型，例如从MSC形成软骨细胞的过程。在一些实施方案中，该方法在体外进行。在一些实施例中，该方法在哺乳动物体内进行，且干细胞存在于该哺乳动物体内。在某些实施方案中，该哺乳动物是人、狗、猫或马。在某些实施方案中，该哺乳动物是人。在某些实施方案中，该哺乳动物是狗、猫或马。
该哺乳动物可以被诊断或认定为患有中度至重度症状性骨关节炎。例如，该哺乳动物可以被诊断或认定为患有中度至重度症状性膝骨关节炎。在一些实施方案中，该哺乳动物患有1级(或KL-1)骨关节炎，如通过Kellgren-Lawrence系统所测定的。在一些实施方案中，该哺乳动物患有2级(或KL-2)骨关节炎，如通过Kellgren-Lawrence系统所测定的。在一些实施方案中，该哺乳动物患有3级(或KL-3)骨关节炎，如通过Kellgren-Lawrence系统所测定的。在一些实施方案中，该哺乳动物患有4级(或KL-4)骨关节炎，如通过Kellgren-Lawrence系统所测定的。在一些实施方案中，向哺乳动物，例如，患有1级骨关节炎的哺乳动物施用化合物A作为预防措施。
在一些实施方案中，该哺乳动物患有单侧膝骨关节炎。在一些实施方案中，该哺乳动物患有双侧膝骨关节炎。
在一些实施方案中，该哺乳动物超重或肥胖。在一些实施方案中，该哺乳动物具有在约25至约30之间的体重指数(BMI)，例如BMI为25、26、27、28或29。在一些实施方案中，该哺乳动物具有30或更大的BMI，如30、31、32、33、34、35、40或40以上。
监测骨关节炎的进展和/或治疗的一种方法涉及测量关节间隙。随着软骨退化或磨损，可以观察到受影响关节的关节间隙变窄(关节间隙狭窄)。考虑到测量软骨的难度，关节间隙宽度(JSW)测量通常被认为是关节软骨厚度的替代，因为这种测量涉及测定两骨之间的距离(例如，使用X射线技术)。不受任何理论的约束，JSW的增加是软骨生长的指标。JSW的测量方法可以在受影响关节的射线照相成像之后完成。测量可以是使用卡尺或简单的刻度尺和测微目镜的手动测量，或者是使用计算机软件的半自动化测量。在一些实施方案中，JSW测量可以涉及对膝盖拍摄的射线照相图像(例如，X射线)。例如，跖趾、固定屈曲、半屈曲前后位(AP)和Lyon-Schuss的射线照片中的一个或多个可用于获得该测量。在一些实施方案中，在受试者站立时对其进行成像。例如，站立、固定弯曲(Synafluxer)、后前位(PA)的射线照片。
本文提供的方法可以导致在哺乳动物中化合物A的注射点周围的关节中的关节间隙宽度增加。本文提供的方法可以导致在哺乳动物中的注射点周围的关节中的关节间隙宽度增加约5％至约50％。例如，注射点周围的关节中的关节间隙宽度增加约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％或约50％。在一些实施方案中，本文提供的方法在注射点周围的关节处基本上不显示关节间隙宽度的变化。这样的结果可能表明疾病症状的停止，因为没有观察到关节间隙宽度的进一步损失。本文提供的方法可以导致在哺乳动物中化合物A的注射点周围的关节中的关节间隙宽度增加约0.05mm至约2mm。本文提供的方法可以导致哺乳动物中注射点周围的关节中的关节间隙宽度增加约0.05mm、约0.1mm、约0.15mm、约0.2mm、约0.25mm、约0.3mm、约0.35mm、约0.4mm、约0.45mm、约0.5mm、约0.55mm、约0.6mm、约0.65mm、约0.7mm、约0.75mm、约0.8mm、约0.85mm、约0.9mm、约0.95mm、约1mm、约1.05mm、约1.1mm、约1.15mm、约1.2mm、约1.25mm、约1.3mm、约1.35mm、约1.4mm、约1.45mm、约1.5mm、约1.55mm、约1.6mm、约1.65mm、约1.7mm、约1.75mm、约1.8mm、约1.85mm、约1.9mm、约1.95mm或约2mm。本文提供的方法可以导致在施用后一周、或在施用后两周、或在施用后三周后、或在施用后四周后、或在施用后五周后、或在施用后六周后、或在施用后七周后、或在施用后八周后、或在施用后九周后、或在施用后10周后、或在施用后11周后、或在施用后十二周后、或在施用后24周后在哺乳动物中注射点周围的关节中关节间隙宽度的增加。
本文提供的方法可以导致在哺乳动物中化合物A的注射点周围的关节中的软骨厚度增加。本文提供的方法可以导致在哺乳动物中的注射点周围的关节中的软骨厚度增加约5％至约50％。例如，注射点周围的关节中的软骨厚度增加约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％或约50％。在一些实施方案中，本文提供的方法在注射点周围的关节中基本上不显示软骨厚度的变化。这样的结果可能表明疾病症状的停止，因为没有观察到软骨厚度的进一步损失。本文提供的方法可以导致在哺乳动物中化合物A的注射点周围的关节中的软骨厚度增加约0.05mm至约2mm。本文提供的方法可以导致哺乳动物中注射点周围的关节中的软骨厚度增加约0.05mm、约0.1mm、约0.15mm、约0.2mm、约0.25mm、约0.3mm、约0.35mm、约0.4mm、约0.45mm、约0.5mm、约0.55mm、约0.6mm、约0.65mm、约0.7mm、约0.75mm、约0.8mm、约0.85mm、约0.9mm、约0.95mm、约1mm、约1.05mm、约1.1mm、约1.15mm、约1.2mm、约1.25mm、约1.3mm、约1.35mm、约1.4mm、约1.45mm、约1.5mm、约1.55mm、约1.6mm、约1.65mm、约1.7mm、约1.75mm、约1.8mm、约1.85mm、约1.9mm、约1.95mm或约2mm。本文提供的方法可以导致在施用后一周、或在施用后两周、或在施用后三周后、或在施用后四周后、或在施用后五周后、或在施用后六周后、或在施用后七周后、或在施用后八周后、或在施用后九周后、或在施用后10周后、或在施用后11周后、或在施用后十二周后、或在施用后24周后在哺乳动物中注射点周围的关节中软骨厚度的增加。
本文提供的方法可以导致受试者的WOMAC总评分降低。本文提供的方法可以导致受试者的WOMAC总评分从基线降低。例如，受试者的WOMAC总评分从基线降低至少15分；WOMAC总评分从基线降低至少20分；或WOMAC总评分从基线降低至少25分。本文提供的方法可以导致在施用后一周、或在施用后两周、或在施用后三周后、或在施用后四周后、或在施用后五周后、或在施用后六周后、或在施用后七周后、或在施用后八周后、或在施用后九周后、或在施用后10周后、或在施用后11周后、或在施用后十二周后、或在施用后24周后WOMAC总评分的降低。
WOMAC评分可以被分为个体疼痛、功能和僵硬的评分。
本文提供的方法可以导致受试者的WOMAC功能评分降低。本文提供的方法可以导致受试者的WOMAC功能评分从基线降低。例如，受试者的WOMAC功能评分从基线降低至少5分；受试者的WOMAC功能评分从基线降低至少10分；WOMAC功能评分从基线降低至少15分；WOMAC功能评分从基线降低至少20分；受试者的WOMAC功能评分从基线降低至少25分；受试者的WOMAC功能评分从基线降低至少30分；受试者的WOMAC功能评分从基线降低至少35分；或受试者的WOMAC功能评分从基线降低至少40分。本文提供的方法可以导致WOMAC功能评分从基线降低，例如，WOMAC功能评分从基线降低约10％；WOMAC功能评分从基线降低约15％；或WOMAC功能评分从基线降低约20％；WOMAC功能评分从基线降低约25％；或WOMAC功能评分从基线降低约30％；WOMAC功能评分从基线降低约35％；或WOMAC功能评分从基线降低约40％；WOMAC功能评分从基线降低约45％；或WOMAC功能评分从基线降低约50％。本文提供的方法可以导致在施用后一周、或在施用后两周、或在施用后三周后、或在施用后四周后、或在施用后五周后、或在施用后六周后、或在施用后七周后、或在施用后八周后、或在施用后九周后、或在施用后10周后、或在施用后11周后、或在施用后十二周后、或在施用后24周后WOMAC功能评分的降低。
本文提供的方法可以导致受试者的WOMAC疼痛评分降低。本文提供的方法可以导致受试者的WOMAC疼痛评分从基线降低。例如，受试者的WOMAC疼痛评分从基线降低至少6分；受试者的WOMAC疼痛评分从基线降低至少8分；WOMAC疼痛评分从基线降低至少10分；受试者的WOMAC疼痛评分从基线降低至少12分；或受试者的WOMAC疼痛评分从基线降低至少14分。本文提供的方法可以导致WOMAC疼痛评分从基线降低，例如，WOMAC疼痛评分从基线降低约10％；WOMAC疼痛评分从基线降低约15％；或WOMAC疼痛评分从基线降低约20％；WOMAC疼痛评分从基线降低约25％；或WOMAC疼痛评分从基线降低约30％；WOMAC疼痛评分从基线降低约35％；或WOMAC疼痛评分从基线降低约40％；WOMAC疼痛评分从基线降低约45％；或WOMAC疼痛评分从基线降低约50％。本文提供的方法可以导致在施用后一周、或在施用后两周、或在施用后三周后、或在施用后四周后、或在施用后五周后、或在施用后六周后、或在施用后七周后、或在施用后八周后、或在施用后九周后、或在施用后10周后、或在施用后11周后、或在施用后十二周后、或在施用后24周后WOMAC疼痛评分的降低。
本文提供的方法可以导致受试者的WOMAC僵硬评分降低。本文提供的方法可以导致受试者的WOMAC僵硬评分从基线降低。例如，受试者的WOMAC僵硬评分从基线降低至少2分；受试者的WOMAC僵硬评分从基线降低至少3分；WOMAC僵硬评分从基线降低至少4分；或WOMAC僵硬评分从基线降低至少5分。本文提供的方法可以导致WOMAC僵硬评分从基线降低，例如，WOMAC僵硬评分从基线降低约10％；WOMAC僵硬评分从基线降低约15％；或WOMAC僵硬评分从基线降低约20％；WOMAC僵硬评分从基线降低约25％；或WOMAC僵硬评分从基线降低约30％；WOMAC僵硬评分从基线降低约35％；或WOMAC僵硬评分从基线降低约40％；WOMAC僵硬评分从基线降低约45％；或WOMAC僵硬评分从基线降低约50％。本文提供的方法可以导致在施用后一周、或在施用后两周、或在施用后三周后、或在施用后四周后、或在施用后五周后、或在施用后六周后、或在施用后七周后、或在施用后八周后、或在施用后九周后、或在施用后10周后、或在施用后11周后、或在施用后十二周后、或在施用后24周后WOMAC僵硬评分的降低。
本文提供的方法可以导致受试者的WORMS评分(全器官磁共振成像评分)降低。本文提供的方法可以导致受试者的WORMS评分从基线降低。例如，受试者的WORMS评分从基线降低至少10分；受试者的WORMS评分从基线降低至少15分；WORMS评分从基线降低至少20分；或WORMS评分从基线降低至少25分；或WORMS评分从基线降低至少30分；或WORMS评分从基线降低至少35分；或WORMS评分从基线降低至少40分；或WORMS评分从基线降低至少45分；或WORMS评分从基线降低至少50分；或WORMS评分从基线降低至少55分；或WORMS评分从基线降低至少60分；或WORMS评分从基线降低至少65分；或WORMS评分从基线降低至少70分；或WORMS评分从基线降低至少75分；或WORMS评分从基线降低至少80分；或WORMS评分从基线降低至少85分；或WORMS评分从基线降低至少90分；或WORMS评分从基线降低至少95分；或WORMS评分从基线降低至少100分。本文提供的方法可以导致WORMS评分从基线降低，例如，WORMS评分从基线降低约10％；WORMS评分从基线降低约15％；或WORMS评分从基线降低约20％；WORMS评分从基线降低约25％；或WORMS评分从基线降低约30％；WORMS评分从基线降低约35％；或WORMS评分从基线降低约40％；WORMS评分从基线降低约45％；或WORMS评分从基线降低约50％。本文提供的方法可以导致在施用后一周、或在施用后两周、或在施用后三周后、或在施用后四周后、或在施用后五周后、或在施用后六周后、或在施用后七周后、或在施用后八周后、或在施用后九周后、或在施用后10周后、或在施用后11周后、或在施用后十二周后、或在施用后24周后WORMS评分的降低。
本文提供的方法可以导致IIA型胶原N-前肽(PIIANP)血清水平的升高。II型胶原是软骨基质中最丰富的蛋白质，并且认为这种分子周转的改变在骨关节炎中软骨的进行性损失中起作用。II型前胶原以两种剪接形式，IIA型和IIB型合成。IIA型胶原N-前肽(PIIANP)可被特异性地测量，并可代表软骨细胞表型变化的生物标志物。已经表明，在膝骨关节炎患者中IIA型前胶原氨基末端前肽(PIIANP)的血清水平降低。PIIANP血清水平可用作II型胶原合成的潜在生物标志物。
本文提供的方法可以导致IIA型胶原N-前肽(PIIANP)血清水平的升高，例如，IIA型胶原N-前肽(PIIANP)血清水平升高约5％至约50％，或IIA型胶原N-前肽(PIIANP)血清水平从基线升高约5％；或IIA型胶原N-前肽(PIIANP)血清水平从基线升高约10％；或IIA型胶原N-前肽(PIIANP)血清水平从基线升高约15％；或IIA型胶原N-前肽(PIIANP)血清水平从基线升高约20％；或IIA型胶原N-前肽(PIIANP)血清水平从基线升高约25％；或IIA型胶原N-前肽(PIIANP)血清水平从基线升高约30％；或IIA型胶原N-前肽(PIIANP)血清水平从基线升高约35％；或IIA型胶原N-前肽(PIIANP)血清水平从基线升高约40％；或IIA型胶原N-前肽(PIIANP)血清水平从基线升高约45％；或IIA型胶原N-前肽(PIIANP)血清水平从基线升高约50％。本文提供的方法可以导致在施用后一周、或在施用后两周、或在施用后三周后、或在施用后四周后、或在施用后五周后、或在施用后六周后、或在施用后七周后、或在施用后八周后、或在施用后九周后、或在施用后10周后、或在施用后11周后、或在施用后十二周后、或在施用后24周后IIA型胶原N-前肽(PIIANP)血清水平的升高。
化合物A的制备
本文描述了用于诱导间充质干细胞向软骨细胞分化并且用于减轻哺乳动物的关节炎或关节损伤的化合物A，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及制备这种化合物的方法。还提供了包含化合物A或该化合物的药学上可接受的盐或溶剂化物以及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
本文所述的化合物A可使用本领域技术人员已知的标准合成反应或使用本领域已知的方法来合成。可以以线性顺序采用反应来提供化合物A，或者可使用这些反应来合成片段，随后通过本领域已知的方法进行连接。
用于合成化合物A的起始材料可以合成或可从商业来源获得，该商业来源例如是但不限于Aldrich Chemical Co.(Milwaukee,Wisconsin)、Bachem(Torrance,California)或Sigma Chemical Co.(St.Louis,Mo.)。化合物A及其他具有不同取代基的相关化合物可使用本领域技术人员已知的技术和材料来合成，例如使用描述于诸如以下的技术和材料：March,ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY,第4版.,(Wiley 1992)；Carey和Sundberg,ADVANCEDORGANIC CHEMISTRY,第4版.,Vols.A和B(Plenum 2000,2001)；Green和Wuts,PROTECTIVEGROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS,第3版,(Wiley 1999)；Fieser and Fieser’s Reagentsfor Organic Synthesis,Volumes 1-17(John Wiley and Sons,1991)；Rodd’s Chemistryof Carbon Compounds,Volumes 1-5 and Supplementals(Elsevier SciencePublishers,1989)；Organic Reactions,Volumes 1-40(John Wiley and Sons,1991)；以及Larock’s Comprehensive Organic Transformations(VCH Publishers Inc.,1989)。(所有这些均通过引用整体并入本文)。用于制备本文所公开的化合物的一般方法可从本领域已知的反应得到，并且为了引入在如本文所提供的通式中所见的各个部分，如本领域技术人员所公认的，可通过使用适当的试剂和条件对反应进行修改。
如果需要，可使用包括但不限于过滤、蒸馏、结晶及色谱法等常规技术来分离和纯化反应产物。这类材料可使用包括物理常数和波谱数据在内的常规手段来表征。
药物组合物/制剂
在另一方面，本文提供了包含化合物A，或其药学上可接受的盐或溶剂化物以及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在一些实施方案中，将化合物A或其药学上可接受的盐或溶剂化物配制为药物组合物。药物组合物以常规方式使用一种或多种药学上可接受的非活性成分进行配制，该非活性成分便于将活性化合物加工成可在药学上使用的制剂。适当的制剂取决于所选择的给药途径。本文所述的药物组合物的概述可见于，例如，Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第十九版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；Liberman,H.A.和Lachman,L.编著,Pharmaceutical DosageForms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980；以及Pharmaceutical Dosage Forms andDrug Delivery Systems,第七版(Lippincott Williams&Wilkins 1999)，这些公开文献通过引用并入本文。
本文提供了包含化合物A，或其药学上可接受的盐或溶剂化物以及至少一种药学上可接受的非活性成分的药物组合物。在一些实施方案中，本文所述的化合物作为药物组合物施用，在该药物组合物中本文所述的化合物与其他活性成分混合，如在联合治疗中。在其他实施方案中，药物组合物包含其他医学或药学制剂、载体、佐剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶解促进剂(solution promoter)、用于调节渗透压的盐和/或缓冲液。在又一些实施方案中，药物组合物包含其他有治疗价值的物质。
本文所使用的药物组合物是指化合物A或其药学上可接受的盐或溶剂化物与其他化学组分(即，药学上可接受的非活性成分)的混合物，所述其他化学组分例如是载体、赋形剂、粘合剂、填充剂、悬浮剂、矫味剂、甜味剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂、稀释剂、增溶剂、湿润剂、增塑剂、稳定剂、渗透促进剂、润湿剂、消泡剂、抗氧化剂、防腐剂或它们的一种或多种组合。药物组合物有利于将化合物施用于生物体。在实施本文提供的治疗方法或应用的过程中，将治疗有效量的本文所述的化合物以药物组合物的形式施用于待治疗的患有疾病、病症或病况的哺乳动物。在一些实施方案中，该哺乳动物是人、狗、猫或马。在一些实施方案中，该哺乳动物是人。在一些实施方案中，该哺乳动物是狗、猫或马。治疗有效量可根据疾病的严重性、受试者的年龄和相对健康、所用化合物的效力和其他因素而发生较大变化。化合物可以单独使用或作为混合物的组分与一种或多种治疗剂组合使用。
本文所述的药物组合物可以为用于关节内注射的液体形式。本文所述的药物组合物可以包含化合物A或其药学上可接受的盐，其量为每1L关节内液体制剂约0.05g至约3g。化合物A或其药学上可接受的盐的量可以为每1L关节内液体制剂约0.05g、约0.06g、约0.07g、约0.08g、约0.09g、约0.1g、约0.2g、约0.3g、约0.4g、约0.5g、约0.6g、约0.7g、约0.8g、约0.9g、约1g、约1.1g、约1.2g、约1.3g、约1.4g、约1.5g、约1.6g、约1.7g、约1.8g、约1.9g、约2g、约2.1g、约2.2g、约2.3g、约2.4g、约2.5g、约2.6g、约2.7g、约2.8g、约2.9g或约3g。
本文所述的药物组合物可以为用于关节内注射的液体形式并可以进一步包含药学上可接受的载体。载体可以是水性载体。
本文所述的药物组合物可以为用于关节内注射的液体形式并可以进一步包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以包括溶剂、共溶剂、表面活性剂、缓冲液、增溶剂、张度剂、稳定剂、防腐剂、黏度增强剂以及消泡剂或其任意组合。制备这种药物组合物的方法对于本领域技术人员是已知的或显而易见的；例如，参见Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,第二十二版(Pharmaceutical Press,London,UK.2012)。
本文所述的药物组合物可以为用于关节内注射的液体形式并可以进一步包含溶剂。本文所述的药物组合物可以为用于关节内注射的液体形式并可以进一步包含多种溶剂。溶剂可以选自聚乙二醇类和醇类。溶剂可以选自PEG 3350和苄醇。
本文所述的药物组合物可以为用于关节内注射的液体形式并可以进一步包含共溶剂。共溶剂可以选自二醇，如聚乙二醇(PEG 200、PEG 300或PEG 400)或丙二醇；单醇，如异丙醇、丙醇或乙醇；N,N-二甲基乙酰胺(DMA)；N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；二甲基亚砜(DMSO)；以及其任意组合。
本文所述的药物组合物可以为用于关节内注射的液体形式并可以进一步包含表面活性剂。表面活性剂的非限制性实例包括聚山梨醇酯，如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80和聚山梨醇酯85；聚氧乙烯氢化蓖麻油，如聚氧乙烯氢化蓖麻油60和蓖麻油聚烃氧酯35；失水山梨醇脂肪酸酯；蔗糖脂肪酸酯；聚氧乙烯聚氧丙烯二醇；聚氧乙烯脂肪酸醚；硬脂酸聚烃氧酯；以及其他表面活性剂，包括但不限于1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-(磷酸-s-(1-甘油))、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-(磷酸-rac-(1-甘油))、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-(磷酸-rac-(1-甘油))、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、脱氧胆酸、二棕榈酰磷脂酰甘油(dl)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(dl)、多库酯钠、蛋磷脂、棕榈酸硬脂酸甘油酯、三油酸甘油酯、氢化大豆卵磷脂、水解大豆蛋白(酶促；2000mw)、羟乙基哌嗪乙烷磺酸、卵磷脂、米吡氯铵、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-phiv、油酸、棕榈酸、PEG植物油、PEG-20失水山梨醇异硬脂酸酯、PEG-40蓖麻油、磷脂、泊洛沙姆188、聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇3350、聚乙二醇400、聚乙二醇4000、聚乙二醇600、聚氧乙烯脂肪酸酯、胆固醇酰硫酸钠、脱氧胆酸钠、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-氨基乙酸钠、油酸钠、失水山梨醇单月桂酸酯、失水山梨醇单棕榈酸酯、硬脂酸、三辛精或其混合物。
本文所述的药物组合物可以为用于关节内注射的液体形式并可以进一步包含缓冲液以维持pH在约5至约9之间。可以通过添加酸如盐酸来调节pH。可以将pH维持在适合注射的pH。可以将pH维持在pH为约5、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9或约9。缓冲剂的实例包括但不限于乙酸、乙酸酐、己二酸、丙氨酸、白蛋白、乙醇、α-环糊精、氨、乙酸铵、硫酸铵、无水柠檬酸、无水右旋糖、无水乳糖、无水柠檬酸三钠、精氨酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、氯化钙、葡庚糖酸钙、氢氧化钙、钙、辛酸、二氧化碳、柠檬酸一水合物、磷酸氢二钾、二乙醇胺、柠檬酸二钠倍半水合物、柠檬酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠钙、乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸钠、乙二胺四乙酸、乙醇胺盐酸盐、氯化铁、葡庚糖酸钠、甘氨酸盐酸盐、甘氨酸、盐酸胍、组氨酸、盐酸、异亮氨酸、乳酸、乳糖酸、亮氨酸、乙酸赖氨酸、赖氨酸、赖氨酸一水合物、氯化镁、硬脂酸镁、马来酸、偏磷酸、甲磺酸、硝酸、磷酸根离子、磷酸、氯化钾、氢氧化钾、磷酸钾(一元)、乙酸钠、抗坏血酸钠、苯甲酸钠、碳酸氢钠、硫酸氢钠、碳酸钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、次氯酸钠、二水合磷酸钠、磷酸钠、二水合磷酸氢二钠、十二水合磷酸氢二钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钠(无水)、七水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钠(无水)、二水合磷酸二氢钠、一水合磷酸二氢钠、磷酸二氢钠、硫酸钠(无水)、硫酸钠、硫代乙醇酸钠、硫代苹果酸钠、硫代硫酸钠、琥珀酸、硫酸、酒石酸、酒石酸(dl)、三氟乙酸、曲金刚胺和氨丁三醇。
本文所述的药物组合物可以为用于关节内注射的液体形式并可以进一步包含增溶剂。增溶剂的实例包括但不限于乙酰色氨酸(dl)、丙氨酸、白蛋白(聚集的)、乙醇、α-环糊精腔内粉末、氨、无水右旋糖、无水乳糖、无水柠檬酸三钠、精氨酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苄醇、苯甲酸苄酯、苄基氯、磺丁基醚-β-环糊精钠、丁醇(混合异构体)、辛酸、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、蓖麻油、胆固醇、玉米油、棉籽油、肌酸、肌酸酐、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、半胱氨酸盐酸盐、半胱氨酸、半胱氨酸(dl)、右旋糖酐40、右旋糖酐、二乙酰单甘油酯、二乙醇胺、二甲基亚砜、乙醇胺盐酸盐、乙酸乙酯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(15％乙酸乙烯酯)、γ-环糊精、明胶、龙胆酸乙醇酰胺、龙胆酸、葡糖酸内酯、葡糖醛酸、甘油、羟乙基淀粉、人白蛋白微球、透明质酸钠、羟丙基β-环糊精肌内注射剂、羟丙甲纤维素、异丙醇、甲基纤维素、甲基吡咯烷酮、微晶纤维素、N,N-二甲基乙酰胺、烟酰胺、油酸、棕榈酸、花生油、PEG植物油、PEG-20失水山梨醇异硬脂酸酯、PEG-40蓖麻油、苯乙醇、聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇3350、聚乙二醇400、聚乙二醇4000、聚乙二醇600、聚丙二醇、聚乙烯醇、罂粟籽油、聚维酮k12、聚维酮k17、聚维酮、脯氨酸、没食子酸丙酯、丙二醇、芝麻油、大豆油、淀粉、硬脂酸、三甲基甲硅烷基处理的聚二甲基硅氧烷醇/三甲基硅烷氧基硅酸酯交联聚合物、黄蜡及其组合。
本文所述的药物组合物可以为用于关节内注射的液体形式并可以进一步包含张度剂。张度剂的实例包括但不限于一水右旋糖、右旋糖溶液、右旋糖、二甲基亚砜、果糖、葡糖酸内酯、葡糖醛酸、甘油、甘氨酸盐酸盐、甘氨酸、盐酸胍、组氨酸、盐酸、高渗氯化钠溶液、异亮氨酸、异丙醇、等渗氯化钠溶液、乳酸(dl)、乳糖酸、乳糖一水合物、乳糖、亮氨酸、乙酸赖氨酸、赖氨酸、赖氨酸一水合物、氯化镁、硬脂酸镁、马来酸、甘露醇、葡甲胺、甲硫氨酸、甲基硼酸、聚丙二醇、氯化钾、氢氧化钾、磷酸钾(一元)、脯氨酸、没食子酸丙酯、丙二醇、糖精钠、丝氨酸、乙酸钠、抗坏血酸钠、苯甲酸钠、碳酸氢钠、硫酸氢钠、碳酸钠、氯化钠、柠檬酸钠、葡糖酸钠、氢氧化钠、次氯酸钠、乳酸钠、二水合磷酸钠、磷酸钠、二水合磷酸氢二钠、十二水合磷酸氢二钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钠(无水)、七水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钠(无水)、二水合磷酸二氢钠、一水合磷酸二氢钠、磷酸二氢钠、硫酸钠(无水)、硫酸钠、硫代乙醇酸钠、硫代苹果酸钠、硫代硫酸钠、山梨糖醇、琥珀酸、蔗糖、硫酸、酒石酸、酒石酸(dl)、苏氨酸、海藻糖、三氟乙酸、二水合柠檬酸三钠、氨丁三醇、色氨酸、酪氨酸、尿素、尿烷、缬氨酸及其组合。
本文所述的药物组合物可以为用于关节内注射的液体形式并可以进一步包含稳定剂。稳定剂的实例包括但不限于乙酰色氨酸(dl)、丙氨酸、白蛋白(聚集的)、乙醇、α-环糊精腔内粉末、氨、无水右旋糖、无水乳糖、无水柠檬酸三钠、精氨酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苄醇、苯甲酸苄酯、苄基氯、磺丁基醚-β-环糊精钠、硼酸、丁醇(混合异构体)、辛酸、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、蓖麻油、胆固醇、肌酸、肌酸酐、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、半胱氨酸盐酸盐、半胱氨酸、半胱氨酸(dl)、右旋糖酐40、右旋糖酐、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(15％乙酸乙烯酯)、明胶、龙胆酸乙醇酰胺、龙胆酸、羟乙基淀粉、人白蛋白微球、透明质酸钠、羟丙甲纤维素、葡甲胺、甲硫氨酸、甲基硼酸、甲基纤维素、甲基吡咯烷酮、微晶纤维素、米吡氯铵、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-phiv、N,N-二甲基乙酰胺、烟酰胺、苯基丙氨酸、聚乙烯醇、聚维酮K12、聚维酮K17、聚维酮、丝氨酸、柠檬酸钠、葡糖酸钠、乳酸钠、淀粉、苏氨酸、海藻糖、三辛精、三甲基甲硅烷基处理的聚二甲基硅氧烷醇/三甲基硅烷氧基硅酸酯交联聚合物、二水合柠檬酸三钠、色氨酸、酪氨酸、尿素、缬氨酸及其组合。
本文所述的药物组合物可以为用于关节内注射的液体形式并可以进一步包含防腐剂。防腐剂的实例包括但不限于丙酮合亚硫酸氢钠、α-生育酚、苯扎氯铵、苄醇、苯甲酸苄酯、苄基氯、硼酸、丁基羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、尼泊金丁酯、三氯叔丁醇、三氯叔丁醇半水合物、甲酚、焦碳酸二乙酯、乙二胺四乙酸二钠钙、乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸钠、乙二胺四乙酸、己基间苯二酚、间甲酚、尼泊金甲酯、米吡氯铵、一硫代甘油、氮、酚、苯乙醇、硝酸苯汞、亚硫酸氢钾、焦亚硫酸钾、尼泊金丙酯、抗坏血酸钠、苯甲酸钠、硫酸氢钠、氯酸钠、连二亚硫酸钠、甲醛合次硫酸氢钠、碘化钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、酒石酸钠、二氧化硫、亚硫酸、硫柳汞及其组合。
本文所述的药物组合物可以为用于关节内注射的液体形式并可以进一步包含黏度增强剂。黏度增强剂的实例可以包括但不限于羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(15％乙酸乙烯酯)、明胶、羟乙基淀粉、人白蛋白微球、透明质酸钠、甲基纤维素、甲基吡咯烷酮、微晶纤维素、聚乙烯醇、聚维酮K12、聚维酮K17、聚维酮、淀粉、三甲基甲硅烷基处理的聚二甲基硅氧烷醇/三甲基硅烷氧基硅酸酯交联聚合物及其组合。
本文所述的药物组合物可以为用于关节内注射的液体形式并可以进一步包含消泡剂。消泡剂的实例包括但不限于二甲硅油、聚硅氧烷、硅氧烷、西甲硅油及其组合。
稳定性
本文所述的组合物在包括冷藏、环境和加速条件的各种储存条件下是稳定的。如本文所使用的，稳定是指在给定的储存期结束时，制剂具有约95％的为化合物A的化合物和约5％或更少的总杂质或相关物质。稳定性通过HPLC或任何其他已知的测试方法来评估。稳定的制剂可能具有约5％、约4％、约3％、约2.5％、约2％、约1.5％、约1％或约0.5％的总杂质或相关物质。稳定的制剂可能具有约5％的总杂质或相关物质。稳定的制剂可能具有约4％的总杂质或相关物质。稳定的制剂可能具有约3％的总杂质或相关物质。稳定的制剂可能具有约2％的总杂质或物质。稳定的制剂可能具有约1％的总杂质或相关物质。稳定的制剂在给定的储存期结束时可能具有约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的化合物A。
在冷藏和环境条件下，本文所述的制剂稳定至少1个月。在冷藏和环境条件下，本文所述的制剂稳定至少30天、至少29天、至少28天、至少27天、至少26天、至少25天、至少24天、至少23天、至少22天、至少21天、至少20天、至少19天、至少18天、至少17天、至少16天、至少15天、至少14天、至少13天、至少12天、至少11天、至少10天、至少9天、至少8天、至少7天、至少6天、至少5天、至少4天、至少3天、至少2天或至少1天。在一些情况下，冷藏条件为约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃或约8℃。在其他情况下，冷藏条件为约4℃。
在加速条件下，本文所述的制剂稳定至少1个月。在加速条件下，本文所述的制剂稳定至少30天、至少29天、至少28天、至少27天、至少26天、至少25天、至少24天、至少23天、至少22天、至少21天、至少20天、至少19天、至少18天、至少17天、至少16天、至少15天、至少14天、至少13天、至少12天、至少11天、至少10天、至少9天、至少8天、至少7天、至少6天、至少5天、至少4天、至少3天、至少2天或至少1天。加速条件包括高于环境水平(例如25±5℃；55±10％RH)的温度和/或相对湿度(RH)。在一些情况下，加速条件为约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃或约60℃。在其他情况下，加速条件为高于65％RH、约70％RH、约75％RH或约80％RH。在进一步的情况下，加速条件为在环境湿度下约40℃或60℃。在更进一步的情况下，加速条件为在75±5％RH湿度下约40℃。环境条件包括在环境水平的温度和/或相对湿度(RH)(例如25±5℃；55±10％RH)。在一些情况下，环境条件为约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃或约30℃。在其他情况下，环境条件为约45％RH、约50％RH、约55％RH、约60％RH或约65％RH。冷藏条件包括典型冷藏单元中的温度和/或相对湿度(RH)(例如，5±3℃)。
剂量
所施用的包含化合物A或其药学上可接受的盐或溶剂化物的药物组合物的量首先取决于所治疗的哺乳动物。在将药物组合物施用给人类个体的情况下，日剂量将通常由处方医师确定，剂量常根据个体的年龄、性别、饮食、体重、一般健康状况和反应、个体症状的严重性、所治疗的确切适应症或病况、所治疗的适应症或病况的严重性、施用时间、组合物的处置、***速率、药物组合和处方医师的判断而变化。优选地，通过关节内注射将药物组合物施用到关节例如膝盖中。在一些情况下，可以用小于最佳剂量的较小剂量开始治疗，然后，可以少量增加剂量直到达到在该情况下的最佳效果。本文的组合物以及适用的其他治疗剂和/或疗法的施用量和频率将根据主治临床医生(医师)在考虑如上所述的这些因素的情况下的判断来调节。因此，待施用的药物组合物的量可以广泛地变化。
本文的包含化合物A或其药学上可接受的盐或溶剂化物的组合物的关节内施用的量可为约10μg至约1000μg。特定的治疗剂量可以包括例如约10μg至约50μg、约10μg至约100μg、约10μg至约200μg、约10μg至约300μg、约10μg至约400μg、约10μg至约500μg、约10μg至约600μg、约10μg至约700μg、约10μg至约800μg、约10μg至约900μg、约10μg至约1000μg、约50μg至约100μg、约50μg至约200μg、约50μg至约300μg、约50μg至约400μg、约50μg至约500μg、约50μg至约600μg、约50μg至约700μg、约50μg至约800μg、约50μg至约900μg、约50μg至约1000μg、约100μg至约200μg、约100μg至约300μg、约100μg至约400μg、约100μg至约500μg、约100μg至约600μg、约100μg至约700μg、约100μg至约800μg、约100μg至约900μg、约100μg至约1000μg、约100μg至约150μg、约150μg至约200μg、约200μg至约250μg、约250μg至约300μg、约300μg至约350μg、约350μg至约400μg、约400μg至约450μg、约500μg至约550μg、约550μg至约600μg、约600μg至约650μg、约650μg至约700μg、约700μg至约750μg、约750μg至约800μg、约800μg至约950μg、约950μg至约1000μg或其间的任何范围。在一些情况下，每个关节施用约10μg至约100μg。在一些情况下，每个关节施用约50μg至约200μg。在一些情况下，每个关节施用约200μg至约800μg。在一些情况下，治疗剂量小于约1000μg、小于约900μg、小于约800μg、小于约700μg、小于约600μg、小于约500μg、小于约400μg、小于约300μg、小于约200μg或小于约100μg。在一些情况下，每个关节的治疗剂量不超过约1000μg、不超过约900μg、不超过约800μg、不超过约700μg、不超过约600μg、不超过约500μg、不超过约400μg、不超过约300μg、不超过约200μg或不超过约100μg。每个关节的特定治疗剂量可以包括例如约10μg至约50μg、约10μg至约100μg、约10μg至约200μg、约10μg至约300μg、约10μg至约400μg、约10μg至约500μg、约10μg至约600μg、约10μg至约700μg、约10μg至约800μg、约10μg至约900μg、约10μg至约1000μg、约50μg至约100μg、约50μg至约200μg、约50μg至约300μg、约50μg至约400μg、约50μg至约500μg、约50μg至约600μg、约50μg至约700μg、约50μg至约800μg、约50μg至约900μg、约50μg至约1000μg、约100μg至约200μg、约100μg至约300μg、约100μg至约400μg、约100μg至约500μg、约100μg至约600μg、约100μg至约700μg、约100μg至约800μg、约100μg至约900μg、约100μg至约1000μg、约100μg至约150μg、约150μg至约200μg、约200μg至约250μg、约250μg至约300μg、约300μg至约350μg、约350μg至约400μg、约400μg至约450μg、约500μg至约550μg、约550μg至约600μg、约600μg至约650μg、约650μg至约700μg、约700μg至约750μg、约750μg至约800μg、约800μg至约950μg、约950μg至约1000μg或其间的任何范围。在一些情况下，每个哺乳动物施用约10μg至约100μg。在一些情况下，每个哺乳动物施用约50μg至约200μg。在一些情况下，每个哺乳动物施用约200μg至约800μg。在一些情况下，治疗剂量小于约1000μg、小于约900μg、小于约800μg、小于约700μg、小于约600μg、小于约500μg、小于约400μg、小于约300μg、小于约200μg或小于约100μg。在一些情况下，每个哺乳动物的治疗剂量不超过约1000μg、不超过约900μg、不超过约800μg、不超过约700μg、不超过约600μg、不超过约500μg、不超过约400μg、不超过约300μg、不超过约200μg或不超过约100μg。每个哺乳动物的特定治疗剂量可以包括例如约10μg至约50μg、约10μg至约100μg、约10μg至约200μg、约10μg至约300μg、约10μg至约400μg、约10μg至约500μg、约10μg至约600μg、约10μg至约700μg、约10μg至约800μg、约10μg至约900μg、约10μg至约1000μg、约50μg至约100μg、约50μg至约200μg、约50μg至约300μg、约50μg至约400μg、约50μg至约500μg、约50μg至约600μg、约50μg至约700μg、约50μg至约800μg、约50μg至约900μg、约50μg至约1000μg、约100μg至约200μg、约100μg至约300μg、约100μg至约400μg、约100μg至约500μg、约100μg至约600μg、约100μg至约700μg、约100μg至约800μg、约100μg至约900μg、约100μg至约1000μg、约100μg至约150μg、约150μg至约200μg、约200μg至约250μg、约250μg至约300μg、约300μg至约350μg、约350μg至约400μg、约400μg至约450μg、约500μg至约550μg、约550μg至约600μg、约600μg至约650μg、约650μg至约700μg、约700μg至约750μg、约750μg至约800μg、约800μg至约950μg、约950μg至约1000μg或其间的任何范围。
包含化合物A或其药学上可接受的盐或溶剂化物的组合物的关节内施用的量可为约10μg、约15μg、约20μg、约25μg、约30μg、约35μg、约40μg、约45μg、约50μg、约55μg、约60μg、约65μg、约70μg、约75μg、约80μg、约85μg、约90μg、约95μg、约100μg、约110μg、约120μg、约130μg、约140μg、约150μg、约160μg、约170μg、约180μg、约190μg、约200μg、约210μg、约220μg、约230μg、约240μg、约250μg、约260μg、约270μg、约280μg、约290μg、约300μg、约310μg、约320μg、约330μg、约340μg、约350μg、约360μg、约370μg、约380μg、约390μg、约400μg、约450μg、约500μg、约550μg、约600μg、约650μg、约700μg、约750μg、约800μg、约850μg、约900μg、约950μg或约1000μg。在一些情况下，治疗剂量不超过约1000μg、不超过约900μg、不超过约800μg、不超过约700μg、不超过约600μg、不超过约500μg、不超过约400μg、不超过约300μg、不超过约200μg或不超过约100μg。在一些情况下，以1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次注射施用治疗剂量。例如，治疗剂量被施用一次。作为另一实例，治疗剂量被施用2、3或4次。在一些情况下，低于上述范围的下限的剂量水平可能是足够的，而在其他情况下，可以使用更大的剂量而不引起任何有害的副作用，例如通过将这样的更大剂量分成几个小剂量。实例中描述的组合物的治疗剂量也可用于治疗。
在一些实施方案中，包含化合物A或其药学上可接受的盐或溶剂化物的组合物以单剂量或多剂量施用，该多剂量每一周、两周、三周、四周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月或十二个月施用一次。在一些情况下，组合物每三个月施用一次。在一些情况下，组合物每四个月施用一次。在一些情况下，组合物每五个月施用一次。在一些情况下，组合物每六个月施用一次。在一些情况下，组合物每七个月施用一次。在一些情况下，组合物每八个月施用一次。在一些情况下，组合物每九个月施用一次。在一些情况下，组合物每十个月施用一次。在一些情况下，组合物每十一个月施用一次。在一些情况下，组合物每十二个月施用一次。在一些情况下，组合物每周施用，持续不超过五周。
在一些实施方案中，包含化合物A或其药学上可接受的盐或溶剂化物的组合物以约0.5mL至约10mL的总体积以单剂量或多剂量施用。在一些情况下，组合物以约0.5mL至约10mL、约0.5mL至约9mL、约0.5mL至约8mL、约0.5mL至约7mL、约0.5mL至约6mL、约0.5mL至约5mL、约0.5mL至约4mL、约0.5mL至约3mL、约0.5mL至约2mL、约0.5mL至约1mL、约1mL至约9mL、约1mL至约8mL、约1mL至约7mL、约1mL至约6mL、约1mL至约5mL、约1mL至约4mL、约1mL至约3mL、约1mL至约2mL、约1.5mL至约5mL、约1.5mL至约4mL、约1.5mL至约3mL、约1.5mL至约2mL、约2mL至约5mL、约2mL至约4mL或约2mL至约3mL的总体积施用。在一些情况下，组合物的总体积不超过约10mL、不超过约9mL、不超过约8mL、不超过约7mL、不超过约6mL、不超过约5mL、不超过约4mL、不超过约3mL、不超过约2mL或不超过约1mL。在一些情况下，组合物的总体积为约10mL、约9mL、约8mL、约7mL、约6mL、约5mL、约4mL、约3mL、约2mL或约1mL。
在一些实施方案中，包含化合物A或其药学上可接受的盐或溶剂化物的组合物以约50μg/mL至约1000μg/mL、约50μg/mL至约900μg/mL、约50μg/mL至约800μg/mL、约50μg/mL至约700μg/mL、约50μg/mL至约600μg/mL、约50μg/mL至约500μg/mL、约50μg/mL至约400μg/mL、约50μg/mL至约300μg/mL、约50μg/mL至约200μg/mL、约50μg/mL至约100μg/mL、约100μg/mL至约1000μg/mL、约100μg/mL至约900μg/mL、约100μg/mL至约800μg/mL、约100μg/mL至约700μg/mL、约100μg/mL至约600μg/mL、约100μg/mL至约500μg/mL、约100μg/mL至约400μg/mL、约100μg/mL至约300μg/mL或约100μg/mL至约200μg/mL化合物的化合物浓度施用。在一些情况下，组合物以至少约100μg/mL、约150μg/mL、约200μg/mL、约250μg/mL、约300μg/mL、约350μg/mL、约400μg/mL、约450μg/mL或约500μg/mL化合物的化合物组合物施用。
联合治疗
本发明的化合物和组合物可以与其他适于改善关节炎或关节损伤的组分联合使用。在一些实施方案中，组合物可进一步包含对于治疗哺乳动物的关节炎或关节损伤和/或与关节炎或关节损伤相关的症状在治疗上有效的另外的化合物。在一些实施方案中，组合物还可以包含非类固醇抗炎药(NSAID)、镇痛剂、糖皮质激素、血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)或其软骨发生变体、口服鲑鱼降钙素、SD-6010(iNOS抑制剂)、维生素D3(胆钙化醇)、胶原水解物、FGF18、BMP7、鳄梨大豆未皂化物(ASU)或透明质酸。ANGPTL3在WO2011/008773(整体并入本文)中更详细描述。在一些实施方案中，组合物包括具有抗炎活性的药剂。在一些实施方案中，组合物包括凋亡调节剂。在某些实施方案中，凋亡调节剂是胱天蛋白酶抑制剂。凋亡/胱天蛋白酶抑制剂的一个非限制性实例是恩利卡生。在一些实施方案中，组合物包括iNOS抑制剂。iNOS抑制剂的一个非限制性实例是SD-6010。
NSAIDS包括但不限于阿司匹林、二氟尼柳、双水杨酯、布洛芬、右布洛芬、萘普生、非诺洛芬、酮洛芬、右酮洛芬、氟比洛芬、奥沙普秦、洛索洛芬、吲哚美辛、托美丁、舒林酸、依托度酸、酮咯酸、萘丁美酮、双氯芬酸、吡罗昔康、美洛昔康、替诺昔康、屈噁昔康、氯诺昔康、伊索昔康、甲芬那酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸、托芬那酸、塞来考昔、帕瑞考昔、艾托考昔、芦米考昔和非罗考昔。
镇痛剂包括但不限于对乙酰氨基酚和阿片样物质(***)。阿片样物质包括但不限于右丙氧芬、可待因、曲马多、他喷他多、阿尼利定、阿法罗定、哌替啶、氢可酮、***、羟考酮、***、二醋***、氢***酮、羟***酮、左啡诺、7-羟基帽柱木碱、丁丙诺啡、芬太尼、舒芬太尼、bromadol、埃托啡、二氢埃托啡和卡芬太尼。
糖皮质激素包括但不限于氢化可的松、可的松、***、***龙、甲泼尼龙、***、倍他米松、曲安西龙、倍氯米松或氟氢可的松。
化合物A或其药学上可接受的盐或溶剂化物可与一种或多种对于治疗关节炎或关节损伤和/或与关节炎或关节损伤相关的症状在治疗上有效的化合物联合使用。这类另外的化合物可以通过常用的途径和量与本文公开的化合物同时或顺序施用。当本文公开的化合物与一种或多种这类另外的化合物同时使用时，优选包含这类其他药物和本发明化合物的单位剂量形式的药物组合物。然而，联合治疗还可以包括其中本文公开的化合物和一种或多种另外的化合物在不同的重叠时间表上施用的疗法。还考虑到，当与一种或多种另外的化合物联合使用时，化合物可以以比每种单独使用时更低的剂量使用。
上述联合不仅包括化合物A或其药学上可接受的盐或溶剂化物与一种对于治疗关节炎或关节损伤和/或与关节炎或关节损伤相关的症状在治疗上有效的化合物联合，而且包括其与两种或更多种这样的化合物联合。同样地，本文公开的化合物，无论是与对于治疗关节炎或关节损伤和/或与关节炎或关节损伤相关的症状在治疗上有效的化合物联合还是仅其自身，均可以与用于预防、治疗、控制或改善骨关节炎或关节损伤或与骨关节炎或关节损伤相关的状况的其他药物联合使用。这类其他药物可以通过常用的途径和量与本文公开的化合物同时或顺序施用。当本文公开的化合物A与一种或多种其他药物同时使用时，优选除本发明化合物之外还含有这类其他药物的药物组合物。因此，本发明的药物组合物还包括除了本文公开的化合物之外还含有一种或多种其他活性成分的那些药物组合物。本文公开的化合物与第二活性成分的重量比可以变化，并且将取决于每种成分的有效剂量。通常，将使用各自的有效剂量。
药物组合物的施用
在一个方面，包含化合物A或其药学上可接受的盐或溶剂化物的组合物通过关节内注射施用。在一些情况下，组合物施用到膝盖。在一些实施方案中，在注射组合物之前从膝盖抽吸过量流体。必要时可以使用超声来引导该程序。IA注射途径可能因关节而异，即在将IA注射到膝盖的情况下，膝关节的滑液体积和流动性将不同于髋关节或脊柱关节。
实施例
实施例1：人软骨细胞分化试验
将人MSC(50,000个)铺板于96孔板的每个孔中并培养过夜。将化合物A(在DMSO溶液中)以1μM的最终浓度添加到细胞，并将细胞在5％CO2、37℃下培养7天。将细胞用10％***溶液在室温下固定10min，并使用对II型胶原具有特异性的抗体(Abcam)、对Sox9具有特异性的抗体(Santa Cruz)和对软骨寡聚基质蛋白具有特异性的抗体(COMP，SantaCruz)以及荧光标记的第二抗体(Li-Cor)进行免疫染色。使用Oddyssey CLx成像系统(Li-Cor)测量染色的总强度。媒介物(DMSO)用作对照以确定软骨细胞分化的基础水平。结果示于表1中[A：与媒介物对照相比染色强度增加>50％；B：与媒介物对照相比染色强度增加30-50％]。
表1
实施例2：化合物A细胞生存力试验
将人MSC、软骨细胞、成骨细胞和滑膜细胞以10,000个细胞/孔铺板到384孔板中。以最终浓度100μM添加化合物A。将细胞培养48小时。使用EnVision读板仪(PerkinElmer)，通过Cell Titer-Glo(Promega)分析细胞生存力。使用EnVision读板仪(PerkinElmer)，通过胱天蛋白酶3/7-Glo(Promega)试验来分析凋亡活性。
实施例3：通过大鼠关节内注射进行的化合物A PK研究
将30μl化合物A溶液(100μM，在含有0.1％DMSO的PBS中)注射到每只大鼠右膝的关节间隙中。在注射后1、3、4、6、7、8、9和10小时对动物放血。在给药后2或12小时将动物处死。收集所注射膝盖的血浆和关节灌洗液。使用LCMS分析所注射化合物的量。
实施例4：大鼠内侧半月板撕裂(MMT)骨关节炎(OA)模型
将每只动物的右膝内侧半月板通过手术撕裂以诱导OA。化合物A溶液(30μl，100μM，在含有0.1％DMSO的PBS溶液中)的给药在手术后7天开始，每周一剂，持续三周。在给药前每周监测体重和步态缺陷。在手术后28天将动物处死。处理经手术膝盖的关节并对软骨进行组织化学染色，并评估软骨。
在5％甲酸脱钙剂中4-6天后，将经手术关节在额面切成两个大致相等的半部并包埋在石蜡中。以约200μm的步距从每个经手术右膝(g1-8)切出三个切片，并用甲苯胺蓝染色。从组1的左膝和组9的右膝制备单一切片，并用甲苯胺蓝染色。
用显微镜分析每个经手术膝盖的所有三个切片。针对总的软骨变性、蛋白聚糖损失、胶原受损和骨赘形成，确定每个载玻片上两个半部的最坏情况。然后，将三个切片中每个参数的值平均，以确定总主观评分。
此外，对于一些参数(下面指出)，通过将每个切片分成三个区域(1-外侧，2-中间，3-内侧)来考虑胫骨平台上的区域差异。在手术OA模型中，三分中的外侧(z1)和中间(z2)受到最严重的影响，而三分中的内侧(z3)存在较轻微的变化。当区域单独评分时，基于受影响区域的面积百分比来分配评分。使用目镜测微器划定区域面积。
对以下参数进行衡量和/或评分：
总体软骨变性包括软骨细胞死亡/损失、蛋白聚糖损失和胶原损失或纤维化的重要参数。使用以下标准在每个区域对胫骨中的软骨变性进行无至严重的评分(数值0-5)：
·0＝无变性
·1＝最小变性，5-10％基质的区域由于明显的软骨细胞损失(大于正常细胞密度的50％)而显示无法存活。PG损失通常存在于这些细胞损失区域中，并且可能存在胶原基质损失。
·2＝轻微变性，11-25％的基质区由于显著的软骨细胞损失(大于正常细胞密度的50％)而显示无法存活。PG损失通常存在于这些细胞损失区域中，并且可能存在胶原基质损失。
·3＝中度变性，26-50％的基质区由于显著的软骨细胞损失(大于正常细胞密度的50％)而显示无法存活。PG损失通常存在于这些细胞损失区域中，并且可能存在胶原基质损失。
·4＝显著变性，51-75％的基质区由于显著的软骨细胞损失(大于正常细胞密度的50％)而显示无法存活。PG损失通常存在于这些细胞损失区域中，并且可能存在胶原基质损失。
·5＝严重变性，76-100％的基质区由于显著的软骨细胞损失(大于正常细胞密度的50％)而显示无法存活。PG损失通常存在于这些细胞损失区域中，并且可能存在胶原基质损失。
在一些情况下，图像分析可用于确定每个区域或选定区域中的基质生存力和/或损失的确切百分比，使得可以比较绝对百分比而非评分(0-5)。除了表示每个区域的数据之外，还计算软骨变性的3区域总和。
除了由于病变不以区域模式总体分布在表面上而未基于区域对病变进行分析外，将相同的过程应用于股骨软骨的评估。确定载重表面的总宽度(对于股骨为大约2000μm)，并将上述标准应用于受到最严重影响的1/3、2/3或3/3。例如，如果总面积的1/3(病变可在覆盖约667μm的平台中心)具有最小变性(总面积的5-10％具有软骨细胞和/或基质损失)，则指定评分为1。如果该最小变性在整个表面上延伸(3/3)，则评分为3。如果由于严重的弥漫性变性而导致整个股骨软骨缺失，则评分为15。
除了这种整体软骨变性评分之外，还单独对胶原基质受损进行评分，以便鉴定药剂的更特异的作用。通过测量以下各项的总宽度来衡量中间胫骨平台(两个半部中受影响最严重的部分)上的胶原受损：
·全部受损(从浅表到全厚度损失的纤维化)
·严重受损(到潮标的胶原全部或几乎全部损失，＞90％厚度)
·显著受损(延伸通过软骨厚度的61-90％)
·中度受损(延伸通过软骨厚度的31-60％)
·轻微受损(延伸通过软骨厚度的11-30％)
·最小受损(非常浅表，仅影响上部10％)。
除了上述主观的一般软骨评分之外，进行两种软骨变性宽度测量：
·胫骨软骨总变性宽度(μm)是对胫骨平台受任何类型变性(细胞损失、蛋白聚糖损失或胶原受损)影响的总程度的微米测量。这种测量从具有相邻软骨变性的骨赘起(外侧1/3)跨表面延伸直到切向层和下层软骨呈现组织学正常的点。
·实质性软骨变性宽度(μm)反映这样的胫骨软骨变性区域，其中软骨细胞和蛋白聚糖损失延伸通过大于50％的软骨厚度。通常，胶原受损对于该参数而言是轻微的(25％深度)或更深，但是软骨细胞和蛋白聚糖损失延伸到软骨深度的至少50％或更深。
在胫骨表面上的三个区域中的每一个中，在区域的中点处，在具有最大病变严重性的区域中获取任何类型的病变(软骨细胞和蛋白聚糖二者的损失，但是胶原基质可以良好保留，并且没有原纤维形成)的微米深度，表示为变化区域的深度相对于到潮标的深度的比率。这种测量是对存在的任何类型的微观变化的最关键的分析。当量度在区域中点处获取时，分母可作为三个区域的每一个中软骨厚度的平均量度以用于比较合成代谢。
骨赘的评分和向小、中和大的分类用目镜测微器完成。边缘区增殖变化必须≥200μm以便测量和认定为骨赘。根据以下标准，给每个部分中的最大骨赘(通常在胫骨中发现)指定评分：
·1＝小至多299μm
·2＝中300-399μm
·3＝大400-499μm
·4＝非常大500-599
·5＝非常大≥600。
还记录实际骨赘测量值(潮标到向滑膜延伸的最远距离点)。
将股骨软骨变性评分与胫骨软骨变性评分(三个水平的平均值)的三区域总和相加，以产生总软骨变性评分。将每个关节的平均骨赘评分加到该值上以产生总关节评分。
图像分析
为了量化和比较软骨基质保留，从每只动物的受影响最严重的部分进行软骨面积测量。显微照片用CoolSNAP-Pro显微镜相机拍摄并加载到ImagePro Plus软件中。从这些显微照片的痕迹中进行下列测量，该显微照片每页四个，包括在报告中：
·从骨赘内缘测量的9cm胫骨平台(显微照片)上潮标至表面(或变性区域中的投影表面)的总面积
·总面积中非存活基质(具有少于50％的软骨细胞、蛋白聚糖和完整胶原的软骨)和无基质的面积
·总面积中无基质的面积。
从总面积中减去非存活基质的面积以得到存活基质的面积，并且从总面积中减去无基质的面积以得到剩余基质(具有或不具有软骨细胞和蛋白聚糖的胶原基质)的面积。然后再将这两个值与总面积进行比较，以得到存活基质面积百分比和剩余基质面积百分比，将它们在各组之间进行比较。来自媒介物组的五个左膝盖作为正常对照包括在该过程中。该过程可用于根据病变严重性和明显的治疗效果分析整个表面或选择的区域。
如果滑膜反应异常，则关于炎症类型和程度对其进行描述(应该主要为纤维化)并表征，但不包括在OA评分中。
使用以下标准对钙化软骨层和软骨下骨的受损(所有切片中的最坏情况)进行评分：
·0＝无变化
·1＝潮标处嗜碱性细胞增多，潮标无断裂，无骨髓变化或存在的骨髓变化是最小和局灶的
·2＝潮标处嗜碱性细胞增多，潮标钙化软骨有最小至轻微的局灶性断裂，骨髓间充质变化涉及总面积的1/4但通常限于病变下的软骨下区域
·3＝潮标处嗜碱性细胞增多，钙化软骨有轻微至显著的局灶或多灶性断裂(多灶性)，骨髓间充质变化高达总面积的3/4，骨髓软骨发生区域可能较为明显，但关节软骨没有严重塌陷成骺骨(表面明显凹陷)
·4＝潮标处嗜碱性细胞增多，钙化软骨有显著至严重断裂，骨髓间充质变化涉及高达面积的3/4，并且关节软骨在潮标起250μm或更小的深度上塌陷成骨骺(表面软骨中可见确定凹陷)
·5＝潮标处嗜碱性细胞增多，钙化软骨有显著至严重断裂，骨髓间充质变化涉及高达面积的3/4，并且关节软骨已经在潮标起超过250μm的深度上塌陷成骨骺。
此外，测量该部分的非切向区域中的内侧滑膜/侧副韧带修复的厚度。
在内侧和外侧骨骺(physis)的约中点处(为该部分的非切向区域)，测量所有膝盖中内侧和外侧上的生长板厚度(2次测量/关节)。
实施例5：大鼠关节和血浆样品中化合物A的提取和定量
使用装备有Agilent 1100HPLC和Leap Technologies自动进样器的API 3000进行化合物A或其药学上可接受的盐或溶剂化物的LC-MS/MS分析。以尺寸为2.0×50mm(零件号00B-4252-B0)，温度为30℃，流速为0.6mL/min，注射体积为10uL，运行时间为6.0min使用HPLC Phenomenex 5micron，100A Luna C18(2)分析柱。流动相A1是0.1％甲酸的水溶液，流动相B1是0.1％甲酸的乙腈溶液。梯度为在时间0时90％A1/10％B1；在时间1.0分钟时90％A1/10％B1；在时间2.0分钟时10％A1/90％B1；在时间4.0分钟时10％A1/90％B1；在时间4.10分钟时90％A1/10％B1；在时间6.0分钟时90％A1/10％B1。使用多重反应监测(MRM)定量法进行分析物和内标定量。下面列出了用于给药和测量血浆中的暴露和关节提取物中的观测浓度的具体方法。
大鼠血浆样品：通过在对照大鼠血浆中对化合物的浓缩标准溶液(spikesolution)的连续稀释来编制校准标准曲线。经由蛋白质沉淀法，通过向标准品和样品的等分添加乙腈和内标的等分来制备校准标准品和大鼠血浆样品。在涡旋混合和离心后，将来自每个标准品和样品的上清液的等分用甲酸水溶液稀释，混合和注射。在IA给药(从t＝0、0.5、1、2、4和6h开始)后收集的所有血浆样品均表明表2中所列的任何化合物均未全身暴露。
大鼠膝关节样品：通过在内标稀释液中对化合物的浓缩标准溶液的连续稀释来编制校准标准曲线。通过将内标化合物以一定浓度溶解在乙腈中来制备内标稀释液。将各时间点的大鼠膝关节样品单独粉碎，移入各离心管中，并添加1.0ml内标稀释液。将各离心管涡旋并离心30分钟。从各管移出上清液并注射到柱上以进行分析。此外，血浆样品通过眼球后取血到肝素包被的管中而获得，以-80C储存，然后通过与上文针对大鼠血浆样品所描述的方案类似的方案进行处理。
化合物施用和组织处理：将30μL 100μM的化合物A溶液(含0.1％DMSO的PBS)注射到每只动物的右后膝的关节内间隙中。在指定的时间点(0小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时和6小时)对动物实施安乐死。每个时间点使用4只动物。收获注射的膝关节，在液氮中速冻。在冻结后将整个关节磨成粉末，与1mL含内标的乙腈混合，以4℃温育过夜，涡旋并离心30min。使用LC-MS/MS分析各样品的上清液。表2显示的数据表明膝关节提取物中的观测浓度。ND＝不确定。
表2
实施例6A：化合物A的组合物
为制备适合通过注射施用的肠胃外药物组合物，将100mg化合物A或其药学上可接受的盐或溶剂化物溶解于DMSO中，然后与10ml 0.9％无菌盐水溶液混合。将该混合物并入到适合注射施用的剂量单位中。
实施例6B：化合物A的组合物
表3提供了制备1.0L 200μg/mL化合物A注射剂的配方。
表3：配方
成分
量(mg/5mL小瓶)
量(g)/1.0L
化合物A
1.0
0.20
十二水合磷酸氢二钠<sup>2</sup>
53.5
10.7
氯化钠
15.0
3.0
2M，盐酸溶液
调节到pH 7.9
调节到pH 7.9
PEG 3350
150
30.0
聚山梨醇酯80
25.0
5.0
苄醇
47.0
9.4
注射用水
QS至5.0mL<sup>1</sup>
QS至1000mL
1小瓶中过量填充10％，以便完全收回标记的体积。
2该量以用于制备磷酸盐缓冲液的量为基础。根据用于QS至最终体积的磷酸盐缓冲溶液的量，最终的量可能会更少。
磷酸盐缓冲溶液的制备
为制备缓冲溶液，称重十二水合磷酸氢二钠并添加到含有注射用水(WFI)的烧杯中。将溶液搅拌至完全溶解。称重氯化钠并添加到缓冲溶液中。将溶液搅拌至完全溶解。测量溶液的pH并添加足量HCl溶液以达到pH 7.9。用WFI进行QS。测量pH，并根据需要进行调节以达到pH 7.9。
最终本体药物溶液的制备
将PEG-3350称重到去皮的带夹套烧杯中。将天平去皮并将聚山梨醇酯80称重到带夹套烧杯中。将带夹套烧杯附于水浴槽并设置到约70℃以融化PEG-3350。将化合物A直接称重到小瓶中。添加苄醇。向小瓶中添加磁性转子，并搅拌溶液直到化合物A完全溶解。称重缓冲溶液用于冲洗。将化合物A/苄醇溶液添加到PEG-3350/聚山梨醇酯80溶液中，用预留的缓冲溶液冲洗药物小瓶，并添加药物溶液中。将所得溶液搅拌约10分钟。停止加热，并继续搅拌约10分钟。计算剩余要添加的缓冲液的量，并称重到烧杯中，然后添加到最终的本体中。冷却至室温。
填充/成瓶
将溶液通过一个0.45μm过滤器和两个0.22μm PVDF过滤器连续过滤到层流柜内的Schott瓶中。填充经灭菌的小瓶。在层流柜中塞住并压合每个小瓶。
实施例7：稳定性数据
200μg/mL的化合物A注射液(来自实施例6B)已被放置用于测试稳定性。将含有5mL化合物A注射剂的小瓶置于-20℃、5℃、25℃和40℃下保存。
分析程序
外观：在环境光下检查化合物A注射剂的透明度、颜色和有无异物。
通过HPLC鉴定：通过HPLC鉴定纯度/相关物质
梯度
时间(min)
％A
％B
0
100
0
3.5
100
0
13.5
50
50
21.0
35
65
23.5
0
100
24.0
0
100
24.1
100
0
30.0
100
0
运行时间： 30分钟
积分时间： 25分钟
样品制备：将一部分药物产品转移到HPLC小瓶中，并进行纯净注射。
定量：定量水平≥0.05％
pH：采用USP<791>方法。
克分子渗透压重量浓度：采用USP<785>方法。
颗粒物：采用USP<788>方法。
无菌性：采用USP<71>方法。
细菌内毒素：采用USP<85>方法。
含量均匀度：采用USP<905>方法。
表4至表10提供了稳定性数据表。
表4：外观、克分子渗透压重量浓度和pH的稳定性数据
表5：亚可见颗粒的稳定性数据
1其中填充体积为5mL
2每小瓶中直径≥10μm的颗粒数目＜6000＝合格，每小瓶中直径≥25μm的颗粒数目＜600＝合格
表6：稳定性分析数据
1作为理论浓度(200μg/mL)的百分比
2作为T＝0结果的百分比
表7：纯度稳定性数据
1相关物质的总和≥0.05％
表8：-20℃下的稳定性
NR＝不需要
表9：2-8℃下的稳定性
NR＝不需要
表10：25℃/60％RH下的稳定性
NR＝不需要
实施例8：通过关节内注射向患有膝骨关节炎的受试者施用化合物A的随机、双盲、安慰剂对照的剂量递增研究，用以评估安全性、耐受性、药代动力学和药效学
主要目标
评估化合物A通过关节内注射而施用至膝关节时的安全性和耐受性
主要终点
治疗期间出现的不良事件(TEAE)的发生率、相关性、严重性和持续时间
次要目标
鉴定任何剂量限制性毒性并确定化合物A的最大耐受剂量确定化合物A在血浆中的药代动力学特性
次要终点
临床实验室测试结果、生命体征或心电图(ECG)结果相对于基线的变化
体格检查的临床重要发现
化合物A在血浆中的药代动力学参数包括：最大观测血浆浓度(Cmax)、剂量调整的Cmax(Cmax/剂量)；到达最大观察血浆浓度的时间(Tmax)、从零点到最后可定量浓度的时间内血浆浓度与时间曲线下的面积(AUC0-t)、剂量调整的AUC0-t(AUC0-t/剂量)、从时间零点到无穷的AUC(AUC0-∞)、剂量调整的AUC0-∞(AUC0-∞/剂量)、终末消除率常数(λz)、终末半衰期(t1/2)、表观清除率(CL/F)和分布容积(Vz/F)
探索性目标
评估施用化合物A后软骨和骨关节炎症状的变化
收集和保存生物样本以进行探索性生物标志物研究
探索性终点
IIA型胶原N-前肽(PIIANP)血清水平，作为胶原合成的药效学标志物
II型胶原C末端交联端肽(CTX-II)的尿***，作为胶原降解的药效学标志物
膝盖的全器官磁共振成像评分(WORMS)指数相对于基线的变化
西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数(WOMAC)3.1版的总评分以及WOMAC疼痛和功能子量表评分相对于基线的变化
利用库存的生物样本进行与OA中药物反应相关的探索性研究
研究设计
这是一项随机、双盲、安慰剂对照的研究，旨在评估化合物A通过关节内注射向患有膝骨关节炎的受试者施用时的安全性、耐受性、药代动力学和药效学。所有受试者将在患病膝盖处接受5mL化合物A或安慰剂的注射。
该研究将由大约7个受试者队列组成，他们将随机接受化合物A或安慰剂。化合物A将以浓度为200μg/mL的溶液提供。化合物A将作为单剂量施用给以下队列：
剂量
N/队列
50μg/膝
4(3–活性成分&1安慰剂)
100μg/膝
4(3–活性成分&1安慰剂)
200μg/膝
8(6–活性成分&2安慰剂)
400μg/膝
8(6–活性成分&2安慰剂)
发起方将根据数据安全性监测委员会(DSMB)的建议，在对前一剂量队列的给药后第8天的所有可用安全信息进行审查(盲审)后，决定逐步提升到下一剂量队列。
一旦评估了单剂量化合物A的安全性和耐受性，就将评估化合物A的多剂量施用。在对来自单剂量队列的第29天安全性数据进行彻底审查后，将开始研究的多剂量部分。在研究的多剂量部分期间，化合物A将以4个每周剂量向以下队列施用：
剂量
N/队列
每次注射100μg/膝
12(9–活性成分&3安慰剂)
每次注射200μg/膝
12(9–活性成分&3安慰剂)
每次注射400μg/膝
12(9–活性成分&3安慰剂)
如果识别出表明计划剂量可能对研究参与者造成风险的任何安全性或耐受性问题，则可以降低在研究的单剂量或多剂量部分中向后续队列施用的剂量。根据观察到的化合物A的安全性和耐受性特征，或者如果药代动力学数据允许高于预期的剂量，同时该剂量保持在基于非临床毒理学研究的毒代动力学和安全性特征的安全暴露极限内，则可以向该研究中添加另外的剂量组。这项研究将在美国大约4个现场进行。大约60名受试者将被随机参与这项试验。
统计方法
这是第一阶段的研究，主要目的是评估化合物A的安全性和耐受性。化合物A的药代动力学和药效学将作为次要和探索性终点评估。选择每个剂量队列的建议大小以提供足够的信息，从而允许评估化合物A的安全性和耐受性，并在进行更高剂量的施用之前识别任何潜在的安全性信号或剂量限制性毒性。安全性和耐受性将通过总结治疗期间出现的不良事件(TEAE)、严重不良事件、临床实验室检测结果、生命体征测量和心电图(ECG)发现来评估。不会进行正式的统计试验来评估化合物A的安全性或耐受性。
所有的PK样品将使用经过验证的、灵敏的特定方法通过LC-MS/MS分析。血浆浓度与时间点和治疗组的描述性统计学将包括观测次数、算术平均值、标准差、算术变异系数(％CV)、几何平均值、中值、几何％CV、最小值和最大值。使用非房室方法，血浆浓度相对于时间的数据将用于推导以下PK参数：Cmax、Cmax/剂量、Tmax、AUC0-t、AUC0-t/剂量、AUC0-∞、AUC0-∞/剂量、λz、终末t1/2、CL/F和Vz/F。PK参数与治疗组的描述性统计学将包括观测次数、算术平均值、标准差、算术变异系数(％CV)、几何平均值、中值、几何％CV、最小值和最大值。将探索剂量比例性。
化合物A的药效学(PD)将通过测试几个探索性终点来评估，包括PIIANP、CTX-II、通过WOMAC评估的疼痛和身体机能以及MR成像数据。将这些终点的治疗前值与治疗后测量值进行比较，并总结相对于基线的绝对和百分比变化。PD终点与时间点和治疗组的描述性统计学将包括观测次数、算术平均值、标准差、算术变异系数(％CV)、中值、最小值和最大值。还可以对PK/PD终点进行探索性分析。
治疗研究
本研究中，试验药品为化合物A或匹配的安慰剂。化合物A或安慰剂将按以下剂量水平施用给单剂量队列：
·每次IA注射50μg
·每次IA注射100μg
·每次IA注射200μg
·每次IA注射400μg
化合物A或安慰剂将按以下剂量水平施用给多剂量队列，每周一次持续四周：
·每次IA注射100μg
·每次IA注射200μg
·每次IA注射400μg
化合物A将以无菌溶液的形式提供在琥珀色玻璃小瓶中，浓度为200μg/mL。匹配的安慰剂将提供在相同的小瓶中。每个小瓶将含有5mL化合物A或安慰剂。这些小瓶将被包装在盒子里以运往研究现场。
试验药品(IP)标签将包括方案编号、内容、批号、储存条件和试验使用警告声明。
施用
将在现场根据标准护理程序，通过超声引导的关节内注射来施用化合物A或安慰剂。化合物A或安慰剂应当由主研究员或另一以接受的技术训练过的合格医师施用，以将药剂递送至膝关节。施用化合物A或安慰剂期间必须使用严格的无菌注射技术。医师应该使用他或她的专业判断来为个体受试者选择最佳方法和注射部位。
在注射试验药品之前，应将多余的流体从膝盖处吸出。必须使用超声来引导该程序。医生应保存记录针放置的超声图像，直到本研究的结尾访视。每个注射剂将由5mL化合物A或安慰剂组成。应当建议受试者在接受化合物A或安慰剂后避免剧烈的活动，并按照在现场使用的标准注射后护理说明书来控制疼痛。以局部疼痛为特征的注射后潮红可在膝关节内注射后数小时内发生。它通常会在48小时内消退。任何注射后潮红的情况都应报告为不良事件。
实施例9：膝骨关节炎患者中化合物A的关节内注射
化合物A或其药学上可接受的盐或溶剂化物通过关节内注射施用到诊断为骨关节炎的患者的膝盖，以促进软骨修复。患者接受一次化合物A或其药学上可接受的盐或溶剂化物的注射，或多次注射，并可以接受一次治疗或接受定期治疗(每三个月一次、每六个月一次、每九个月一次或每年一次)。作为另一非限制性实例，每周给药，持续不超过五周。
实施例10：化合物A剂量频率对大鼠半月板撕裂模型的影响
试剂和仪器
化合物A所用的媒介物为3％PEG 3350、0.5％Tween80、pH 7.8下30mM的磷酸钠缓冲液。单独制备媒介物，然后添加到化合物A粉末的等分中，然后涡旋混合物直至其变成澄清溶液。制备剂量为3.5和0.35μg/kg(分别为100μM和10μM)的给药溶液。给药体积设置为30μL/膝。每周新鲜制备给药溶液。
动物模型
研究开始时，14周大的雄性Lewis大鼠(Charles River,Kingston,NY)体重在300-320克范围内。
维持条件
动物成对安置在一次性微型隔离器(Innovive,Innocage IVC鼠笼)中，可随意获得食物(标准啮齿动物食物,Picolab rodent,Newco)和水。允许它们在研究登记前在12h：12h光照周期(6am至6pm)、温度范围为70-72℉以及湿度范围为40％-69％的安置室中适应设施一周。
手术
大鼠按体重分为8个研究组，每组15只。它们在一周内以交错的方式接受手术并登记(每天20只动物，持续6天)。简单来说，将动物通过腹膜内注射***/赛拉嗪混合物(分别为50mg/kg Ketaved-Henry Schein和5mg/kg Xyalzine-AniSed)来麻醉，施用适当的镇痛剂(氟尼辛，5mg/kg皮下注射)，并将手术部位刮剃毛并消毒。在右后膝内侧作小切口，以暴露出副韧带。横切副韧带，并充分打开关节囊以暴露内侧半月板。将半月板完全横切，然后闭合皮肤切口，并向伤口施加压力以防止血肿发展。允许动物在加热的毯子上恢复，并返回其家笼。假程序以类似的方式进行，除了未切割内侧半月板。所有的手术程序都是无菌进行的，所有程序都由机构IACUC批准。在接下来的一周中，每天都对动物进行监测，以便在给药前进行术后护理。任何具有非典型愈合(瘀伤/血肿)的动物都被从研究中移除，并替换为备用动物。
动物被登记到以下组：
治疗组
A.媒介物，每周给药一次
B.化合物A 3.5μg/kg；1.05μg/膝(100μM)，每周给药一次
C.化合物A 3.5μg/kg；1.05μg/膝(100μM)，每两周给药一次
D.化合物A 3.5μg/kg；1.05μg/膝(100μM)，给药一次
E.化合物A 0.35μg/kg；0.105μg/膝(10μM)，每周给药一次
F.化合物A 0.35μg/kg；0.105μg/膝(10μM)，每两周给药一次
G.化合物A 0.35μg/kg；0.105μg/膝(00μM)，给药一次
H.假手术
组
第0天
第7天
第14天
第21天
第28天
A
手术
给药
给药
给药
处死
B
手术
给药
给药
给药
处死
C
手术
给药
给药
处死
D
手术
给药
处死
E
手术
给药
给药
给药
处死
F
手术
给药
给药
处死
G
手术
给药
处死
H
手术
给药
给药
给药
处死
动物在每周给药时(8-10am)称重，并根据上述方案通过注射到关节内间隙中来施用30μl标准剂量的媒介物或化合物(A、B、E和H组每周给药一次，C和F组每两周给药一次，D和G组在研究期间内给药一次)。使用附有27G针的Hamilton注射器向动物给药。在研究的第28天，对动物实施安乐死，收集最终的血样，收获膝盖并将其放入***广口瓶中用于组织学分析和病理学评分。
数据分析和统计方法
用Bolder BioPATH进行膝关节组织学分析。进行多种表征病变的测量，以根据病变深度、严重性和总体大小对关节进行评分。
结果
在整个研究中，动物在任何给药时间表(每周一次，每两周一次，每次研究一次)或所测试的任何给药浓度(100μM或10μM)下均未显示对化合物A治疗的不良反应。组织学分析揭示，当每周一次或每两周一次施予时，10μM(0.35μg/kg；0.105μg/膝)化合物A的治疗与实质性软骨变性宽度的改善有关(图1：向Lewis大鼠施用剂量为100μM(3.5μg/kg；1.05μg/膝)或10μM(0.35μg/kg；0.105μg/膝)的化合物A，每周一次、每两周一次或整个研究期间一次。在研究结束时，收获并固定膝盖用于切片。测量软骨病变的宽度和深度并进行评分。上面绘制了其中大于50％的软骨受损或缺失的病变宽度。n＝10–15只动物/组，相对于媒介物的学生t检验
本研究的目的是在骨关节炎大鼠模型的背景下探索化合物A的不同给药频率。在啮齿动物的膝盖内进行关节内注射是具有挑战性和侵入性的，因为在如此小的关节内注射时大小和体积受到限制。在某些情况下，注射过程本身，如果进行得太频繁，可能会导致注射部位的炎症增加，或注射器针尖对股骨/胫骨表面造成潜在的医源性受损。这可能会导致关节肿胀，并潜在地导致负重减少和完全不愿使用该膝盖。与诱导关节疾病的化学方法如单碘乙酸酯模型不同，骨关节炎的这种手术模型依赖于动物使用患病关节以发生软骨受损和形成退行性病变。因此，必须在递送最佳量的化合物与避免关节本身的过度操作之间找到平衡，该过度操作可能影响结果的解释。本研究中，化合物A以两种浓度每周一次、每两周一次和在四周的研究期间一次向动物给药。当化合物A以每两周一次用所选的两种剂量中的较低者给药时，可以看到最佳疗效。这表明，在这个模型中，每周给药可能对关节操作太多。相比之下，在这个模型中，每四周一次给药并没有显示出对软骨变性进展的影响。每两周一次给药显示出其中超过10％软骨受损或丢失的软骨病变的宽度显著减小。此外，化合物A的作用主要表现在对其中超过50％软骨丢失的最严重软骨缺损的改善方面。这是令人鼓舞的，因为这些病变的区域缺乏软骨细胞密度(低于正常细胞密度的50％)，其中化合物A可能有助于促进软骨细胞增殖或防止软骨细胞损失。在这个手术诱导骨关节炎的啮齿动物模型中，化合物A在每两周一次关节内给药时效果最好。
实施例11：大鼠半月板撕裂模型中化合物A剂量范围的研究
试剂和仪器
化合物A的媒介物为3％PEG 3350、0.5％Tween80、pH 7.8下30mM的磷酸钠缓冲液。单独制备媒介物，然后添加到化合物A粉末的等分中，之后混合物被涡旋并变成澄清溶液。制备剂量范围为30μM至0.3μM的给药溶液。给药体积设置为30μL/膝。每个剂量新鲜制备给药溶液。给药溶液在研究结束时验证。按照制造商的说明书，将阳性对照化合物FGF-18原液在pH 8.0的5mM Tris中重构。将FGF-18原液进一步在盐水中稀释至最终浓度为0.167mg/mL。在注射时每周两次配制新鲜稀释液。
动物模型
14周大的雄性Lewis大鼠(Charles River,Kingston,NY)体重在285-327克范围内。
维持条件
动物成对安置在一次性微型隔离器(Innovive,Innocage IVC鼠笼)中，可随意获得食物(标准啮齿动物食物,Picolab rodent,Newco)和水。允许它们在研究登记前在12h：12h光照周期(6am至6pm)、温度范围为70-72°F以及湿度范围为40％-69％的安置室中适应设施一周。
手术
大鼠按体重分为8个研究组，每组15只。它们在一周内以交错的方式接受手术并登记(每天登记20只动物，持续6天)。将动物通过腹膜内注射***/赛拉嗪混合物(分别为50mg/kg Ketaved-Henry Schein和5mg/kg Xyalzine–AniSed)来麻醉，施用适当的镇痛剂(氟尼辛，5mg/kg皮下注射)，并将手术部位剃毛并消毒。在右后膝内侧作小切口，以暴露出副韧带。横切副韧带，并充分打开关节囊以暴露内侧半月板。将半月板完全横切，然后闭合皮肤切口，并向伤口施加压力以防止血肿发展。允许动物在加热的毯子上恢复，并返回其家笼。假程序以类似的方式进行，除了未切割内侧半月板。所有的手术程序都是无菌进行的，所有程序都由IACUC批准。在接下来的一周中，每天都对动物进行监测，以便在给药前进行术后护理。任何具有非典型愈合(瘀伤/血肿)的动物都被从研究中移除，并替换为备用动物。动物被登记到以下组：
治疗组
A.媒介物，每两周给药一次
B.化合物A 1.05μg/kg；0.315μg/膝(30μM)，每两周给药一次
C.化合物A 0.35μg/kg；0.105μg/膝(10μM)，每两周给药一次
D.化合物A 1.05μg/kg；0.0315μg/膝(3μM)，每两周给药一次
E.化合物A 0.035μg/kg；0.0105μg/膝(1μM)，每两周给药一次
F.化合物A 0.0105μg/kg；0.00315μg/膝(0.3μM)，每两周给药一次
G.FGF-18(5μg/注射)，每周给药两次
H.假手术
组
第0天
第7天
第14天
第21天
第28天
A
手术
给药
给药
处死
B
手术
给药
给药
处死
C
手术
给药
给药
处死
D
手术
给药
给药
处死
E
手术
给药
给药
处死
F
手术
给药
给药
处死
G
手术
给药两次/周
给药两次/周
给药两次/周
处死
H
手术
给药
给药
处死
动物在每周给药时(9am-12pm)称重，并根据上述方案通过注射到关节内间隙中来施用30μl标准剂量的媒介物或化合物。A-F组和H组每两周给药一次，G组在整个研究期间每周给药两次。使用附有27G针的Hamilton注射器向动物给药。在研究的第28天，对动物实施安乐死，收集最终的血样，收获膝盖并将其放入***广口瓶中用于组织学分析和病理学评分。
数据分析和统计方法
用Bolder BioPATH进行膝关节组织学分析。进行多种测量，以根据病变深度、严重性和总体大小对关节进行评分。
结果
在整个研究中，动物在任何剂量测试(30、10、3、1、0.3μM)下均未显示对化合物A治疗的不良反应。与媒介物处理的动物相比，以30μM(0.315μg/膝)的剂量用化合物A治疗显著提高了没有股骨的总关节评分。(图3：向Lewis大鼠施用剂量在30μM(1.05μg/kg；0.315μg/膝)至0.3μM(0.105μg/kg；0.0315μg/膝)范围内的化合物A，在整个研究期间每两周一次。在研究结束时，对动物实施安乐死并收获和固定膝盖用于组织学。关节评分反映胫骨变性评分(基于软骨病变的测量)和骨赘评分的总和。相对于媒介物的Kruskal-Wallis检验(Dunn事后检验)*p<0.05。相对于媒介物的学生t检验
本研究的目的是确定化合物A在骨关节炎大鼠模型中的有效剂量。通过关节内注射每两周一次向动物给予剂量在30μM(0.315μg/膝)至0.3μM(0.00315μg/膝)范围内的化合物A。显示了在30μM(0.315μg/膝)剂量下的疗效，其中除股骨外的关节总评分明显提高。本研究的结果表明，在OA的啮齿动物模型中每两周一次施用时，30μM(0.315μg/膝)剂量的化合物A显示出显著的疗效。
实施例12：化合物A在犬骨关节炎模型中的疗效
含有化合物A粉末的小瓶在5％PEG 300中溶解，并涡旋以形成澄清溶液。向该溶液中添加95％的盐水至最终给药浓度(0.0696mg/mL–200μM)。在关节内给药之前，用0.45μm过滤器过滤该澄清溶液。在给药当天新鲜配制备给药溶液。
生物分析方法
乙腈、水(Optima,LC/MS级)和99+％甲酸(Optima,LC/MS级)购自FisherScientific。对照雌性Sprague-Dawley大鼠血浆(肝素钠，0.2u过滤)购自BioreclamationIVT。色谱HPLC柱Luna，5um C18(2)，50x2.0 mm及其防护安全盒和支架购自Phenomenex。HPLC(1100系列)购自Agilent。质谱仪系统API 3000购自SCIEX。
在反相C18柱上进行分离，使用0.1％甲酸水溶液(A)和0.1％甲酸乙腈溶液(B)的流动相以0.6mL/min的流速进行梯度洗脱。使用负离子模式(ESI-)的电喷雾对化合物A和内标Kartogenin实现电离。多重反应监测(MRM)用于药物定量，前体到产物离子跃迁是347.0＞268.9(m/z)。内标Kartogenin的MRM为316.0>272.0(m/z)。
化合物A在大鼠血浆中的标准曲线的编制：通过在大鼠对照血浆中掺入化合物A水平，编制化合物A在大鼠血浆中的标准曲线。在大鼠血浆中产生的校准标准曲线范围为1.53至781.3ng/mL。标准品和样品都通过蛋白质沉淀(使用内标Kartogenin或KGN，250ng/mL，在冷的乙腈中)和离心来制备。用0.1％甲酸在水溶剂中的溶液稀释上清液，并将其注射到LC-MS-MS系统上。
动物模型
十二至十五月大的雌性幼稚比格犬获自Marshall BioResouces(North Rose,NY)，其具有5.4至9.3千克范围内的体重。
维持条件
研究开始前所有犬适应设施31天。在研究登记之前对动物的一般健康状况和体重进行预筛选。所有动物在登记时都是健康的。将动物安置在围栏中，每个围栏5只动物，采用12小时光照/12小时黑暗的光照周期(6am/6pm)。使房间通风，以至少60％新鲜空气每小时换气大于10次。室温按照ASI规定的SOP保持。犬可随意获得食物(ProLab:Animal Diet5006)和水(氯消毒的市政自来水)。喂养日程表唯一的例外是在麻醉前的禁食时段。
手术
在进行手术干预之前，对雌性比格犬进行几天的观察，以确定它们的行为倾向(高活力、嗜睡等)。目标是分选出行为特征并确保该行为特征在所有组之间共享，使得活动水平和关节的使用在不处于方案化运动中时在各组之间是一致的。除按习性分选外，动物们还按体重分选，各研究组之间的体重分布情况相同。在研究开始前，动物已经适应了1小时的行走/奔跑/玩耍的运动方案。
动物被登记到以下3组:
组
数目
手术
治疗
1
10
假手术
媒介物(5％PEG 300/95％盐水)
2
10
内侧半月板撕裂
媒介物(5％PEG 300/95％盐水)
3
10
内侧半月板撕裂
化合物A(200μM；0.035mg/膝)
在手术前使动物禁食，用异丙酚(6mg/kg，IV)麻醉，并在程序期间中(10-15分钟)使用含异氟烷(3-4％)的氧气(2L/min)维持麻醉。将右后膝剃毛并做无菌准备。切开内侧皮肤以暴露副韧带。切割内侧半月板的一部分(去除约为内侧半月板一半宽度的楔形部分)。用缝合线闭合关节囊和皮下组织，并用伤口夹闭合皮肤。假手术动物除内侧半月板部分切除外，其余均按相同方法处理。允许所有动物在给药前恢复10-11天。手术后三天，所有动物开始一小时连续运动(行走/奔跑/玩耍)的运动方案，以确保动物使用经手术的腿，并允许病变在一组不同习性的犬中更一致地发展。
在研究期间，所有动物每周运动5天，每次1小时。在研究第10/11天，动物开始每周接受向手术关节中的化合物或媒介物注射。还在给药前对所有动物采集血液样品用于化合物测定。动物在术后第10、17、24、31、38和45天接受给药。所有关节内剂量均被标准化为通过髌韧带注射至关节囊内的0.5mL注射剂。在动物子集中，进行最终剂量PK研究，其中向动物给药，并在给药后0.5、1、2、4、8、12和24小时收集血液样品。汇总数据见表11。
表11-以关节内注射0.035mg/膝的化合物A治疗的动物的最终剂量PK
雌性比格犬经受内侧半月板撕裂手术来诱导骨关节炎。每周一次，通过关节内注射，用媒介物或化合物A以0.035mg/膝(200μM)的剂量治疗动物。研究持续6周，在第6次剂量后，接受化合物A的动物经受最后一天的采样，以进行PK表征。以上呈现的数据为IA剂量后血浆暴露的汇总数据。(a)AUC0-2＝从给药开始(0)至最后可定量时间点(τ)的血浆浓度-时间曲线下的面积(AUC)，该最后可定量时间点为2小时。以μg/动物表示。
在第52天，动物接受最终血液采样并被实施安乐死。血浆样品用于生物标志物的测定。在尸体剖检时收集尿液和滑液，并且收获膝盖用于组织学和病理学分析。
数据分析和统计方法
在HistoTox Labs,Inc.进行组织学处理和切片，并在Bolder Biopath读取载玻片。基于病变大小、深度、严重性和软骨下骨和骨赘形成的变化对骨关节炎病变进行评分。检查半月板切口任一侧的股骨和胫骨。统计分析使用学生双尾t检验或Mann-Whitney U检验(非参数)。
对于最终血浆样品，运行生物标志物ELISA以定量PIINP的水平。试剂盒程序按照制造商的说明进行。用学生t检验分析数据。
结果
组织学评分在总体形态学尺度上进行，或通过检查股骨或胫骨的前/后深度方面(水平1-3)或检查胫骨平台或股骨髁的外/内部方面(区域1-4)来进行。该分析的示意图示于图4，其中代表性的媒介物处理的膝盖在收获后在印度墨水中染色并照相以显示犬中存在的病变。检查胫骨病变并指定软骨变性评分(基于严重性)并测量各区域和水平的软骨病变深度(表示为受损软骨的深度与软骨层总深度的比率)(图4中所示)。使用来自几个水平的汇集数据以类似方式对股骨病变评分(图5：雌性比格犬经受假手术或内侧半月板撕裂手术以诱导骨关节炎。在每周一次给予媒介物或化合物A持续6周后，对动物实施安乐死，并收获膝盖用于组织学。测量股骨和胫骨病变并对其评分，其中实质性股骨变性定义为病变内显示大于50％软骨损失或受损的区域。绘制了病变的总宽度，并且还绘制了显示实质性软骨变性的病变的宽度。n＝9-10只比格犬/组。与媒介物相比，*p＜0.05，图6：雌性比格犬经受假手术或内侧半月板撕裂手术以诱导骨关节炎。在每周给予媒介物或化合物A持续6周后，对动物实施安乐死，并收获膝盖用于组织学。使用目镜测微器测量股骨病变。计算软骨病变的深度与总软骨层的深度的比率，并如上所述对区域1-4进行绘图。化合物A对降低区域1、3和4中的股骨中软骨病变的深度比具有显著作用。n＝9–10只比格犬/组。与媒介物相比，*p<0.05)。化合物A显著改善了股骨中实质性软骨变性的程度，但对总软骨变性(所有严重性)的宽度没有显示影响。这表明化合物A影响股骨软骨病变的严重性，然而不缩小总软骨大小。对股骨病变深度的更详细检查显示，化合物A治疗与许多区域上的病变深度的减少有关(图6)。在骨关节炎的进展中，骨赘的发展通常被视为用于稳定存在病变的关节的补偿性影响。骨赘是胫骨平台的外侧边缘上的骨向外生长。然而，用化合物A治疗的动物中的骨硬化水平降低(图7：在7周的研究中，雌性比格犬经受假手术或内侧半月板撕裂手术以诱导骨关节炎。在每周一次给予媒介物或化合物A持续6周后，对动物实施安乐死，并收获膝盖用于组织学。软骨下骨的硬化按以下量表评分，0等于无硬化、1(股骨/胫骨宽度的10％具有小梁增厚)、2(11-30％的宽度受影响)、3(31-60％的宽度受影响)，4(61-90％的宽度受影响)和5(>90％的宽度受影响)。n＝9–10只比格犬/组。与媒介物相比，*p<0.05ANOVA)。软骨下骨的重塑(硬化)也被视为已确立的或严重的骨关节炎的事件特征。在最终剂量后检查血浆暴露，并且在IA施用1小时后未检出化合物A(表1)。最终血浆样品用于生物标志物的测定。在一组测试的生物标志物中，PIINP，一种新合成的2型胶原的标志物(源自来自2型胶原N端序列的前肽)，在用化合物A治疗的犬中显著升高(图8：在7周的研究中，雌性比格犬经受假手术或半月板撕裂手术来诱导骨关节炎。在每周一次给予媒介物或化合物A持续6周后，对动物实施安乐死并收集最终血液样品(最终样品是在最终给药后1周)。进行ELISA来检测血浆中PIINP的循环水平。n＝9-10只比格犬/组。与媒介物相比，*p<0.05ANOVA)。
本研究的目的是评估化合物A在6周的犬骨关节炎模型中的疗效。化合物A是从MSC形成软骨细胞的驱动剂。雌性比格犬经受假手术或内侧半月板撕裂，并通过关节内注射每周接受媒介物或化合物A的剂量。所有动物都进行了大量的运动，以确保在犬之间有稳定而均匀的病变形成。对膝盖的组织学分析揭示，接受化合物A治疗的那些动物有所改善。在用化合物A治疗的动物中，股骨实质性软骨变性的程度显著降低。用化合物A治疗的动物也表现出不太严重的胫骨软骨受损，尽管这种作用在统计学上不显著。这些数据与胶原标志物PIINP的循环水平的升高相结合，表明化合物A影响软骨细胞形成和基质重塑/保存，导致骨关节炎后果的减轻。除了病变评分之外，继发于骨关节炎病变的外周效应如软骨下骨的变化，也显示出在化合物A治疗下的有益效果。骨赘(朝向胫骨平台的外侧边缘的骨突出)被认为是继发于关节炎病变而形成的补偿性关节稳定化向外生长。虽然骨赘可能有利于稳定关节，但其往往是OA患者疼痛的来源并限制了关节的活动范围。除了骨赘形成之外，软骨下骨的变化在临床上也很重要，因为两者都可以通过射线照相测量检测到。虽然晚期或重度OA有许多特征，但骨硬化是软骨下骨中的不可逆改变，使关节更加脆弱，骨完整性明显丧失。化合物A治疗改善骨硬化，这可能是由于这些经治疗动物的病变严重性的降低。本研究显示化合物A在犬OA手术模型中对骨关节炎的发展有显著的影响。与未治疗的动物相比，经治疗动物所显示的病变深度和严重性均有所下降，骨硬化也有所减少。这表明化合物A有望成为OA的潜在治疗手段。
实施例13：体外FLNA结合
细胞培养
原代人MSC获自Cell Applications。hMSC在间充质干细胞扩增培养基中生长，并在第2至第8代之间用于所有实验。
核细胞裂解物分级分离和蛋白质印迹
用指定浓度的化合物A处理hMSC 2小时，用冰冷的PBS洗涤一次，用细胞裂解缓冲液覆盖(20mM HEPES，pH 7.9，10mM NaCl，3mM MgCl2，0.1％NP-40，10％甘油，0.2mM EDTA，1mM DTT和蛋白酶抑制剂混合物)，并在冰上温育15min。将这些细胞机械地从培养皿上刮下，并轻轻地移液以破碎细胞碎片。将细胞裂解物在4℃下以2000rpm离心5min，并将上清液作为胞质级分保存。沉淀物用洗涤缓冲液(20mM HEPES，pH 7.9，20％甘油，0.2mM EDTA，1mMDTT和蛋白酶抑制剂混合物)洗涤一次并以2000rpm离心5min。弃去上清液，将沉淀物悬浮在核提取缓冲液(2mM HEPES，pH 7.9，400mM NaCl，20％甘油，0.2mM EDTA，1mM DTT和蛋白酶抑制剂混合物)中，然后在冰上温育约45min。混合物在4℃下以13000rpm离心15min，并将上清液作为核级分保存。
使用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质，并使用半干印迹池将其转移到PVDF膜上。于室温下将膜在封闭缓冲液(LiCor)中封闭1小时，然后在封闭缓冲液中于4℃下与第一抗体一起温育过夜。将膜用PBST(含0.1％triton X-100的磷酸盐缓冲盐水)冲洗3次，于室温下在封闭缓冲液中与荧光团偶联的第二抗体温育1小时，再用PBST冲洗至少3次，并用Li-CorOdyssey CLx成像系统来成像。
质粒构建与蛋白质表达
如前所述进行FLNA FC-1片段与亲和探针之间的体外结合，其中化合物A作为竞争剂，浓度为探针浓度(0.5μM)的50倍(25μM)。化合物A与生物素-叠氮化物亲和探针在体外竞争结合FLNA
通过合成生物素-kartogenin-叠氮化物(BKA)亲和探针，阐明了kartogenin(KGN)的生物学机制，该探针用作工具来鉴定随后与FLNA的相互作用。随后，验证了FLNA的FC-1片段可直接介导KGN的结合。为了确定化合物A是否保留此功能特性，将FLNA FC-1片段与BKA在不存在或存在化合物A的情况下温育。化合物A抑制了探针与FLNA的FC-1片段结合的能力(图9：在不存在或存在25μM化合物A的情况下，将FLNA FC-1片段(10μg/mL)与0.5μM生物素-KGN-叠氮化物(BKA)于室温下孵育1小时，光交联(UC 60nm)30min，并用抗生物素抗体通过蛋白质印迹分析)。
通过化合物A诱导CBFβ核定位
先前已证明KGN增加CBFβ的核定位。此外，发现该核定位是KGN在体外诱导软骨发生分化所必需的。CBFβ是关键的转录辅因子，其在与RUNX1结合时可以促进透明关节软骨的分化。为了确定化合物A是否保留该功能，将hMSC与1、10和100nM化合物A温育1小时，然后进行收集，细胞裂解，核分级分离和通过蛋白质印迹的分离。在所有测试浓度下用化合物A处理后，均观察到核级分中的CBFβ水平增加(图10：将人MSC与指定浓度的化合物A温育1小时，提取核级分，并使用抗CBFβ抗体通过蛋白质印迹进行分析；微管蛋白(在相同的核级分中)用作上样对照)。
关节软骨内的干细胞或祖细胞支持一般性维持，并且是损伤后组织修复的可能介体。化合物A是低分子量临床候选物，其促进软骨干/祖细胞向成熟的健康关节软骨细胞的分化，并且在直接注射到患病关节中时可能是有益的。该报告证实了化合物A与细丝蛋白AFC-1片段之间的相互作用以及软骨发生转录辅因子CBFβ的随后核定位。数据证实，化合物A所靶向的分子机制与母体分子kartogenin相同，从而促进软骨细胞分化。
实施例14：化合物A的体外软骨发生
测试系统和实验设计
将原代人MSC(40,000个)铺板到96孔圆底细胞培养板的每个孔中，短暂离心以使细胞聚集，并在无血清Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中用指定浓度(0.1nM至10uM之间)的化合物A处理7天。按照制造商的方案，使用RNeasy试剂盒提取RNA。使用SuperScript III第一链合成试剂盒合成cDNA，并使用来自ThermoFisher的Taqman基因表达测定法(探针)测定蛋白聚糖4(PRG4)、性别决定区Y-Box 9(SOX9)和软骨-寡聚基质蛋白(COMP)的转录物水平。
数据分析和统计方法
使用ViiA 7RUO软件(ThermoFisher)，以β-肌动蛋白作为归一化对照，应用ΔΔCT方法计算每个基因的相对丰度。每个样品的每个基因的丰度表示为相对于DMSO处理的对照的倍数。n＝3。使用GraphPad Prism 7软件分析每个标记基因的剂量响应。
结果
用剂量响应(0-10μM)的化合物A处理原代人MSC 7天，分离mRNA，逆转录和qPCR后，计算出相对于单独用DMSO处理的细胞的倍数增加。对于PRG4，在12-1000nM化合物A下记录到超过两倍的增加(EC50约3.9nM)，对于COMP，在12-1000nM下记录到三倍的增加(EC50约4.5nM)，而对于SOX9，在4-1000nM下记录到四倍的增加(EC50约2.2nM)(表12)。
表12：在用化合物A处理7天后与软骨相关的基因的诱导(增加倍数)
化合物A(nM)
PRG4
COMP
SOX9
0.457
1.082±0.493
1.005±0.100
1.022±0.231
1.37
0.582±0.513
0.776±0.107
1.002±0.260
4.11
1.795±0.561
1.322±0.804
3.296±0.719
12.3
2.226±0.378
2.942±0.575
2.505±0.242
37.0
1.204±0.360
1.356±0.590
1.768±0.264
111
1.024±0.700
0.706±0.193
1.977±0.721
333
2.22±0.960
1.896±0.187
4.193±0.765
1000
2.134±0.785
3.121±0.709
未完成
化合物A促进MSC向关节软骨细胞分化。使用定量RT-PCR，数据证明了化合物A三到四倍地诱导软骨细胞分化的主转录因子的能力，以及二到三倍地诱导两种软骨细胞外蛋白(PRG4和软骨寡聚基质蛋白)的能力。这些数据共同证实了化合物A诱导软骨细胞从祖细胞分化的能力。
实施例15：药代动力学研究
单剂量研究
实施例15a：大鼠的关节内单剂量药代动力学研究
在化合物A的单次IA剂量(30μl的100μM溶液[(二甲基亚砜/无菌盐水媒介物)或1.05μg/膝]后，测定大鼠(N＝2)的膝关节和血浆暴露。在紧接着给药后以及给药后30、60和120分钟收获注射的整个膝盖。还在相同时间点收集血浆样品。在紧接着IA注射后，膝盖中的化合物A浓度为925.5ng/ml，但在120分钟时降至LLQ以下。化合物A的血浆浓度为33.9(hr*ng/mL)的平均AUC(0-inf)，53.3ng/ml的平均Cmax和0.481小时的t1/2。
实施例15b：Crl:CD(SD)大鼠的关节内急性毒性研究
在Crl:CD(SD)雄性大鼠中单次IA剂量后测定化合物A的血浆毒代动力学特征。通过关节内注射(一个膝盖)以30μL的体积，0(媒介物：无菌水中1％乙醇、10％PEG 3350、0.5％Tween80)、70、200或400μg/mL的浓度将化合物A施予雄性大鼠(5只/组)一次。向每组另外3只雄性大鼠施予70或400μg/mL的化合物A用于毒代动力学评估。在可行的情况下，通过非房室药代动力学分析测定毒代动力学参数。表13总结了代表性的药代动力学参数。化合物A的全身血浆/血清暴露(平均Cmax和AUC0-t)以小于剂量比例性的方式增加。对于5.7倍的剂量增量(2.1至12μg)，平均Cmax和AUC0-t均增加2倍。在两种剂量下，血浆Tmax均发生在0.33小时。
表13：在以单次关节内剂量施用化合物A的雄性大鼠中代表性的平均化合物A毒代动力学参数
a.在适用的情况下，结果报告为平均值[范围]，但Tmax和Tlast报告为中值[范围]
b.AUC0-t＝从给药开始(0)到最后可量化时间点(t)的血浆浓度-时间曲线下的面积(AUC)，该时间为2小时，标记*表示t＝4小时
c.以μg/膝表示
实施例15c：Crl:CD(SD)大鼠的静脉内急性毒性研究
在Crl:CD(SD)大鼠中单次IV剂量后，测定化合物A的血浆TK。将化合物A通过IV缓慢注射(5分钟)，以0(媒介物)、1或2.4mg/kg(5只/性别/组)施予大鼠。对于1或2.4mg/kg剂量组增加另外3只大鼠/性别/组，用于毒代动力学评估。在可行的情况下，通过非房室分析测定毒代动力学参数。表14总结了代表性的血浆药代动力学参数。将化合物A以1和2.4mg/kg单次缓慢IV施用(5min/大鼠)后，在雄性和雌性大鼠中，Tmax均发生于0.08小时，与第一次抽样相一致。在被施予2.4mg/kg的动物中，平均Cmax(雄性9430ng/mL；雌性9020ng/mL)与接受1mg/kg的动物的Cmax(雄性11200ng/mL；雌性9190ng/mL)相当，然而平均AUC0-t比接受1mg/kg的相应AUC0-t在雄性中高约1.8倍，在雌性中高约2.0倍。单次IV施用化合物A后，T1/2为大约0.3至0.6小时。总的来说，在两种给药方案中未观察到化合物A全身暴露(Cmax和AUC0-t)的显著性别差异。
表14：在以单次静脉内剂量施用化合物A的大鼠中代表性的化合物A平均毒代动力学参数
a.在适用的情况下，结果报告为平均值[范围]，但Tmax和Tlast报告为中值[范围]
b.AUC0-t＝从给药开始(0)到最后可量化时间点(t)的血浆浓度-时间曲线下的面积(AUC)，该时间点为2小时，标记*表示t＝4小时
实施例15d：比格犬的关节内急性毒性研究
在雄性比格犬中单次IA剂量后测定化合物A的血浆和滑液毒代动力学特征。将化合物A施予犬一次(2只雄性/组)；每只动物接受两次体积恒定为500μL的注射，一次在右膝中以0的浓度(媒介物)注射，一次在对侧膝(左膝)中以70、200或400μg/mL的浓度(相当于总计30、100和200μg/犬膝)注射。通过非房室药代动力学分析测定毒代动力学参数。表15总结了代表性的药代动力学参数。在研究结束时，滑液样品中化合物A的浓度都低于LLQ(0.5ng/ml)。化合物A的全身血浆暴露(平均Cmax和AUC0-t)以小于剂量比例性的方式增加。对于2.9倍的剂量增量(35至100μg，分别对应于70和200μg/mL)，平均Cmax和AUC0-t均增加0.7倍；对于5.7倍的剂量增量(35至200μg，分别对应于70和400μg/mL)，平均Cmax和AUC0-t均增加约1.5倍。在化合物A的剂量为35、100和200μg时，血浆Tmax为0.08至1小时。
表15：比格犬的单次关节内剂量后血浆中的平均毒代动力学参数的总结
a.AUC0-t＝从给药开始(0)至最后可定量时间点(t)的血浆浓度-时间曲线下的面积(AUC)，该时间点为4小时。
b.以μg/膝表示。
多剂量研究
实施例15e：具有14天恢复期的CD大鼠的五周关节内重复毒性研究
在Crl:CD(SD)大鼠的多剂量IA毒性研究中确定化合物A的血浆毒代动力学特征。将化合物A以标称浓度0(媒介物)、70、140和200μg/mL/周，以30μL的固定体积施予大鼠(13只/性别/组)，每周一次持续5周，该剂量相当于7、14和20μg/kg/周(0、2.1、4.2或6μg/膝)。每个剂量的注射部位均是右股胫关节。评估三只大鼠/性别/组的毒代动力学。通过非房室药代动力学分析进行毒代动力学分析。所有计算都采用标称采样时间。表16总结了代表性的药代动力学参数。分析从媒介物对照动物收集的血浆样品，该样品在第1天和第29天在给药开始后1小时采样。所有样品中，化合物A的浓度均低于0.25ng/mL的LLQ。在将化合物A每周一次单次(第1天)和重复(第29天)IA施用给雄性和雌性大鼠后，从开始给药直至至少2小时，化合物A在所有动物的血浆中是可定量的。在评估的所有剂量水平下，雄性和雌性大鼠在给药后0.33小时通常会出现作为中值的Tmax，除了7μg/kg/周的雌性大鼠在第29天的Tmax为1小时。在每周一次单次(第1天)和重复(第29天)IA施用后，在雄性和雌性大鼠中，化合物A的血浆全身暴露(平均Cmax和平均AUC0-t)随剂量增加而成比例增加。在第1天，对于2.9倍(7至20μg/kg/周)的剂量增量，平均Cmax增加约4.1(雄性)和3.1倍(雌性)；平均AUC0-t增加4.4(雄性)和3.2(雌性)倍，而在第29天，平均Cmax增加约2.7(雄性)和3.2倍(雌性)，平均AUC0-t增加2.7(雄性)和2.1(雌性)倍。在两种性别中评估的整个剂量范围内，在单次和重复IA施用后，总体上没有观察到化合物A全身暴露的显著(其中显著被认为＞2倍)差异。
表16：在以五个每周关节内剂量施用化合物A的大鼠中代表性的平均化合物A血浆毒代动力学参数
a.在适用的情况下，结果报告为平均值[范围]，但Tmax报告为中值[范围]
b.标称剂量水平是根据母试验项的总每周一次剂量给出的。以大鼠平均体重(300g)且每只大鼠施用30μL为基础计算剂量
c.AUC0-t＝从给药开始(0)至最后可定量时间点(t)的血浆浓度-时间曲线下的面积(AUC)。
d.由于最小值和最大值相同，因此不报告范围
实施例15f：具有14天恢复期的CD大鼠的五周静脉内重复毒性研究
在Crl:CD(SD)大鼠的多剂量IV毒性研究中确定化合物A的血浆毒代动力学特征。将化合物A以0、0.25、0.75或2.5mg/kg通过静脉内注射(缓慢推注)以10mL/kg的剂量体积施予大鼠(10只/性别/组)，每周一次持续5周。将化合物A以0(媒介物)、0.25、0.75或2.5mg/kg/周施予另外的动物(3只/性别/组)用于毒代动力学评估。通过非房室药代动力学分析进行毒代动力学分析。所有计算都采用标称采样时间。表17总结了代表性的药代动力学参数。分析从媒介物对照动物收集的血浆样品，该样品在第1天和第29天在给药开始后0.33小时(＝20分钟)采样。所有样品中，化合物A的浓度均低于0.25ng/mL的LLQ。在将化合物A每周一次单次(第1天)和重复(第29天)IV施用给雄性和雌性大鼠后，从开始给药直至至少4小时，化合物A在所有动物的血浆中是可定量的。在评估的所有剂量下，Tmax发生在从输注开始起的0.08小时，对应于在雄性和雌性大鼠中抽取的第一个样品。在计算时，化合物A的t1/2在评估的所有剂量下在两种性别中均为约0.36至0.84小时。在每周一次单次(第1天)和重复(第29天)IV施用后，化合物A的血浆全身暴露(根据平均Cmax和平均AUC0-t)通常增加，且在两种性别中直至0.75mg/kg/周，与比例性没有重大偏差，除了在第29天，在雄性大鼠中观察到超过比例性的Cmax。总体来说，对于10倍的剂量增量(0.25至2.5mg/kg/周)，化合物A的血浆暴露在第1天以低于比例性的方式增加。而在第29天，雄性和雌性大鼠的平均Cmax和平均AUC0-t通常都随着剂量的增加而成比例地增加。在两种性别中评估的整个剂量范围内单次和重复IV施用后，总体上没有观察到化合物A全身暴露的显著(其中显著被认为＞2倍)差异。总之，在剂量范围内，在第1天或第29天未观察到化合物A的平均Cmax和平均AUC0-t的显著性别差异。
表17：在以五个每周静脉内剂量施用化合物A的大鼠中代表性的平均血浆化合物A毒代动力学参数
a.在适用的情况下，结果报告为平均值[范围]，但Tmax报告为中值[范围]
b.标称剂量水平是根据游离碱的总每周一次剂量给出的
c.AUC0-t＝从给药开始(0)至最后可定量时间点(t)的血浆浓度-时间曲线下的面积(AUC)
d.由于最小值和最大值相同，因此不报告范围。
实施例15g：具有14天恢复期的比格犬的五周关节内重复毒性研究
在比格犬的多剂量IA毒性研究中确定化合物A的血浆和滑液毒代动力学特征。将化合物A以标称浓度0、70、140和200μg/mL/周，以500μL的固定体积施予犬(右膝；3只/性别/组)，每周一次持续5周(因此施予的标称剂量为0、35、70和100μg/kg/周/膝)。通过非房室分析进行毒代动力学分析。所有计算都采用标称采样时间。表18总结了代表性的血浆药代动力学参数。仅在化合物A的预期Tmax(1小时)时分析在第1天和第29天在与化合物A治疗的动物相同的时间点从媒介物对照动物采样的血浆样品。在所有分析的样品中，测试项的浓度低于0.25ng/mL的定量下限。在将化合物A以3.5、7.0和10μg/kg/周IA施用后，直至给药后至少3小时，化合物A在所有动物的血浆中是可定量的(LLQ＝0.25ng/ml)。在雄性和雌性犬中，第1天和第29天的Tmax通常为0.33-1小时。在第1天和第29天的化合物A全身暴露(平均Cmax和AUC0-t)大致随剂量成比例地增加。在整个剂量范围内单次和重复IA施用后，没有观察到化合物A的全身暴露的显著差异(其中显著被认为＞2倍)。总之，在剂量范围内，在第1天和第29天未观察到化合物A的全身暴露(Cmax和AUC0-t)的显著性别差异。在研究结束时收集的所有滑液样品中，测试项的浓度低于LLQ(20ng/mL)。
表18：在以五个每周关节内剂量施用化合物A的犬中代表性的平均血浆化合物A毒代动力学参数
a.在适用的情况下，结果报告为平均值[范围]，但Tmax报告为中值[范围]
b.标称剂量水平以总每周剂量的形式给出.
c.AUC0-t＝从给药开始(0)到最后可量化时间点(t)的血浆浓度-时间曲线下的面积(AUC)，该时间点为6小时，标记#表示Tlast＝3小时
实施例15h：具有14天恢复期的比格犬的五周静脉内重复毒性研究
在比格犬的重复剂量IV毒性研究中测定化合物A的血浆毒代动力学特征。将化合物A以0、0.125、0.600和1.250mg/kg/周通过IV施用以5mL/kg的剂量体积和5mL/min的注射速率施予犬(3只/性别/组)。通过非房室药代动力学分析进行毒代动力学分析。所有计算都采用标称采样时间。表19和表20总结了代表性的药代动力学参数。在来自施予媒介物的动物的所有分析的样品中，测试项的浓度低于LLQ(0.25ng/mL)。在将化合物A以0.125、0.600和1.250mg/kg/周对雄性和雌性犬单次IV施用后，直至给药后至少4小时，化合物A在所有动物的血浆中是可定量的，而当以1.250mg/kg给药时，直至给药后至少12小时，化合物A在所有动物的血浆中是可定量的(LLQ＝0.25ng/ml)。在化合物A以0.125、0.600和1.250mg/kg/周IV施用后，第1天和第29天的Tmax通常发生在0.17小时(10分钟)，这对应于给药后在雄性和雌性犬中抽取的第一个样品。在第一天和在化合物A每周一次施用达五周(第29天)后，化合物A在稳态(Vss)下的半衰期(t1/2)、血浆清除率(Cl)和分布容积是相似的。在雄性和雌性犬中，在第1天和第29天的平均表观半衰期在0.64至0.93小时的范围内。雄性犬的平均血浆清除率(Cl)在435mL/h/kg至686mL/h/kg的范围内，而雌性犬的平均血浆清除率在492至986mL/h/kg的范围内。雄性犬的平均分布容积在440至692mL/kg的范围内，而雌性犬的平均分布容积在534至855mL/kg的范围内。在第1天和第29天的化合物A全身暴露(平均Cmax和AUC0-t)以剂量比例性的方式增加。总之，在整个剂量范围内单次和每周重复IV施用后，没有观察到化合物A的全身暴露的显著差异(其中显著被认为＞2倍)。总之，在剂量范围内，在第1天或第29天，没有观察到化合物A全身暴露(Cmax和AUC0-t)的显著性别差异。
表19：在以五个每周静脉内剂量施用化合物A的雄性犬中代表性的平均血浆化合物A毒代动力学参数
a.在适用的情况下，结果报告为平均值[范围]，但Tmax报告为中值[范围]
b.剂量水平表示为游离碱的总每周剂量
c.AUC0-t＝从给药开始(0)到最后可量化时间点(t)的血浆浓度-时间曲线下的面积(AUC)，该时间点为12小时，标记#表示Tlast＝8小时或4小时
表20：在以五个每周静脉内剂量施用化合物A的雌性犬中代表性的平均血浆化合物A毒代动力学参数
a.在适用的情况下，结果报告为平均值[范围]，但Tmax报告为中值[范围]
b.剂量水平表示为游离碱的总每周剂量
c.AUC0-t＝从给药开始(0)到最后可量化时间点(t)的血浆浓度-时间曲线下的面积(AUC)，该时间点为12小时，标记#表示Tlast＝8小时或4小时。
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