具体实施方式

本发明在本文中使用几个定义来描述，如下文和整个说明书中所阐述的。

定义

除非另有说明或上下文指示，否则术语“一个”、“一种”和“该”是指“一个或多个/一种或多种”。例如，“一个/一种化合物”或“一个/一种抑制剂”应分别解释为“一个或多个/一种或多种化合物”和“一个或多个/一种或多种抑制剂”。

如本文所用，“大约”、“约”、“基本上”和“显著”将被本领域普通技术人员理解并且将在它们使用的上下文中在一定程度上变化。如果这些术语的使用鉴于使用它们的上下文对于本领域普通技术人员来说是不清楚的，则“大约”和“约”将意指特定术语的正负≤10％，并且“基本上”和“显著”将意指特定术语的正负>10％。

如本文所用，术语“包括”和“包括有”与术语“包含”和“包含有”具有相同的含义，因为这些后面的术语是“开放的”过渡术语，其不将权利要求仅限于这些过渡术语之后所列举的元素。术语“由……组成”虽然被术语“包括”涵盖，但应被解释为“封闭的”过渡术语，其将权利要求仅限于在该过渡术语之后所列举的元素。术语“基本上由……组成”虽然被术语“包括”涵盖，但应被解释为“部分封闭的”过渡术语，它允许在该过渡术语之后的附加元素，但前提是这些附加元素不会实质性地影响权利要求的基本和新颖的特征。

所公开的方法涉及治疗有需要的受试者的方法。特别地，所公开的方法涉及向有需要的受试者施用免疫疗法的方法。

如本文所用，“受试者”与“患者”或“个体”可互换使用并且意指需要治疗(例如，包括施用神经元一氧化氮合酶抑制剂(即nNOS抑制剂)的治疗)的动物，其可以是人或非人动物。

“需要治疗的受试者”可以包括患有细胞增殖性疾病、病症或病况例如癌症的受试者。癌症可以包括但不限于腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、肉瘤和畸胎癌，特别是肾上腺、膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、子宫颈、胆囊、神经节、胃肠道、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲状旁腺、前列腺、皮肤、睾丸、胸腺和子宫的癌症。

“需要治疗的受试者”尤其可以包括患有黑色素瘤或处于发展黑色素瘤的风险中的受试者。更具体地，“需要治疗的受试者”可以包括患有I期黑色素瘤、II期黑色素瘤、III期黑色素瘤或IV期黑色素瘤的受试者或处于发展I期黑色素瘤、II期黑色素瘤、III期黑色素瘤或IV期黑色素瘤的风险中的受试者。

“需要治疗的受试者”尤其可以包括患有黑色素瘤并且表现出IFN-γ刺激的黑色素瘤进展或处于发展IFN-γ刺激的黑色素瘤进展的风险中的受试者。“需要治疗的受试者”尤其可以包括患有黑色素瘤并且表现出以nNOS表达水平升高为特征的黑色素瘤或处于发展以nNOS表达水平升高为特征的黑色素瘤的风险中的受试者(任选地其中nNOS表达水平升高由IFN-γ诱导)。“需要治疗的受试者”尤其可以包括患有黑色素瘤并且表现出以信号转导和转录激活因子1和3(STAT1/3)的表达水平升高为特征的黑色素瘤或处于发展以信号转导和转录激活因子1和3(STAT 1/3)的表达水平升高为特征的黑色素瘤的风险中的受试者(任选地，其中STAT 1/3的表达水平升高由IFN-γ诱导)。“需要治疗的受试者”尤其可以包括患有黑色素瘤并且表现出以程序性死亡配体1(PD-L1)的表达水平升高为特征的黑色素瘤或处于发展以程序性死亡配体1(PD-L1)的表达水平升高为特征的黑色素瘤的风险中的受试者(任选地，其中PD-L1的表达水平升高由IFN-γ诱导)。

神经元一氧化氮合酶抑制剂在癌症患者的免疫疗法中的用途

所公开的主题涉及向有需要的受试者施用免疫疗法的方法。该方法通常包括向受试者施用有效量的神经元一氧化氮合酶(nNOS)抑制剂以诱导免疫治疗反应。

在所公开的方法的一些实施方案中，受试者可能患有细胞增殖性疾病或病症，或者可能处于发展如本文公开的和本领域已知的细胞增殖性疾病或病症的风险中。特别地，受试者可能患有黑色素瘤或可能处于发展黑色素瘤(例如，I期黑色素瘤、II期黑色素瘤、III期黑色素瘤或IV期黑色素瘤)的风险中。

在所公开的方法的一些实施方案中，受试者可能患有黑色素瘤并且表现出IFN-γ刺激的黑色素瘤进展或可能处于发展IFN-γ刺激的黑色素瘤进展的风险中。在所公开的方法的进一步实施方案中，受试者可能患有黑色素瘤并且表现出以nNOS表达水平升高为特征的黑色素瘤或处于发展以nNOS表达水平升高为特征的黑色素瘤的风险中(例如，nNOS表达水平升高由IFN-γ诱导)。在所公开的方法的进一步实施方案中，受试者可能患有黑色素瘤并且表现出以信号转导和转录激活因子1和3(STAT 1/3)的表达水平升高为特征的黑色素瘤或处于发展以信号转导和转录激活因子1和3(STAT 1/3)的表达水平升高为特征的黑色素瘤的风险中(例如，STAT 1/3的表达水平升高由IFN-γ诱导)。在所公开的方法的更进一步的实施方案中，受试者可能患有黑色素瘤并且表现出以程序性死亡配体1(PD-L1)的表达水平升高为特征的黑色素瘤或处于发展以程序性死亡配体1(PD-L1)的表达水平升高为特征的黑色素瘤的风险中(例如，PD-L1的表达水平升高由IFN-γ诱导)。

在所公开的方法中，通常向该方法的受试者施用神经元一氧化氮合酶(nNOS)的抑制剂。nNOS抑制剂、包含nNOS抑制剂的药物组合物和施用nNOS抑制剂作为疗法的方法在本文中公开并且是本领域已知的。(参见，例如，美国公开申请号：20170298021,“2-Aminopyridine-based Selective Neuronal Nitric Oxide Synthase Inhibitors”；20170275278,“Mammalian and Bacterial Nitric Oxide Synthase Inhibitors”；20170260165,“2-Imidazolyl-Pyrimidine Scaffolds as Potent and SelectiveInhibitors of Neuronal Nitric Oxide Synthase”；20160368877,“2-Aminoquinoline-Based Compounds for Potent and Selective Neuronal Nitric Oxide SynthaseInhibition”；20160347713,“2-Aminopyridine-based Selective Neuronal NitricOxide Synthase Inhibitors”；20160152590,“Thiophene-2-carboximidamide BasedSelective Neuronal Nitric Oxide Synthase Inhibitors”；20160122302,“Mammalianand Bacterial Nitric Oxide Synthase Inhibitors”；20160096821,“Chiral Synthesisof Pyrrolidine Core Compounds en route to Neuronal Nitric Oxide SynthaseInhibitors”；20160096806,“2-Aminoquinoline-Based Compounds for Potent andSelective Neuronal Nitric Oxide Synthase Inhibition”；20160009690,“2-Imidazolyl-Pyrimidine Scaffolds as Potent and Selective Inhibitors ofNeuronal Nitric Oxide Synthase”；20150368201,“2-Aminopyridine-based SelectiveNeuronal Nitric Oxide Synthase Inhibitors”；20150252020,“IntramolecularHydrogen-Bonded Nitric Oxide Synthase Inhibitors”；20150210644,“2-Aminoquinoline-based Compounds for Potent and Selective Neuronal Nitric OxideSynthase Inhibition”；20140256958,“Thiophene-2-carboximidamide Based SelectiveNeuronal Nitric Oxide Inhibitors”；20140256016,“2-Aminopyridine-basedSelective Neuronal Nitric Oxide Synthase Inhibitors”；20140228578,“ChiralSynthesis of Pyrrolidine Core Compounds en route to Neuronal Nitric OxideSynthase Inhibitors”；20140163016,“Benzoxazines,Benzothiazines,and RelatedCompounds having NOS Inhibitory Activity”；20140147920,“Specific nNOSInhibitors for the Therapy and Prevention of Human Melanoma”；20140066635,“Thiophene-2-carboximidamide Based Selective Neuronal Nitric OxideInhibitors”；20130040359,“Aminopyridine dimer compounds,compositions andrelated methods for neuronal nitric oxide synthase inhibition”；20120258513,“Selective Neuronal Nitric Oxide Synthase Inhibitors”；20120238016,“SpecificnNOS Inhibitors for the Therapy And Prevention Of Human Melanoma”；20120122855,“Benzoxazines,Benzothiazines,and Related Compounds having NOSInhibitory Activity”；20120088798,“Intramolecular Hydrogen-Bonded Nitric OxideSynthase Inhibitors”；20120004415,“Chiral Synthesis of Pyrrolidine CoreCompounds en route to Neuronal Nitric Oxide Synthase Inhibitors”；20100292484,“Chiral Pyrrolidine Core Compounds en route to Inhibitors of Nitric OxideSynthase”；20100203613,“Aminopyridine Dimer Compounds,Compositions and RelatedMethods for Neuronal Nitric Oxide Synthase Inhibition”；20100190230,“Potentand Selective Neuronal Nitric Oxide Synthase Inhibitors with ImprovedMembrane Permeability”；20100009975,“Benzoxazines,Benzothiazines,and RelatedCompounds having NOS Inhibitory Activity”；20090104677,“HeteroaromaticSelective Inhibitors of Neuronal Nitric Oxide Synthase”；20080234237,“Quinolone and Tetrahydroquinolone and Related Compound Having NOS InhibitoryActivity”；20080176907,“NOS Inhibitors For Treatment Of Motor DeficitDisorders”；20080108814,“Potent and highly selective heteroaromatic inhibitorsof neuronal nitric oxide synthase”；20050159363,“Selective neuronal nitricoxide synthase inhibitors”；20050107369,“Heteroaromatic selective inhibitorsof neuronal nitric oxide synthase”；and 20030119751,“Selective neuronal nitricoxide synthase inhibitors”；它们的内容通过引用整体并入本文)。

在所公开的方法的一些实施方案中，施用的nNOS抑制剂是具有下式的化合物MAC-3-190:

或其合适的药用盐、溶剂化物或水合物。化合物MAC-3-190在美国公开申请号20160368877中作为“化合物14”公开(其内容通过引用整体并入本文)。

前述权利要求中任一项的方法，其中所述nNOS抑制剂是具有下式的化合物HH044：

或其合适的药用盐、溶剂化物或水合物。化合物HH044在美国公开申请号20160152590中作为“化合物7”公开(其内容通过引用整体并入本文)。

在所公开的方法中，通常向受试者施用NOS抑制剂以诱导免疫治疗反应。在所公开的方法的一些实施方案中，向受试者施用NOS抑制剂，其诱导免疫治疗反应，包括诱导PD-L1表达的降低。例如，在其中受试者患有黑色素瘤的所公开的方法的一些实施方案中，向受试者施用NOS抑制剂，其诱导免疫治疗反应，包括黑色素瘤中PD-L1表达的降低。

在所公开的方法中，通常向受试者施用NOS抑制剂以诱导免疫治疗反应。在所公开的方法的一些实施方案中，可以向受试者施用另外的治疗剂。例如，在所公开的方法的一些实施方案中，向受试者施用NOS抑制剂并且进一步施用包含IFN-α的药物组合物。包含IFN-α的药物组合物是本领域已知的。(参见，例如，A品牌干扰素α2a、A/品牌干扰素α2b和品牌人白细胞干扰素-α(HuIFN-α-Le))。

在所公开的方法的进一步实施方案中，向受试者施用NOS抑制剂并且进一步施用包含PD-L1抑制剂和/或PD-1抑制剂的药物组合物。包含PD-L1抑制剂的药物组合物是本领域已知的。(参见例如，阿特珠单抗(Tecentriq^TM)(Roche Genentech)、阿维单抗(Bavencio^TM)(Merck Serono)、度伐利尤单抗(Imfinzi^TM)(AstraZeneca)、BMS-936559(Bristol-Myers Squibb)和CK-301(Checkpoint Therapeutics))。包含PD-1抑制剂的药物组合物也是本领域已知的。(参见例如，帕博利珠单抗(Keytruda^TM)(Merck)和纳武单抗(Opdivo^TM)(Bristol-Myers Squibb))。

在所公开的方法的一些实施方案中，向受试者施用NOS抑制剂并且进一步施用包含用于治疗黑色素瘤的化学治疗剂的药物组合物。在所公开的方法的一些实施方案中，向受试者施用NOS抑制剂并且进一步施用达卡巴嗪。在所公开的方法的其他实施方案中，向受试者施用NOS抑制剂并且进一步向受试者施用替莫唑胺。

举例说明性实施方案

以下实施方案是举例说明性的并且不应被解释为限制所要求保护的主题的范围。

实施方案1.一种向有需要的受试者施用免疫疗法的方法和/或治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的神经元一氧化氮合酶(nNOS)抑制剂以用于诱导免疫治疗反应和/或有效量的。

实施方案2.实施方案1的方法，其中所述受试者患有细胞增殖性疾病或病症。

实施方案3.实施方案1或实施方案2的方法，其中所述受试者患有黑色素瘤。

实施方案4.前述实施方案中任一项的方法，其中所述受试者患有I期黑色素瘤、II期黑色素瘤、III期黑色素瘤或IV期黑色素瘤或处于发展I期黑色素瘤、II期黑色素瘤、III期黑色素瘤或IV期黑色素瘤的风险中。

实施方案5.前述实施方案中任一项的方法，其中所述受试者患有黑色素瘤并且表现出IFN-γ刺激的黑色素瘤进展或处于发展IFN-γ刺激的黑色素瘤进展的风险中。

实施方案6.前述实施方案中任一项的方法，其中所述受试者患有黑色素瘤并且表现出以nNOS表达水平升高为特征的黑色素瘤或处于发展以nNOS表达水平升高为特征的黑色素瘤的风险中。

实施方案7.前述实施方案中任一项的方法，其中所述受试者患有黑色素瘤并且表现出以由IFN-γ诱导的nNOS表达水平升高为特征的黑色素瘤或处于发展以由IFN-γ诱导的nNOS表达水平升高为特征的黑色素瘤的风险中。

实施方案8.前述实施方案中任一项的方法，其中所述受试者患有黑色素瘤并且表现出以信号转导和转录激活因子1和3(STAT 1/3)的表达水平升高为特征的黑色素瘤或处于发展以信号转导和转录激活因子1和3(STAT 1/3)的表达水平升高为特征的黑色素瘤的风险中。

实施方案9.前述实施方案中任一项的方法，其中所述受试者患有黑色素瘤并且表现出以由IFN-γ诱导的STAT 1/3的表达水平升高为特征的黑色素瘤或处于发展以由IFN-γ诱导的STAT 1/3的表达水平升高为特征的黑色素瘤的风险中。

实施方案10.前述实施方案中任一项的方法，其中所述受试者患有黑色素瘤并且表现出以程序性死亡配体1(PD-L1)的表达水平升高为特征的黑色素瘤或处于发展以程序性死亡配体1(PD-L1)的表达水平升高为特征的黑色素瘤的风险中。

实施方案11.前述实施方案中任一项的方法，其中所述受试者患有黑色素瘤并且表现出以由IFN-γ诱导的程序性死亡配体1(PD-L1)的表达水平升高为特征的黑色素瘤或处于发展以由IFN-γ诱导的程序性死亡配体1(PD-L1)的表达水平升高为特征的黑色素瘤的风险中。

实施方案12.前述实施方案中任一项的方法，其中nNOS抑制剂是具有下式的化合物MAC-3-190:

或其合适的药用盐、溶剂化物或水合物。

实施方案13.前述实施方案中任一项的方法，其中nNOS抑制剂是具有下式的化合物HH044:

或其合适的药用盐、溶剂化物或水合物。

实施方案14.前述实施方案中任一项的方法，其中所述免疫治疗反应包括PD-L1表达的降低。

实施方案15.前述实施方案中任一项的方法，其中受试者患有黑色素瘤并且免疫治疗反应包括黑色素瘤中PD-L1表达的降低。

实施方案16.前述实施方案中任一项的方法，进一步包括向受试者施用IFN-α。

实施方案17.前述实施方案中任一项的方法，进一步包括向受试者施用PD-L1抑制剂(例如，阿特珠单抗)或PD-1抑制剂(例如，帕博利珠单抗或纳武单抗)。

实施方案18.前述实施方案中任一项的方法，进一步包括向受试者施用化学疗法。

实施方案19.前述实施方案中任一项的方法，进一步包括向受试者施用达卡巴嗪。

实施方案20.前述实施方案中任一项的方法，进一步包括向受试者施用替莫唑胺。

实施例

以下实施例是举例说明性的，并不旨在限制要求保护的主题的范围。

标题：神经元一氧化氮合酶(nNOS)在干扰素-γ(IFN-γ)-诱导的黑色素瘤进展中 的作用

参考待提交审查并在本申请提交之后公布的手稿Fong,S.,Silverman,R.,和Yang,S.,“The Role of Neuronal Nitric Oxide Synthase(nNOS)in Interferon-Gamma(IFN-γ)-Induced Melanoma Progression”。

摘要

背景：干扰素-γ(IFN-γ)，其由人免疫细胞产生，并且已被显示在黑色素瘤的发展和进展中起作用。然而，潜在的机制尚未完全了解。

目的：我们因此在体外和体内研究了神经元一氧化氮合酶(nNOS)介导的信号传导途径在IFN-γ刺激的黑色素瘤进展中的作用，并确定IFN-γ的这种刺激是否通过使用药物抑制剂阻断nNOS-一氧化氮(NO)信号传导而受到抑制。

结果：我们的研究表明，IFN-γ显著诱导黑色素瘤细胞中nNOS的表达水平，而用IFN-alpha(IFN-α)(一种FDA批准的黑色素瘤辅助疗法)治疗时不存在这种诱导。一致地，在IFN-γ暴露后细胞内NO水平也增加。在黑色素瘤细胞中，STAT 1和3被IFN-γ处理激活，这与磷酸化STAT1/3的水平增加有关。新型nNOS抑制剂可在低浓度(3μM)下有效缓解IFN-γ激活的STAT1/3。进一步的反相蛋白阵列(RPPA)分析表明，IFN-γ诱导与黑色素瘤增殖、侵袭和免疫抑制相关的基因例如HIF1α、c-Myc和程序性死亡配体1(PD-L1)的表达，而在IFN-α暴露后没有观察到这种变化。值得注意的是，PD-L1表达水平增加到对照的1.8倍，而对于IFN-α处理则不存在这种情况。流式细胞术和免疫荧光染色也证实了IFN-γ对PD-L1的诱导。使用特定抑制剂阻断nNOS介导的信号传导途径被显示有效减少黑色素瘤细胞中IFN-γ诱导的PD-L1。此外，使用异种移植黑色素瘤模型，我们的体内动物研究表明，与对照相比，IFN-γ增加肿瘤生长，这通过nNOS抑制剂MAC-3-190(5mg/kg/天)的共同施用得到逆转。另一种nNOS抑制剂HH044被显示有效抑制体内肿瘤生长，这与异种移植黑色素瘤肿瘤中降低的PD-L1表达水平有关。

创新：我们的研究首次证明了nNOS介导的一氧化氮信号传导途径在IFN-γ刺激的黑色素瘤进展中的重要作用。

结论：使用高选择性药物抑制剂靶向nNOS是改善黑色素瘤治疗的独特且有效的策略。

引言

近几十年来，人皮肤黑色素瘤(CM)的发病率持续增加，使这种疾病成为日益严重的公共卫生问题。黑色素瘤占所有皮肤癌病例的不到1％，但占皮肤癌死亡的绝大多数。具有高基因组突变率(43)，它是最致命和最具侵袭性的皮肤癌形式，远端转移患者的五年生存率为15-20％(1)。与手术切除相结合的早期鉴定为患者带来最佳结果。由于该疾病利用了多种耐药机制，传统细胞毒性化疗的效率非常有限，由于其作用机制缺乏特异性，其也与严重的毒性有关。

已充分证明肿瘤微环境(TME)可以保护癌细胞免受免疫反应，从而使它们能够逃避有效的免疫监视。由于对免疫系统在癌症中的病理生理学和作用的增加的理解，免疫疗法已成为一种黑色素瘤治疗的有前途的新方法。近年来，在理解黑色素瘤的免疫学并将其转化为强有力的治疗策略方面取得了长足的发展。因此，癌症治疗目前正在经历从经典的细胞毒性药剂向鉴定能够恢复和/或激活免疫系统以打破肿瘤相关的免疫耐受的药剂(mAb和小分子)的范式转变。免疫疗法通过靶向特定生物标志物来利用患者自身的免疫系统，这使肿瘤学家能够根据每个患者的疾病的独特复杂性来定制治疗(21,61)。尽管取得了令人兴奋的发展，但革命性的免疫疗法主要适用于患有不可切除或转移性的黑色素瘤的患者和在其他治疗时或之后有疾病进展的患者(27)。此外，由于大量黑色素瘤患者未能对治疗做出反应或迅速获得对治疗的耐药性，免疫检查点抑制剂的缺点也已被发现。不幸的是，尚未鉴定生物标志物来区分将从免疫疗法获得长期益处的患者。此外，鉴于严重免疫相关不良事件的高发生率，尽管有潜在更长的无进展生存期(PFS)益处，但是患者的生活质量并不理想(13)。因此，开发阻止黑色素瘤生成和疾病进展到晚期的新型治疗干预措施将具有重大影响和重要性。

紫外线辐射(UVR)被认为是黑色素瘤发展的主要环境因素。研究表明，作为致癌物，UVR可导致嘧啶二聚体的形成和氧化DNA碱基损伤，例如8-氧-7,8-二氢-2-脱氧鸟苷(8-oxo-dG)，从而导致基因组突变。B-raf原癌基因(BRAF)是一种在黑色素瘤患者中常见的突变基因(53,88)。然而，一项研究表明BRAF突变的黑色素瘤在低累积UV剂量下在生命早期出现(10)。突变的BRAF也存在于良性和发育不良的黑色素细胞痣中，这表明可能需要其他因素来引发黑色素瘤(16)。UVR可能是参与黑色素瘤发生和疾病进展的重要因素，因为许多流行病学研究表明UVR与皮肤恶性黑色素瘤的风险之间存在密切关联(34,63)。

已充分证明UVR导致人皮肤中一氧化氮(NO)的显著增加。NO是一种重要的信号传导分子，参与许多生理和病理功能，例如血管扩张、色素沉着和巨噬细胞细胞毒性。研究还表明，ΝΟ是参与调节免疫反应和T细胞增殖的重要介导因子(5)。

近年来，越来越多的研究揭示了NO在肿瘤发展和进展中的作用。NO已被显示通过关键修复蛋白的亚硝基化抑制DNA修复，从而促进异常细胞的存活(35)。通过响应DNA损伤激活肿瘤抑制因子p53，NO保护黑色素瘤细胞免受顺铂的细胞毒性(75)。NO还可以通过作为有效的血管扩张剂在恶性细胞的血管生成和转移中发挥作用(36)。此外，与NO和其他活性氮类别(RNS)一起，UVR还在人体皮肤中产生大量的活性氧类别(ROS)，例如超氧化物。NO/RNS和ROS的相互作用产生有毒副产物，例如过氧亚硝酸盐，这些副产物具有遗传毒性，并通过引起DNA损伤和蛋白质修饰干扰细胞功能，进一步促进黑色素瘤进展(31)。

一氧化氮合酶(NOS)从L-精氨酸产生NO并且由诱导型NOS(iNOS)、内皮NOS(eNOS)和神经元NOS(nNOS)组成。iNOS产生高水平的NO并调节过程例如非特异性免疫防御。eNOS和nNOS都产生较低水平的NO；eNOS参与血管功能例如血管舒张，而主要在神经组织中表达的nNOS参与中枢神经系统(CNS)活动。由于黑色素细胞起源于神经嵴并具有许多与神经细胞相似的基因表达特征(22)，因此nNOS在调节黑色素细胞中的NO水平方面发挥着重要作用(3)。我们对患者活组织检查的研究还表明，与正常皮肤相比，所有测试的恶性黑色素瘤都表现出明显更高的nNOS表达水平，这与疾病分期显著相关(86)。在Liu等人(2014)最近报道的一项研究中，人黑色素瘤组织中升高的nNOS表达与导致免疫抑制的循环T淋巴细胞的免疫功能障碍有关(46)。研究还表明，NO清除剂表现出保护细胞免受细胞毒性机制影响的抗氧化作用(26,51)。尽管需要进一步的机制研究，但这项探索性观察研究揭示了nNOS介导的NO信号传导在调节免疫反应中的重要作用，尤其是对于人黑色素瘤的重要作用(46)。越来越多的证据表明，靶向nNOS信号传导可能潜在地干扰黑色素瘤细胞的肿瘤免疫反应。

临床前研究显示使用IFN-γ暴露增强肿瘤转移潜力，这在如前所述的包括黑色素瘤的几种不同模型系统(24,50)中是一致的。在UVB-HGF/SF转基因小鼠黑色素瘤模型(其来源于肝细胞生长因子/散射因子(HGF/SF)的新生儿UV照射)中的一项研究表明，巨噬细胞生成的IFN-γ直接参与通过抑制细胞凋亡促进黑色素瘤生长(90)。阻断IFN-γ而不是IFN-α的特异性抗体消除UVB诱导的黑色素细胞活化。还提出，取决于微环境因素的背景，IFN-γ的作用可能从免疫监视转变为免疫编辑(92)。事实上，早在1990年进行的SouthwestOncology Group(SWOG)临床试验表明，IFN-γ治疗刺激早期黑色素瘤患者的疾病进展，其中有超过50％的复发或死亡。尽管一项针对B16小鼠黑色素瘤细胞的研究表明IFN-γ在抑制转移和减少肿瘤发展方面具有有益作用(25,38)，但该小鼠模型与人疾病的相关性非常弱。我们的研究通过使用特定合成的nNOS抑制剂检查nNOS-NO对IFN-γ刺激的黑色素瘤进展的影响，促成对黑色素瘤进展的了解。

信号转导和转录激活因子(STAT)1和3是IFN-γ的下游靶标。已经发现STAT1和STAT3参与了许多基因的调节，这些基因促成黑色素瘤的信号传导途径(40)并且被认为是许多癌症类型中的致癌基因(8,57)。在本研究中，我们将讨论STAT1/3的激活是否与NO信号传导途径的激活有关。

程序性死亡配体1(PD-L1)是一种在许多癌细胞类型(包括乳腺癌和黑色素瘤)中表达的跨膜蛋白，并通过与程序性死亡受体-1(PD-1)结合在抑制免疫系统中发挥重要作用，导致T淋巴细胞凋亡或失活(94)。PD-1通常在免疫细胞(例如调节性T细胞(Treg)和效应T细胞)中表达，并通过T细胞受体(TCR)激活由IL-2分泌上调。效应T细胞中的组成型PD-1表达限制了自身免疫反应，而其在Treg中的表达防止过度炎症并促进免疫稳态(71)。PD-L1与黑色素瘤抑制T细胞反应和逃避免疫反应的能力有关(37)。已经观察到PD-L1表达与疾病侵袭性增加有关(7)。加州大学洛杉矶分校(UCLA)的一项研究发现STAT1/3结合位点存在于PD-L1启动子上(28)。患者肿瘤中分泌IFN-γ的CD8⁺肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的存在与PD-L1表达强烈相关(39)。革命性的新型抗癌药物，称为检查点抑制剂，可以靶向PD-1/PD-L1信号传导并阻止PD-1与PD-L1结合，这释放患者免疫系统的力量并增强T细胞清除癌细胞的能力。最近，研究表明IFN-γ以NF-kB依赖性方式诱导人黑色素瘤细胞中PD-L1的表达(29)。此外，另一项研究表明，IFN-γ的瘤内注射未能诱导标志性的抗肿瘤免疫基因(55)。

在转基因小鼠黑色素瘤模型中，研究表明PD-L1诱导可能是IFN-γ刺激黑色素瘤进展的成分之一(30,91)。在生命早期，间歇性暴露于晒伤剂量的UVR导致黑色素细胞中的突变，并且如果携带突变的细胞可以持续逃避免疫监视，则导致黑色素瘤发展。NO对T淋巴细胞的抑制性调节也可能促成人中UVR诱导的免疫抑制(32,66)。鉴于此，合乎道理的是NO可能是IFN-γ和PD-L1介导的免疫检查点之间的信使。

迄今为止，IFN-γ介导的促肿瘤发生的潜在分子机制尚未明确定义。越来越多的证据表明，IFN-γ可能通过nNOS/NO途径直接地或通过潜在的PD-L1介导的免疫抑制间接地改变黑色素瘤细胞的免疫微环境。我们的研究侧重于证明IFN-γ刺激的黑色素瘤进展的潜在机制，并开发靶向IFN-γ介导的信号途径的新型药物抑制剂以用于黑色素瘤预防和治疗。我们的研究的完成不仅将增强我们对黑色素瘤发病机制的基本了解，而且还将导致开发补充现有的使用FDA批准的检查点抑制剂的免疫疗法的药物治疗。

结果

IFN-γ通过激活nNOS-NO信号传导刺激黑色素瘤进展。利用转移性黑色素瘤A375细胞，我们确定了IFN-γ对黑色素瘤侵袭潜力的影响。如图1A所示，与对照相比，IFN-γ显著增强了黑色素瘤的侵袭潜力(p<0.05)。黑色素瘤细胞对成纤维细胞的粘附能力也被IFN-γ显著增强(图1B)，表明转移潜能的获得(56)。

如图2A所示，IFN-γ显著诱导原代黑色素瘤WM3211细胞中的nNOS表达水平，其甚至在96小时后仍持续存在。相比之下，在IFN-α处理后4小时内，nNOS的表达迅速降至检测不到的水平，然后到24小时的时候恢复(图2B)。当暴露于IFN-α和IFN-γ时，该相同的模式在不同的细胞系A375细胞中也很明显(图2C)。与转移性A375细胞相比，原发性黑色素瘤WM3211细胞对IFN-γ处理更敏感；在低至100单位/mL时观察到nNOS的诱导。与增加的nNOS表达平行地，在暴露于IFN-γ后，使用DAF-FM荧光探针还检测到升高的细胞内NO水平。然而，在用IFN-α处理的黑色素瘤细胞中，NO产生显著降低(图2D)，这与IFN-α处理后降低的nNOS表达一致(图2B和2C)。在A375细胞中，shRNA-nNOS对nNOS的敲低显著消除了24小时的IFN-γ处理对nNOS的诱导(图2E)。

作为IFN-γ的下游靶标和PD-L1表达的重要转录因子(54)，当细胞暴露于IFN-γ时，STAT3的表达水平增加至对照的1.6倍。磷酸-STAT3水平也被诱导至对照的1.9倍，这表明IFN-γ处理与STAT3介导的信号传导的激活有关(图3A)。有趣的是，nNOS抑制剂MAC-3-190和HH044未能抑制IFN-γ可诱导的nNOS，但3μM的MAC-3-190有效地减少了在用IFN-γ共同处理细胞时激活的STAT3表达的诱导(图3B)。虽然观察到IFN-α增加STAT1的表达，但IFN-γ表现出更高的STAT1诱导，当用nNOS抑制剂共同处理时，这也被有效地减少(图3C)。

通过nNOS抑制剂处理减少IFN-γ对PD-L1表达的诱导。在我们的研究中，我们还使用RPPA来评估IFN-α和IFN-γ对三种人黑色素瘤细胞系中主要生长和存活信号传导分子的影响(图4A)。与最近的一项研究(29)一致，与对照相比，IFN-γ处理显著上调了PD-L1表达。IFN-γ处理后增加的c-Myc和HIF-1α表达水平也很明显(图4B)，这与黑色素瘤患者的肿瘤转移和预后不良有关(33,45)。

使用流式细胞术证实了IFN-γ对PD-L1的上调(图4C)。我们的数据显示，在通过流式细胞术检测的所有三种细胞系中，IFN-γ增加了PD-L1的细胞表面表达，而相同浓度的IFN-α降低了PD-L1表达。值得注意的是，nNOS抑制剂MAC-3-190在72小时处理后显著逆转了IFN-γ对PD-L1的诱导(图4D)；通过流式细胞术获得的PD-L1染色的MFI从对照的3.3倍降低到对照的1.9倍(图4E)。

在从免疫荧光显微术获得的图像中，对照和经IFN-α处理的细胞显示出PD-L1的低基础表达。然而，在IFN-γ处理后，PD-L1的细胞外表达在黑色素瘤细胞中被显著诱导，如强烈的绿色荧光染色所示。使用3μM的MAC-3-190的共同处理显著降低了IFN-γ可诱导的PD-L1表达，而与对照相比，单独使用MAC-3-190处理没有改变PD-L1的基础水平(图5)。

综上所述，这些结果与我们的假设一致，即IFN-γ通过激活nNOS-NO信号传导而维持更具侵袭性的黑色素瘤细胞表型；新型nNOS抑制剂有效地消除了STAT1/3的激活和IFN-γ处理对PD-L1表达的诱导。

nNOS抑制剂在异种移植小鼠模型中在IFN-γ的存在下抑制肿瘤生长。在我们的研究中，新开发的nNOS抑制剂在体外(表1)和体内(图6)都表现出有效的抗黑色素瘤活性。如表1所示，所有候选化合物的IC₅₀均小于10μM，这与化疗药物顺铂的IC₅₀(在A375和Sk-mel-28细胞中分别为4.2μM和14.3μM)相当或甚至更有效。值得注意的是，与原代早期WM3211细胞相比，nNOS抑制剂在转移性黑色素瘤A375细胞中的抑制作用更为显著，这支持我们的假设，即nNOS/NO信号传导对黑色素瘤进展比在起始阶段中更为关键。

表1.新型强力和高选择性nNOS抑制剂。使用的所有NOS同工酶都是在大肠杆菌中过表达的重组酶。Ki值是使用已知文献方法直接计算的，并在共同负责人(co-PI)R.Silverman发表的手稿(17,18,64,85)中有详细说明。通过MTT比色分析检测nNOS抑制剂在人黑色素瘤中的细胞毒性作用(85)。IC₅₀值是至少两种人黑色素瘤细胞系的平均值。

使用黑色素瘤异种移植肿瘤模型，我们的动物研究表明，IFN-γ处理(1000单位/天)显著刺激体内肿瘤生长(图6A)。如图6B所示，使用MAC-3-190(一种水溶性强力nNOS抑制剂)共同处理在研究结束时有效地减少了肿瘤体积的诱导(与IFN-γ处理相比，p<0.05)。MAC-3-190的有效剂量低至每天皮下注射的5mg/kg。

我们进一步确定了nNOS抑制剂HH044在肿瘤生长中的体内作用。用HH044处理(10mg/kg腹膜内21天)显著降低了肿瘤生长，其中没有观察到明显的全身毒性(图6C)。如图6D所示，在研究结束时还发现，用HH044处理的肿瘤的质量减少，其中肺重量和体重没有显著变化(与对照相比，p<0.05)。对从异种移植肿瘤获得的单细胞悬液的分析显示，与对照组相比，HH044处理的小鼠的PD-L1表达水平显著降低(图6E，p<0.05)。

当用IFN-γ处理时，CD8阴性黑色素瘤肿瘤中的PD-L1表达升高。如图7所示，对照A375异种移植肿瘤中PD-L1的阳性染色>10％，其在IFN-γ的21天处理后升高至>20％(每只小鼠1000单位，每天腹膜内)。使用MAC-3-190的共同处理将PD-L1阳性染色有效地降低至>15％，表明nNOS活性在体内调节PD-L1表达中的作用(图7A和7B)。在2×放大倍数下，很明显的是CD8+染色阳性的区域(图7D)也对PD-L1强阳性染色(图7C)。用IFN-γ处理后，CD8阴性组织中PD-L1阳性染色也很明显，这表明PD-L1的诱导与肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的存在无关，并且可能被IFN-γ直接刺激。该作用似乎被使用MAC-3-190(5mg/kg/天)的共同施用有效阻止。

讨论

我们的研究首次证明了nNOS介导的NO信号传导在体外和体内在IFN-γ刺激的黑色素瘤进展中的关键作用(图8)。通过使用新型小分子抑制剂抑制nNOS，我们成功抑制了黑色素瘤转移潜能和IFN-γ处理刺激的PD-L1的诱导。我们的数据还表明，在IFN-γ暴露后，使用nNOS抑制剂的共同处理有效地减少了NO的产生以及STAT1和STAT3信号传导的激活。一致地，我们的体内研究表明，在黑色素瘤异种移植小鼠模型中，使用nNOS抑制剂MAC-3-190有效抑制由IFN-γ刺激的黑色素瘤肿瘤生长。我们的研究结合越来越多的证据表明，使用小分子抑制剂靶向nNOS介导的NO信号传导可能是黑色素瘤治疗的一种新颖有效的策略。

与IFN-γ不同，IFN-α已在临床中广泛用作黑色素瘤患者的辅助治疗，这些患者被认为处于手术切除后复发的高风险。IFN-α通过不同机制(包括免疫调节)发挥其抗肿瘤作用，将宿主免疫从Th2主要反应转变为Th1反应(2)，从而导致改善的无病存活(20,23)。在基因工程小鼠黑色素瘤模型中，与PD-1的阻断组合的IFN-α的靶向激活被显示显著延长存活(9)。我们的研究表明，从4到6小时的处理，IFN-α将nNOS表达降低到检测不到的水平，但到24小时的时候表达恢复。随着延长的处理，96小时的nNOS表达水平与对照相比降低。这表明可能存在一种恢复nNOS表达的适应性机制，尽管IFN-α的抑制作用随着处理的继续而持续存在。

在抗原特异性免疫发展之前，主要由天然杀伤(NK)细胞和天然杀伤T(NKT)细胞作为先天反应的一部分产生的IFN-γ对免疫反应至关重要(68)。分泌的IFN-γ介导抗原呈递细胞(APC)的功能，抑制Th2细胞发育并促进Th1细胞分化，其进一步增加IFN-γ分泌(77)。对健康个体的研究表明，暴露于UV辐射后，血清IFN-γ水平显著升高，并保持升高数周(47)。据报道，在肝细胞癌中，IFN-γ的低血清水平是疾病复发的预测因子(44)。然而，近年来，越来越多的研究揭示了IFN-γ在人黑色素瘤中的明显的促肿瘤发生活性。

在晒伤的情况下，巨噬细胞被募集到该区域并分泌IFN-γ，其可能改变癌细胞的微环境(70)。在UVB-HGF/SF转基因小鼠模型中，阻断IFN-γ有效地消除了巨噬细胞增强的黑色素瘤生长和存活(90)。尽管巨噬细胞的IFN-γ介导的NO产生在针对微生物病原体的保护性免疫中起着关键作用(52)，但早期的小鼠研究表明，T细胞衍生的IFN-γ激活NO的产生，其通过启动巨噬细胞活化的循环抑制T细胞增殖(4,81)。一致地，其他研究表明NO的上调与免疫抑制有关(79)，这可能至少部分促成UV诱导的局部免疫抑制(65)并随后促进其在癌症中观察到的细胞增殖和侵袭潜力的刺激(31,85)。

Lollini的小组表明，但IFN-γ处理产生了肿瘤转移的显著增加，而与其在小鼠黑色素瘤中的抗增殖作用无关，其中肺转移的数量增加了大约20倍，尽管在体外存在细胞生长的99％的抑制(49)。我们的研究还观察到IFN-γ显著增加了黑色素瘤细胞的侵袭和转移潜力(图1)。一致地，最近的另一项研究表明，IFN-γ增强CD74的表达，CD74被称为主要组织相容性复合体II类缔合的不变链(major histocompatibility complex class II-associated invariant chain)，它与其配体相互作用，从而激活黑色素瘤中的PI3K/AKT途径，导致对肿瘤生存期和生长的促进(74)。在III期临床试验中也观察到了IFN-γ在人黑色素瘤中的这种显著的促肿瘤发生活性，该试验表明，使用IFN-γ的每天皮下注射的辅助治疗没有改善以治愈为目的进行了切除的患有高风险CM的患者的无病生存期或总生存期，从而构成反对任何临床有益应用的有力证据(59)。然而，IFN-γ介导的促肿瘤发生作用的分子机制尚未完全了解。与其他肿瘤相比，IFN-γ在黑色素瘤中的不同反应表明IFN-γ可能激活独特的信号传导途径，从而促进疾病的进展。

如我们的研究所示，我们发现IFN-γ处理主要诱导原代黑色素瘤细胞中的nNOS表达，而相同剂量的IFN-α显著降低nNOS水平。一致地，检测到的细胞内NO水平与nNOS表达水平相关，并在暴露于IFN-γ后增加。IFN-α和IFN-γ对调节nNOS-NO信号传导的影响可能有助于解释黑色素瘤患者中两种同种型IFN的不同临床反应，这也为IFN-γ刺激的黑色素瘤进展的发病机制提供了新的见解。此外，我们已经鉴定了人黑色素瘤的PD-L1介导的免疫抑制中nNOS-NO信号传导的新机制。nNOS抑制剂有效地逆转了黑色素瘤细胞中IFN-γ对PD-L1的诱导。此外，我们的体内研究表明，即使在10mg/kg/天的低剂量下，nNOS抑制剂MAC-3-190也显著降低异种移植肿瘤中的PD-L1表达。nNOS-NO信号传导在IFN-γ刺激的黑色素瘤进展和PD-L1介导的免疫抑制中的重要作用通过靶向IFN-γ-nNOS-NO-PD-L1信号传导轴为黑色素瘤的辅助治疗提供了独特的策略(图8)。

无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶-1/氧化还原因子-1(APE/Ref-1)(一种首先被认为是DNA核酸内切酶的多功能蛋白)被发现以氧化还原依赖性和氧化还原非依赖性方式调节许多核转录因子活性(82)。我们之前的研究表明，在人黑色素瘤中，过度激活的APE/Ref-1对氧化还原不平衡敏感，并通过具有DNA修复和氧化还原调节活性在疾病进展和耐药性发展中发挥重要作用(82,83)。除ROS外，NO还以正反馈方式激活APE/Ref-1，其导致黑色素瘤细胞中APE/Ref-1的组成型过度表达(87)。在早期的胰腺癌研究中，研究人员证明STAT3转录活性受APE/Ref-1活性的直接调节(14)，并且这可能是它们的可诱导复合物的形成的结果(67)。

作为下游靶标，众所周知转录因子STATl和STAT3受IFN-γ调节。当IFN-γ与JAK1和JAK2受体结合时，STAT随后被磷酸化激活，这使得STAT二聚体转位到细胞核中与γ激活序列(GAS)结合。激活的基因的独特模式可能重新引导细胞中的信号并随后引起生物学变化，例如肿瘤发生(8)。一般来说，STAT1被认为是一种肿瘤抑制因子(8)，但越来越多的证据表明过度激活的STAT1也可以作为肿瘤促进剂(12)。黑色素瘤中的STAT1敲低在体外和体内都显示出减缓迁移和侵袭潜力(69)。相反，免疫细胞中STAT1的激活活化对黑色素瘤的免疫反应(72)。

STAT3已在许多癌症类型(包括黑色素瘤)中得到广泛研究，并且已经涉及促成黑色素瘤存活和增殖中的信号传导途径的许多基因的调节(8,40)。人肿瘤中激活的STAT信号传导已被充分证明，并且近年来，研究人员正在开发靶向STAT3信号传导的分子和药理学策略以用于治疗干预。

我们的研究表明，在IFN-γ处理后，STAT1/3的表达水平和活性均增加，而其被使用MAC-3-190和HH044的共同处理消除。我们的数据表明nNOS-NO信号传导可能在IFN-γ激活的STAT1/3信号传导中发挥重要作用。靶向nNOS可能通过抑制参与黑色素瘤增殖和转移的IFN-γ激活的STAT1/3轴来有效阻止肿瘤进展。

我们的RPPA结果表明，IFN-γ处理诱导了黑色素瘤患者中与不良预后和疾病进展相关的基因例如PD-L1、c-Myc和HIF1α的表达(15,41,45,48)。值得注意的是，我们的数据表明IFN-γ对PD-L1的诱导是剂量依赖性的，表明可能涉及直接调节机制。近年来，越来越多的证据表明IFN-γ可能改变癌细胞的微环境，从而允许它们逃避免疫反应。这种作用可能部分是由NO对T淋巴细胞增殖的抑制所介导的(5,32,66,81)。

在癌细胞的表面表达的PD-L1与T细胞上的PD-1接合，随后触发T细胞受体(TCR)下游的抑制性信号传导(29,78)。近年来，越来越多的研究证明了IFN-γ通过上调PD-L1表达、促进免疫抑制微环境在黑色素瘤免疫中的关键作用(28,60)。加州大学洛杉矶分校(UCLA)的Ribas小组发现，PD-L1表达的调节是通过JAK1/2-STAT 1/3-IRF1轴进行的(28)。作为PD-L1表达的主要诱导剂(29,74)，在PD-L1⁺肿瘤和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的界面处检测到IFN-γ，表明TIL通过分泌驱动肿瘤PD-L1表达的细胞因子例如IFN-γ触发其自身的抑制作用(76)。最近的一项研究发现，由于与年轻患者相比，调节性T细胞(Treg)对细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的更多数量，老年黑色素瘤患者可能具有针对抗PD-1免疫疗法的更高反应率(42)。这表明具有抗增殖和抗炎特性的较高数量的Treg可能抑制CD8⁺CTL的活性和扩增(71)。尽管发现IFN-γ是一种增加CTL细胞毒性功能和运动性的CTL化学引诱剂(11)，但黑色素瘤细胞已经获得了劫持IFN-γ信号传导途径以上调PD-L1的能力，从而逃避免疫反应。一致地，我们的用CD8和PD-L1染色的异种移植肿瘤样品表明，黑色素瘤细胞在存在更多CD8+-TIL的区域中表现出更高的PD-L1表达水平。CD8⁺染色阴性的肿瘤区域中的PD-L1表达也随着IFN-γ处理而升高。我们的研究还表明，使用MAC-3-190的共同处理降低了异种移植肿瘤中IFN-γ可诱导的PD-L1的表达。我们研究中的一个限制是缺乏叉头盒P3(FoxP3)染色来确定Treg与CD8⁺CTL的比率，其目前正在进行中。

最近的一项机制研究表明，在人黑色素瘤细胞中，PD-L1表达主要受IFN-γ激活的JAK1/JAK2-STAT1/STAT2/STAT3-IRF1轴的调节(28)。在头颈癌研究中也定义了类似的机制(19)。响应于IFN-γ的PD-L1的这种适应性诱导代表了一种新机制，癌细胞试图通过该机制保护本身免受免疫细胞介导的杀伤(78)。最近的研究表明，IFN相关的JAK信号传导的功能丧失突变导致PD-L1阻断的获得性抵抗性，其中缺乏对IFN-γ诱导的PD-L1的反应(6,28,93)。因此，调节PD-L1的诱导的信号传导途径的详细了解可能有助于改善癌症的免疫疗法。

开发小分子来挽救癌症患者的免疫反应由于其许多优点已引起癌症研究人员越来越多的关注。与生物制剂不同，小分子更稳定，并且可以口服施用，并且由于其较小的尺寸，它们也可能提供在肿瘤微环境中细胞内暴露的前景。与小分子的生产、制备和药物递送相关的成本也较低，没有在接受生物制剂治疗的患者中观察到的严重的免疫相关不良事件(80)。已发现吲哚胺2.3-双加氧酶(IDO1)(一种负责将色氨酸氧化成犬尿氨酸的酶)在包括黑色素瘤在内的许多恶性肿瘤中过度表达。IDO1的阻断有效地恢复了IL-2的产生，导致在原位的T细胞直接重新激活(73)。将IDO1作为癌症免疫治疗的新治疗靶点，研究人员开发了许多高效和选择性的IDO1抑制剂。其中，epacadostat(一种可口服的IDO1药物抑制剂)在体外和体内均显示出潜在的免疫调节和抗肿瘤活性(89)。令人惊讶的是，将抗PD-1抗体Keytruda与epacadostat联合用于转移性黑色素瘤的一项密切关注的III期研究失败了，因为缺乏无进展生存期的显著改善，并且该药物组合可能无法延长总生存期。

我们的研究首次证明，nNOS抑制剂在体外和体内均有效抑制了IFN-γ可诱导的PD-L1。这些观察结果阐明了使用靶向nNOS的药物抑制剂来挽救黑色素瘤患者中PD-L1介导的免疫抑制。我们的研究结合越来越多的证据表明nNOS介导的NO信号传导在暴露于IFN-γ后在PD-L1的适应性表达中的重要作用，这为开发通过靶向nNOS-NO信号传导以用于人黑色素瘤的有效的PD-L1阻断疗法提供了一种新策略。与我们的体外观察结果一致，低剂量MAC-3-190(5mg/kg)治疗有效地减少了IFN-γ对肿瘤生长的诱导。值得注意的是，单独使用新合成的nNOS抑制剂HH044的治疗也显示出有希望的体内抗黑色素瘤活性。

综上所述，我们的研究表明，鉴于其新的作用机制，使用小分子抑制剂靶向nNOS-NO信号传导可能是用于黑色素瘤治疗的有效策略；不仅通过减少NO的产生来抑制nNOS刺激的黑色素瘤进展，而且还抑制IFN-γ激活的STAT 1/3和PD-L1。有了这些高选择性、生物可利用性和强效的抑制剂，我们的靶向nNOS-NO的创新方法将在未来几年内转化为临床环境时产生重大影响。

创新

我们的研究首次证明了nNOS在体外和体内在IFN-γ刺激的黑色素瘤进展中的重要作用，这阐明了使用药物抑制剂靶向nNOS作为改善黑色素瘤治疗的创新方法。我们的研究还证明了nNOS在调节IFN-γ可诱导的PD-L1中的重要作用，这表明靶向nNOS可以作为使用小的合成分子为黑色素瘤患者开发有效免疫疗法的新策略。

材料和方法

细胞系、化学品和试剂。人黑色素瘤细胞系A375、WM115和Sk-mel-28获自美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas,VA)，而WM3211获自Rockland Immunochemicals(Limerick,PA)。细胞系在含有10％胎牛血清(FBS；#26140079；Gibco，Waltham，MA)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM；#11995073；Gibco，Waltham，MA)(A375)或Eagle极限必需培养基(EMEM)(WM115，Sk-mel-28)、或含有2％FBS的肿瘤专用培养基(WM3211)中培养。IFN-γ购自Invitrogen(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)，而IFN-α购自PBL AssayScience(Piscataway,NJ)。

抗体。小鼠单克隆抗人NOS1、STAT3、p-STAT3、核纤层蛋白A/C(sc-17825；sc-8019；sc-8059；sc-398927；Santa Cruz Biotechnology,Dallas,TX)和小鼠单克隆抗人β-肌动蛋白(8H10D10；Cell Signaling Technology,Danvers,MA)抗体用作一抗；辣根过氧化物酶标记的抗小鼠(1:5,000；Cell Signaling Technology,Danvers,MA)用作二抗。与AlexaFluor 488缀合的兔单克隆PD-L1(25048,Cell Signaling Technology,Danvers,MA)用于通过流式细胞术和免疫荧光进行细胞外表达分析。

蛋白质分离和蛋白质印迹。除非另有说明，否则所有样品均保持在4℃。通过将细胞悬浮液在具有1％蛋白酶抑制剂混合物(PIC)的1×裂解缓冲液(9803S；Cell Signaling，Danvers，MA)中孵育15分钟，然后以40％振幅在15秒开和15秒关的情况下超声处理1分钟进行裂解来收集全细胞裂解物。在4℃下以14,000g^-1离心10分钟分离蛋白质样品。

细胞核和细胞质蛋白提取在别处有描述(84)。通过离心收集细胞并重新悬浮在含有1％PIC的缓冲液A(10mM HEPES,pH 7.9,10mM KCl,0.150mM MgCl₂,0.5mM DTT,0.2mMPMSF)中，并允许其膨胀10分钟。加入10％NP-40并涡旋以裂解细胞。样品以14,000g^-1离心30秒以分离细胞质级分。将沉淀的细胞核重新悬浮并在含有1％PIC的缓冲液C(20mM HEPES、20％甘油、0.42M NaCl、0.15mM MgCl₂、0.2mM EDTA、0.5mM DTT和0.2mM PMSF)中孵育，然后以14,000g^-1离心30分钟以去除细胞碎片。然后加入缓冲液D(20mM HEPES、20％甘油、50mMKCl、0.5mM EDTA、0.5mM DTT和0.2mM PMSF)以稀释细胞核样品。

将通过Bradford测定法检测到的等量蛋白质上样并在7.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后转移至Immobilon-P^SQ聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(ISEQ00010；Merck KGaA,Darmstadt,Germany)。使用10％脱脂牛奶(NOS1、STAT1/2、肌动蛋白、核纤层蛋白A/C)或5％牛血清白蛋白(BSA；SH3057402；Fisher Scientific,Waltham,MA)(p-STAT1/3)封闭膜，然后用一抗在室温下孵育1小时或在4℃下过夜，然后按照制造商的建议在室温下用二抗孵育1小时。每次抗体孵育后，用TBS-T彻底清洗印迹。使用SuperSignal辣根过氧化物酶化学发光试剂(1859674；1859675；Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)检测标记的条带，并使用Bio-Rad ChemiDoc XRS⁺系统捕获和分析图像。

反相蛋白质阵列。铺板的细胞用250单位/mL的IFN-α或IFN-γ处理72小时。用1×PBS洗涤后，将裂解缓冲液(1％Triton X-100、50mM HEPES、pH7.4、150mM NaCl、1.5mMMgCl₂、1mM EGTA、100mM NaF、10mM焦磷酸钠、1mM Na₃VO₄、10％甘油和1％PIC)加入板中，然后在偶尔摇动的情况下在冰上孵育20分钟。然后通过刮擦收集样品，并在4℃下以14,000g^-1离心10分钟。然后通过Bradford法对蛋白质浓度进行定量，并用裂解缓冲液将其调节至1.5μg/μL。然后将细胞裂解物与4×SDS样品缓冲液(40％甘油、8％SDS、0.25M Tris-HCl，pH6.8，具有10％BME)混合。然后将微量的连续稀释的蛋白质样品点样在硝酸纤维素包被的载玻片上，并用经过验证的一抗和生物素缀合的二抗进行探测。使用Dako-Cytomation-催化的系统(Dako)放大信号并通过二氨基联苯胺(DAB)比色反应可视化。稀释曲线用Supercurve Fitting拟合，并将蛋白质表达针对蛋白质上样进行标准化。

通过流式细胞术检测的PD-L1的表达水平。在有或没有3μM nNOS抑制剂的情况下用IFN-α或IFN-γ处理铺板的细胞72小时。通过离心收集处理的细胞，并使用在1×PBS中的4％甲醛在37℃下固定10分钟。然后用孵育缓冲液(1×PBS中的0.5％BSA)洗涤细胞，然后在室温下用PD-L1抗体(1:100稀释)在黑暗中孵育2小时。测量并记录平均荧光强度(MFI)以供分析。

通过免疫荧光检测的PD-L1的表达水平。将A375细胞铺在盖玻片上，并在3μM的nNOS抑制剂的存在或不存在的情况下，与250单位/mL的IFN-α或IFN-γ一起孵育72小时。处理后，盖玻片上的细胞在室温下用4％甲醛/PBS固定15分钟，然后与冰冷的100％甲醇在-20℃下孵育10分钟。然后将样品在封闭缓冲液(1×PBS、5％马血清、0.3％Triton X-100)中孵育60分钟，然后在稀释缓冲液(1×PBS、1％BSA、0.3％Triton X-100)中的1:50PD-L1抗体稀释液中在4℃下孵育过夜。染色的标本用PBS冲洗，然后用DAPI荧光染色试剂在黑暗中固化1小时。使用BZ-X700显微镜(Keyence,Itasca,IL)观察和记录载玻片。

细胞内一氧化氮水平的检测。96孔板中的培养细胞用100单位/mL的IFN-α或IFN-γ处理48小时。培养期结束时立即去除培养基并用Hank平衡盐溶液(HBSS)替换。将1μM的4-氨基-5-甲氨基-2',7'-二氟荧光素(DAF-FM)探针添加到每个条件中，并使用荧光酶标仪分别使用485和538nm的激发和发射波长检测DAF-FM产生的荧光水平。

nNOSshRNA敲低。使用GIPZ慢病毒nNOS shRNAmir(Dharmacon,Lafayette,CO)和对照shRNA实现了nNOS的敲低。使用lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)将shRNA引入细胞。通过超过7天的嘌呤霉素孵育选择携带有缺陷的nNOS的稳定细胞，并且通过蛋白质印迹证实了nNOS表达的敲低。

体内异种移植黑色素瘤。所有动物程序均获得查普曼大学(Chapman University)机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)的批准。裸鼠(Nu/Nu)购自Charles River(Wilmington,MA)，并在无病原体条件下饲养和维持在查普曼大学动物饲养场中。将人A375转移性黑色素瘤细胞悬浮在冷Matrigel(354248；Corning,Corning,NY)中并皮下注射到小鼠的侧腹(每只小鼠1×10⁶个细胞)以建立肿瘤。小鼠用生理盐水或有或没有MAC-3-190(5mg/kg/天)的IFN-γ(1000单位/小鼠)的腹膜内注射处理21天。每周监测肿瘤生长3次，并使用数字游标卡尺测量。肿瘤生长计算为肿瘤体积(mm³)＝[长度×(宽度²)]/2。21天后处死小鼠，取出肿瘤异种移植物和肺并称重。将肿瘤异种移植物的一半在10％福尔马林溶液中固定，并将另一半进行处理以用于流式细胞术。然后将固定的样品进一步包埋在石蜡中以用于切片，并使用Ventana Benchmark Ultra机器用特异性抗体染色以可视化PD-L1的表达(790-4905；Ventana,Oro Valley,AZ)和CD8⁺ T细胞(108M-98；Cell Marque,Rocklin,CA)。使用ImageJ(https://imagej.nih.gov/ij/index.html)计数PD-L1染色的阳性细胞的百分比。按照用于软肿瘤的标准方案，使用来自Miltenyi Biotec(130-095-929；Auburn,CA)的gentleMACS分离器将用于流式细胞术的异种移植肿瘤样品分离成单细胞悬液。然后如上所述固定单细胞悬液并用PD-L1抗体染色。

统计分析。所有实验均在至少两种不同的人黑色素瘤细胞系中进行。显示的数据是来自代表至少两个独立实验的平均值±SD。使用Student t-检验进行统计分析，并且小于0.05的p值被认为具有统计学意义。

缩写

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实施例2-HH044:抗黑色素瘤活性和体内药物生物分布检测和成像

方法

HH044的体内抗黑色素瘤活性

1)肿瘤生长和HH044处理：雌性无胸腺裸鼠(4-6周龄，Nu/Nu 088纯合子)购自Charles River(Wilmington,MA)。动物研究是在查普曼大学(Irvine,CA)的机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准下进行的。给小鼠皮下注射在50％Matrigel基底膜基质(CB354248,Corning,Corning,NY)的200μL溶液中的1×10⁶个A375人黑色素瘤细胞。三天后，小鼠被随机分配到不同的实验处理组。与媒介物处理的对照相比，nNOS抑制剂HH044每天一次腹膜内注射，持续21天(20mg/kg)。每周两次测量体重和肿瘤大小直到研究结束。

2)A375黑色素瘤异种移植物中的PD-L1表达水平：在研究结束时，使用来自Miltenyi Biotec的GentleMACS分离器(130-095-929；Auburn,CA)按照用于软肿瘤的标准方案通过解离为单细胞悬液将异种移植肿瘤样品的一部分处理用于流式细胞术。然后收集单细胞悬液并使用在1×PBS中的4％甲醛在37℃固定10分钟。然后用孵育缓冲液(1×PBS中的0.5％BSA)洗涤细胞，然后在室温下用PD-L1抗体(1:100稀释)在黑暗中孵育2小时。测量并记录平均荧光强度(MFI)以供分析。

体内生物分布检测

1)从组织样品中分离化合物：通过腹膜内注射施用盐水或20mg/kg/天的剂量的HH044(每组n＝6)，持续4周。然后收集肿瘤和器官并称重。向每100mg组织加入300μLMilli-Q水，然后手动匀浆。然后通过涡旋将匀浆物与等体积的乙腈混合，然后在4℃下以2500g^-1离心4分钟。向收集的上清液加入1mL Milli-Q水，然后加入6mL氯仿和异丙醇(比例为1:1)的混合物以用于萃取。将混合物通过涡旋混合并在4℃下以2500g^-1离心5分钟。使用Speedvac进一步浓缩收集的有机层以蒸发溶剂。将干燥的样品重新溶解在甲醇中，并使用MALDI-TOF确定化合物的存在。

2)液相色谱-质谱(LC-MS)：通过MALDI-TOF测定的含有HH044的样品通过LC-MS进一步分析。使用1μM已知浓度的内标来确定HH044的浓度。使用Shimadzu HPLC-MS2020系统(Shimadzu MS Technologies，Japan)在Shimadzu Premier C18色谱柱(3.0μm，4.6×100mm)上进行色谱分离。使用由0.05％甲酸水溶液和乙腈组成的流动相，以0.4mL/min的流速洗脱20μL的每个样品。流动相中乙腈的比例优化如下：0-3min，15％；3-15min，55％；15-18min，100％；18-23min，5％。质谱在以正离子模式运行的具有ESI接口的Shimadzu 2020质谱仪上进行。将组织中HH044的测定的浓度按样品重量标准化[1]。

体内药物分布成像研究

a)VivoTag 680XL标记的HH044的合成：如我们的合成方案(图10)所示，首先，我们将β-丙氨酸作为具有伯胺的接头附接到HH044(1)。将β-丙氨酸(1.2mg，0.0065mmole，1.2当量)和HATU(2.48mg，0.0065mmole，1.2当量)的混合物溶解在200μl无水DMF中。在溶解于200μL无水DMF后，将二异丙基乙胺(5.6μl，0.033mmole，6当量)加入到HH044(1)(2.5mg，0.00544mmole)的溶液中。将反应混合物在室温搅拌2小时。然后将15mL二乙醚加入到反应混合物中以沉淀产物。将沉淀的化合物溶解在H₂O/乙腈中，并使用水/乙腈作为梯度溶剂通过HPLC纯化。末端NH₂受Boc保护的HH044-β-丙氨酸以47分钟的保留时间洗脱。使用甲醇中的3M HCl在搅拌2小时的情况下从β-丙氨酸接头除去Boc保护基团。然后蒸发溶剂，将化合物重新溶解在50μL甲醇中，然后加入15mL无水冷二乙醚以沉淀化合物2。分子式为[C₂₈H₃₀N₆OS₂]的化合物2(HH044-β-丙氨酸)的MALDI-TOF(m/z)计算为530.1923，质量为531.1438[M+H]。

接下来，我们将体内荧光标签VivoTag 680XL与HH044-β-丙氨酸缀合。将带有游离β-氨基的HH044-β-丙氨酸(2)(71μg，0.135μmole)溶解在含有5μL DIPEA作为碱催化剂的100μL无水DMF中。然后，将溶解在100μL无水DMF中的VivoTag 680XL(250μg,0.0.135μmole)溶液加入到化合物2的溶液中。将混合物在室温下搅拌2小时。反应完成后，加入冷二乙醚以沉淀出VivoTag标记的HH044-β-丙氨酸(化合物3)，其用冷二乙醚洗涤3次，真空干燥以用于进一步成像研究。

b)体内和体外成像：通过尾静脉将4μg的Vivotag 680标记的HH044注射到小鼠中。然后使用IVIS Spectrum成像系统(PerkinElmer,Waltham,MA)在不同的时间间隔对动物进行扫描。为了扫描从Vivotag 680标记的HH044产生的体内荧光，在自动定时下使用分别在675和720nm的激发和发射波长下的中等分档(medium binning)和F/stop2对小鼠进行成像。

对于离体荧光成像，在静脉内注射后的规定时间间隔(0、2和4小时)，对动物实施安乐死；切下异种移植肿瘤、脑、肝、肺、肾、脾和心脏，并用生理盐水简单清洗。然后使用IVIS Spectrum成像系统在自动定时下使用分别在675和720nm的激发和发射波长下的中等分档和F/stop2对收集的器官进行成像。

结果

在处理结束时，对身体、肿瘤和主要器官(肺、肝和肾)进行称重。在用20mg/kg/天的HH044处理21天的小鼠中，最终肿瘤重量减少到对照的61％，肺、肝和肾重量没有显著变化(图9A-B)。鉴于我们初步研究的较小样品量(n＝5)，处理组和对照组之间肿瘤重量的差异无统计学意义(p＝0.054)。在整个研究期间没有观察到显著的全身毒性。在接受HH044处理的小鼠中观察到体重略有下降(22.6g相对照组的23.9g)，但这种下降<10％且没有统计学意义(p>0.05)。

如图9C所示，对从A375黑色素瘤异种移植物收集的细胞悬液的分析表明，HH044处理后肿瘤中PD-L1表达水平显著降低至对照组的76％(p<0.05，n＝5)。

为了进一步确定HH044的体内分布，从不同器官(包括肿瘤异种移植物、肝、脑和肾)收集样品。进行MALDI-TOF分析，这证实了在肿瘤(图10E)、肝和肾(数据未显示)中观察到的HH044的存在。使用LC-MS进一步分析这些样品。由内部对照(1μM)和曲线下面积计算的估计HH044水平显示，HH044在肿瘤异种移植物中的浓度达到0.88μM，其是其nNOS抑制的Ki值(0.005μM)的170倍以上(图10D)。这些数据表明HH044可以在肿瘤中达到足够的水平以有效抑制体内nNOS活性。LC-MS分析还表明，腹膜内施用后24小时，肝和肾中的化合物的浓度分别为3.95和6.00μM，这表明HH044可能通过肝和肾途径代谢和消除。

如图10B和10C所示，我们还使用IVIS成像系统研究了HH044在异种移植A375黑色素瘤肿瘤的活Nu/Nu小鼠中的体内分布。我们的结果表明，标记的HH044在10分钟内迅速分布到异种移植肿瘤，其在静脉内(IV)施用后多至4小时仍然可见。切除肿瘤和器官后的离体成像证实了类似的模式。在施用后2小时，该化合物主要位于肿瘤中，并且在肾脏和肝脏中也可见，但程度较轻。到4小时时，该化合物仍在肿瘤和肝脏中被观察到，而主要在肾脏中可见。肝脏和肾脏中药物的持续的增加的存在表明药物代谢和消除主要由这两个器官进行。值得注意的是，体内和体外成像研究都表明，在任何被检查的脑中都没有观察到药物，表明缺乏血脑屏障渗透。

在前面的描述中，本领域技术人员将容易明白，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对本文公开的发明进行各种替换和修改。本文举例说明性描述的本发明可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个元素、限制的情况下适当地实施。已使用的术语和表述被用作描述性术语而非限制，并且在使用此类术语和表述时无意排除所示出和描述的特征或其部分的任何等效物，但应认识到在本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，虽然本发明已经通过特定实施方案和可选特征进行了举例说明，但是本领域技术人员可以对本文公开的概念进行修改和/或变化，并且考虑这样的修改和变化在本发明的范围内。

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