包括胺的聚合酶链反应组合物
阅读说明：本技术 包括胺的聚合酶链反应组合物 (Polymerase chain reaction compositions comprising amines ) 是由 K·马特乔赛蒂斯 R·利姆库斯 L·瓦纳加斯 R·苏卡克凯特 S·瓦林斯盖特 E·艾利乔修 于 2018-12-20 设计创作，主要内容包括：描述了用于核酸合成的包括胺的组合物、方法和试剂盒。在一些实施例中,胺提高核酸合成产物的产量或对核酸合成抑制剂的耐受度。(Compositions, methods, and kits for nucleic acid synthesis including amines are described. In some embodiments, the amine increases the yield of the nucleic acid synthesis product or tolerance to the nucleic acid synthesis inhibitor.)
序列表
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技术领域
本申请涉及用于合成核酸的组合物和方法的领域。
背景技术
嗜热性DNA聚合酶通常用于生物技术和分子生物学应用中，包含核酸合成技术，如扩增(例如，PCR)，所述核酸合成技术涉及交替变性和引物退火和延伸的循环。嗜热性DNA聚合酶具有抗高温失活的能力，因此可与热变性步骤兼容。扩增产量取决于嗜热性DNA聚合酶的性能参数，如合成速度、持续合成能力和热稳定性。
核酸合成抑制剂可以降低PCR产量或在以更高的浓度存在的情况下完全消除扩增。PCR抑制剂可能存在于原始样品(如血液、织物、组织和土壤)中，和/或可能由于样品处理和核酸提取步骤而被添加(参见Schrader等人,《应用微生物学杂志(Journal ofApplied Microbiology)》113:1014-1026(2012)和Alaeddini《国际法医学：遗传学(Forensic Science International:Genetics)》6:297-305(2012))。常见的核酸合成抑制剂的实例包含：聚阴离子，如肝素或木聚糖；离液剂，如十二烷基硫酸钠或尿素；某些有机化合物，如腐殖酸或胆汁盐；不同的蛋白质，如胶原蛋白、血红素和含血红素的蛋白质；金属离子，如钙；螯合剂，如柠檬酸盐或EDTA；有机溶剂，如乙醇或异丙醇；核酸嵌入染料；等等。在存在磁珠的情况下，核酸合成反应可能被抑制。对PCR抑制剂的耐受度提高，减少了对另外的纯化步骤和其它样品处理步骤的需要，减少了不满意的合成反应的出现频率，并拓宽了可以被成功扩增的样品的范围。
某些嗜热性DNA聚合酶可以显示出比其它野生型酶更高的抑制剂耐受度。通过蛋白质工程可以进一步增加对PCR抑制剂的耐受度。通过点诱变(US20130034879A1，US20170204384A1)和N端缺失(Kermekchiev等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res)》37(5):e40(2009))获得了具有增加的抑制剂耐受度的嗜热性DNA聚合酶变体。某些人工DNA聚合酶包括融合的非特异性双链DNA(dsDNA)结合结构域。就抑制剂耐受度而言，所述结构域的存在改善了酶的性能(US20040002076A1)。改善抑制剂耐受度的另一种策略基于蛋白质添加剂。已知牛血清白蛋白(BSA)、gp32或明胶可作为清除剂，所述清除剂可减轻PCR的抑制作用(Kreader《应用与环境微生物学(Appl Environ Microbiol)》62(3):1102–1106(1996)和US20120244527A1)。即使当使用具有增加的抑制剂耐受度的聚合酶时，可能仍需要另外的抑制剂耐受度。
本文提供了化合物，当在与DNA聚合酶或RNA聚合酶的反应组合物中使用时，所述化合物可增加对核酸合成反应抑制剂的耐受度。
发明内容
本文描述了用于合成核酸的包括胺的组合物和试剂盒。进一步地，描述了使用方法，其中胺提高核酸合成产物的产量和/或对核酸合成抑制剂的耐受度。这些胺可以提高对样品中固有存在的抑制剂或在上游处理步骤中添加的抑制剂的耐受度。
根据说明书，在核酸模板的核酸合成期间提高核酸合成产物的产量和/或对抑制剂的耐受度的方法包括将包括所述核酸模板的样品与包括一种或多种式I的胺或其盐的组合物混合：
其中R1为H；R2选自烷基、烯基、炔基或(CH2)n-R5，其中n＝1到3，并且R5为芳基、氨基、硫羟(thiol)、硫醇(mercaptan)、磷酸酯、羟基或烷氧基；并且R3和R4可以是相同或不同的，并且独立地选自H或烷基，条件是如果R2为(CH2)n-R5，则R3和/或R4中的至少一个为烷基；提供用于合成核酸分子的酶；以及在适于合成与全部或部分所述模板互补的核酸分子的条件下孵育所述混合物。
还呈现了一种用于合成核酸分子的试剂盒，其中所述试剂盒提供增加的产量或对抑制剂的耐受度，所述试剂盒包括(i)一种或多种用于合成核酸分子的酶或用于提供一种或多种用于合成核酸分子的酶的说明，以及(ii)一种或多种式I的胺：
或其盐，其中R1为H；R2选自烷基、烯基、炔基或(CH2)n-R5，其中n＝1到3，并且R5为芳基、氨基、硫羟、硫醇、磷酸酯、羟基或烷氧基；并且R3和R4可以是相同或不同的，并且独立地选自H或烷基，条件是如果R2为(CH2)n-R5，则R3和/或R4中的至少一个为烷基。
还呈现了一种用于提高核酸合成产物的产量或对核酸合成抑制剂的耐受度的组合物，其包括一种或多种用于合成核酸分子的酶和一种或多种式I的胺：
或其盐，其中R1为H；R2选自烷基、烯基、炔基或(CH2)n-R5，其中n＝1到3，并且R5为芳基、氨基、硫羟、硫醇、磷酸酯、羟基或烷氧基；并且R3和R4可以是相同或不同的，并且独立地选自H或烷基，条件是如果R2为(CH2)n-R5，则R3和/或R4中的至少一个为烷基。
在一些实施例中，以单个组合物形式提供所述一种或多种式I的胺和所述一种或多种用于合成核酸分子的酶。
在一些实施例中，以单独的组合物形式提供所述一种或多种式I的胺和所述一种或多种用于合成核酸分子的酶。
在一些实施例中，同时提供所述一种或多种式I的胺和所述一种或多种用于合成核酸分子的酶。
在一些实施例中，所述合成用于扩增。
在一些实施例中，所述一种或多种式I的胺和/或所述一种或多种用于合成核酸分子的酶处于可长期保存的稳定调配物中。
在一些实施例中，所述一种或多种式I的胺和/或所述一种或多种用于合成核酸分子的酶通过包括稳定剂和/或去污剂的调配物来提供。
在一些实施例中，所述样品包括一种或多种核酸合成抑制剂。
在一些实施例中，所述核酸合成抑制剂是聚阴离子。在一些实施例中，所述聚阴离子是肝素或木聚糖。
在一些实施例中，所述核酸合成抑制剂是离液剂。在一些实施例中，所述离液剂是十二烷基硫酸钠或尿素。
在一些实施例中，所述核酸合成抑制剂是蛋白质。在一些实施例中，所述抑制剂是胶原蛋白、血红素或含血红素的蛋白质。
在一些实施例中，所述核酸合成抑制剂是有机化合物。在一些实施例中，所述抑制剂是腐殖酸或胆汁盐。
在一些实施例中，所述核酸合成抑制剂是螯合剂。在一些实施例中，所述螯合剂是柠檬酸盐或EDTA。
在一些实施例中，所述核酸合成抑制剂是有机溶剂。在一些实施例中，所述溶剂是乙醇或异丙醇。
在一些实施例中，所述核酸合成抑制剂是核酸嵌入染料。
在一些实施方案中，在存在微载体的情况下进行所述核酸合成。微载体可以是磁性的，即包括响应磁场的材料，如但不限于铁磁性材料、顺磁性材料和超磁性材料。示例性的磁性微载体是磁珠。在一些实施例中，珠是羧化的磁珠。在一些实施例中，所述羧化磁珠是XP(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter,Inc))、Sera-MagTMSpeedBeadsTM(GE医疗生命科学公司(GE Healthcare Life Sciences))、MyOne羧化珠(DynaBeads)或RXNPure(欧米茄生物科技公司(Omega Bio-tek,Inc))珠。在一些实施例中，在先前的纯化步骤中使用存在于所述样品中的磁珠。
在一些实施例中，所述核酸合成抑制剂是金属离子。在一些实施例中，所述金属离子是钙。
在一些实施例中，所述组合物或试剂盒进一步包括一种或多种另外的组分，所述一种或多种另外的组分选自：(i)一种或多种核酸分子；(ii)一种或多种核苷酸；(iii)一种或多种缓冲盐；和(iv)一种或多种辅助因子。
在一些实施例中，所述一种或多种核酸分子包括RNA或DNA。在一些实施例中，所述RNA或DNA包括用于合成反应的引物。
在一些实施例中，所述一种或多种核苷酸包括dNTP或NTP。在一些实施例中，所述一种或多种缓冲盐包括乙酸盐、硫酸盐、盐酸盐或磷酸盐或三-(羟甲基)氨基甲烷的游离酸形式。在一些实施例中，所述一种或多种辅助因子包括镁盐。
在一些实施例中，所述组合物或试剂盒进一步包括一种或多种另外的添加剂。在一些实施例中，所述另外的添加剂包括盐。在一些实施例中，所述另外的盐包括钾盐。在一些实施例中，所述钾盐包括氯化钾(KCl)。在一些实施例中，可以基于胺的存在降低所述组合物的KCl浓度或可以省略KCl。
在一些实施例中，所述另外的添加剂包括去污剂。在一些实施例中，所述去污剂包括Hecameg(6-0-(N-庚基氨基甲酰基)-甲基-a-D-吡喃葡萄糖苷)、Triton X-200、Brij-58、CHAPS、正十二烷基-b-D-麦芽糖苷、NP-40、十二烷基硫酸钠(SDS)、X-15、X-35、X-45、X-100、X-102、X-l14、X-165、X-305、X-405、X-705、20和/或
在一些实施例中，所述另外的添加剂包括至少一种蛋白质稳定剂。在一些实施例中，所述蛋白质稳定剂包括牛血清白蛋白(BSA)、非活性聚合酶或脱铁转铁蛋白。
在一些实施例中，所述另外的添加剂包括至少一种还原剂。在一些实施例中，所述还原剂包括二硫苏糖醇(DTT)。
在一些实施例中，所述另外的添加剂包括增强高GC含量模板的核酸合成的试剂。在一些实施例中，所述高GC含量约为65％或更高。在一些实施例中，所述增强高GC含量模板的核酸合成的试剂包括乙二醇、聚乙二醇、1,2-丙二醇、硫酸铵、二甲基亚砜(DMSO)、甘油、甲酰胺、7-脱氮-GTP、乙酰胺或甜菜碱。
在一些实施例中，所述另外的添加剂包括染料。在一些实施例中，所述染料包括二甲苯腈FF、酒石黄、苯酚红、喹啉黄、亮蓝、漆蓝、靛蓝胭脂红、酸红1、间甲酚紫、菜红、甲酚红、中性红、溴甲酚绿、酸紫5、溴酚蓝或橙G。
在一些实施例中，所述另外的添加剂包括甘油、海藻糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇或山梨糖醇。
在一些实施例中，所述组合物包括热启动组合物。
在一些实施例中，所述一种或多种用于合成核酸的酶选自DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶。在一些实施例中，所述DNA聚合酶包括Phi29或其衍生物、Bsm、Bst、T4、T7、DNAPol I或Klenow片段；或其突变体、变体和衍生物。
在某些实施例中，聚合酶包括A、B、C、D、X或Y聚合酶的具有聚合酶活性的片段或变体。在某些实施例中，聚合酶包括A族DNA聚合酶，或其具有聚合酶活性的片段或变体。在某些此类实施例中，所述A族聚合酶是细菌性A族聚合酶，如来自芽孢杆菌属、栖热菌属、红栖热菌属(Rhodothermus)或热袍菌属的聚合酶。所述A族聚合酶可以是嗜热的。在某些此类实施例中，所述A族聚合酶是Taq DNA聚合酶(UniProtKB：P19821)或其具有聚合酶活性的片段或变体。在某些实施例中，Taq DNA聚合酶的变体包括与Taq DNA聚合酶具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。Taq DNA聚合酶的示例性变体描述于以下文献中：例如US9493848B2；美国专利第6,395,524号；美国专利第6,602,695号；美国专利第5,614,365号；美国专利第5,466,591号；Brandis等人,1998；Barnes和Kermekchiev,2000；Kermekchiev和Barnes,2004；Kermekchiev和Kirilova,2006；Kermekchiev等人,2009；Zhang等人,2010。
在某些实施例中，聚合酶包括B族DNA聚合酶或其具有聚合酶活性的片段或变体。在某些此类实施例中，所述B族聚合酶是古细菌B族聚合酶，如来自栖热球菌属、热球菌属(Pyrococous)或热棒菌属(Pyrobaculum)的聚合酶。此类聚合酶是嗜热的。在某些此类实施例中，所述B族聚合酶是Pfu DNA聚合酶(UniProtKB：P61875)或其具有聚合酶活性的片段或变体。在某些实施例中，Pfu DNA聚合酶或Pfu样聚合酶的变体包括与Pfu DNA聚合酶具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述DNA聚合酶包括嗜热性DNA聚合酶。在一些实施例中，所述嗜热性DNA聚合酶包括Taq、Tbr、Tfl、Tth、Tli、Tfi、Tne、Tma、Pfu、Pwo、Kod、VENTTM、DEEPVENTTMDNA聚合酶；Phusion DNA聚合酶(US7560260B2、US8415129B2、US6228628B1)；Phusion U DNA聚合酶；SuperFi DNA聚合酶；SuperFi U DNA聚合酶(如62/524,730；US20170204384A1中所述)或其突变体、变体和衍生物；和/或GoTaq G2热启动聚合酶(Promega)、热启动DNA聚合酶(NEB)、TaKaRa TaqTMDNA聚合酶热启动(TaKaRa)、KAPA2G稳健的热启动DNA聚合酶(KAPA)、快速启动Taq DNA聚合酶(Roche)、热启动Taq DNA聚合酶(Qiagen)、Q5 DNA聚合酶、Kapa HiFi DNA聚合酶、PrimeStar Max DNA聚合酶、PrimeStar GXL DNA聚合酶。
在一些实施例中，所述DNA聚合酶包括嵌合DNA聚合酶。在一些实施例中，所述嵌合DNA聚合酶包括序列非特异性双链DNA(dsDNA)结合结构域。例如，所述嵌合DNA聚合酶包括与序列非特异性双链DNA(dsDNA)结合结构域融合的Pfu样聚合酶，其中所述Pfu样聚合酶与Pfu DNA聚合酶具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。示例性聚合酶是Phusion DNA聚合酶；Phusion U DNA聚合酶；SuperFi DNA聚合酶；SuperFi U DNA聚合酶；Q5 DNA聚合酶。在一些实施例中，所述dsDNA结合结构域包括：来自硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的Sso7d；来自嗜酸热硫化叶菌(S.acidocaldarius)的Sac7d、Sac7a、Sac7b和Sac7e；以及来自芝田硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)的Ssh7a和Ssh7b；Pae3192；Pae0384；Ape3192；HMf家族古细菌组蛋白结构域；或古细菌增殖细胞核抗原(PCNA)同系物。
在一些实施例中，所述RNA聚合酶包括SP6、T7或T3 RNA聚合酶或其突变体、变体或衍生物。
在一些实施例中，所述逆转录酶包括M-MLV逆转录酶、RSV逆转录酶、AMV逆转录酶、RAV逆转录酶、MAV逆转录酶、HIV逆转录酶和/或其突变体、变体和衍生物；和/或SuperScript II逆转录酶、SuperScript III逆转录酶、SuperScript IV逆转录酶、Maxima逆转录酶、GoScript逆转录酶、PrimeScript逆转录酶、iScript逆转录酶、Sensiscript逆转录酶、ProtoScript逆转录酶、AffinityScript逆转录酶、NxtScript逆转录酶、RnaUsScript逆转录酶、RocketScript逆转录酶、GoScript逆转录酶和/或Thermoscript逆转录酶
在一些实施例中，所述方法用于聚合酶链反应(PCR)。
在一些实施例中，R2为烷基。在一些实施例中，所述烷基是C1-C5(支链或直链)烷基。在一些实施例中，所述烷基是C1-C3烷基。在一些实施例中，所述烷基是甲基。
在一些实施例中，R3和/或R4是H。
在一些实施例中，R3和/或R4是烷基。在一些实施例中，所述烷基是C1-C5(支链或直链)烷基。在一些实施例中，所述烷基是C1-C3烷基。在一些实施例中，所述烷基是甲基。
在一些实施例中，所述组合物或试剂盒包括所述一种或多种式I的胺的盐形式。在一些实施例中，所述盐形式包括氯化物盐、硫酸盐或乙酸盐。
在一些实施例中，所述组合物或试剂盒包括一种式I的胺或其盐。
在一些实施例中，所述组合物或试剂盒包括至少两种式I的胺或其盐。
在一些实施例中，所述组合物或试剂盒包括至少三种式I的胺或其盐。
在一些实施例中，所述组合物或试剂盒包括至少四种式I的胺或其盐。
在一些实施例中，所述一种或多种胺的浓度为10-250mM。在一些实施例中，所述一种或多种胺的浓度为50-110mM。
在一些实施例中，至少一种式I的胺包括二甲胺盐酸盐。在一些实施例中，二甲胺盐酸盐的浓度为10-250mM。在一些实施例中，二甲胺盐酸盐的浓度为50-110mM。
在一些实施例中，至少一种式I的胺包括二乙胺盐酸盐。在一些实施例中，二乙胺盐酸盐的浓度为10-250mM。在一些实施例中，二乙胺盐酸盐的浓度为50-110mM。
在一些实施例中，至少一种式I的胺包括二异丙胺盐酸盐。在一些实施例中，二异丙胺盐酸盐的浓度为10-250mM。在一些实施例中，二异丙胺盐酸盐的浓度为50-110mM。
在一些实施例中，至少一种式I的胺包括乙基(甲基)胺盐酸盐。在一些实施例中，乙基(甲基)胺盐酸盐的浓度为10-250mM。在一些实施例中，乙基(甲基)胺盐酸盐的浓度为50-110mM。
在一些实施例中，至少一种式I的胺包括三甲胺盐酸盐。在一些实施例中，三甲胺盐酸盐的浓度为10-250mM。在一些实施例中，三甲胺盐酸盐的浓度为50-110mM。
在一些实施例中，与在相似的反应条件下(但没有胺)进行的反应中获得的产物的量相比，核酸合成产物的产量增加了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。基于盐形式的胺的存在，可以减少其它盐的量。
在一些实施例中，与在相似的反应条件下(但没有胺)进行的反应中获得的产物的量相比，对核酸合成抑制剂的耐受度增加了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。基于盐形式的胺的存在可以减少其它盐的量。
另外的目的和优势将在下面的描述中进行部分阐述，并且有些目的和优势将通过描述而变得明显，或可以通过实践而被了解。将借助于所附权利要求中特别指出的元素和组合来实现和获得所述目的和优势。
应当理解，前述一般描述和下面的详细描述都仅为示例性的和解释性的，并且不限制权利要求。
并入本说明书中并且构成本说明书的一部分的附图示出一个(几个)实施例，并且与描述一起用于解释本文所述的原理。
附图说明
图1示出了在存在0ng/μl、19ng/μl、39ng/μl、77ng/μl或154ng/μl木聚糖的情况下，嗜热性Taq DNA聚合酶对来自人类基因组DNA的727碱基对(bp)片段的扩增。抑制剂浓度由图顶部的三角形表示，样品中木聚糖的浓度从0ng/μL到154ng/μL从左到右递增。PCR缓冲液含有0mM二乙胺盐酸盐(缓冲液1)、10mM二乙胺盐酸盐(缓冲液2)、40mM二乙胺盐酸盐(缓冲液3)或50mM二乙胺盐酸盐(缓冲液4)。
图2示出了在存在0ng/μl、19ng/μl、39ng/μl、77ng/μl或154ng/μl木聚糖的情况下，嗜热性Taq DNA聚合酶对来自人类基因组DNA的727bp片段的扩增。抑制剂浓度由图顶部的三角形表示，样品中木聚糖的浓度从0ng/μL到154ng/μL从左到右递增。PCR缓冲液含有0mM二异丙胺盐酸盐(缓冲液1)、10mM二异丙胺盐酸盐(缓冲液2)、40mM二异丙胺盐酸盐(缓冲液3)或50mM二异丙胺盐酸盐(缓冲液4)。
图3示出了在存在0ng/μl、19ng/μl、39ng/μl、77ng/μl或154ng/μl木聚糖的情况下，嗜热性Taq DNA聚合酶对来自人类基因组DNA的727bp片段的扩增。抑制剂浓度由图顶部的三角形表示，样品中木聚糖的浓度从0ng/μL到154ng/μL从左到右递增。PCR缓冲液含有0mM乙基(甲基)胺盐酸盐(缓冲液1)、10mM乙基(甲基)胺盐酸盐(缓冲液2)、40mM乙基(甲基)胺盐酸盐(缓冲液3)或50mM乙基(甲基)胺盐酸盐(缓冲液4)。
图4示出了在存在0ng/μl、19ng/μl、39ng/μl、77ng/μl或154ng/μl木聚糖的情况下，嗜热性Taq DNA聚合酶对来自人类基因组DNA的727bp片段的扩增。抑制剂浓度由图顶部的三角形表示，样品中木聚糖的浓度从0ng/μL到154ng/μL从左到右递增。PCR缓冲液含有0mM三甲胺盐酸盐(缓冲液1)、10mM三甲胺盐酸盐(缓冲液2)、40mM三甲胺盐酸盐(缓冲液3)或50mM三甲胺盐酸盐(缓冲液4)
图5示出了在存在0ng/μl、19ng/μl、39ng/μl、77ng/μl或154ng/μl木聚糖的情况下，嗜热性Taq DNA聚合酶对来自人类基因组DNA的727bp片段的扩增。抑制剂浓度由图顶部的三角形表示，样品中木聚糖的浓度从0ng/μL到154ng/μL从左到右递增。PCR缓冲液含有0mM二甲胺盐酸盐(缓冲液1)、10mM二甲胺盐酸盐(缓冲液2)、40mM二甲胺盐酸盐(缓冲液3)或50mM二甲胺盐酸盐(缓冲液4)。
图6示出了在存在0mM、15mM、37mM、92mM或230mM尿素的情况下，嗜热性Taq DNA聚合酶对来自人类基因组DNA的727bp片段的扩增。抑制剂浓度由图顶部的三角形表示，样品中尿素的浓度从0mM到230mM从左到右递增。PCR缓冲液含有0mM二乙胺盐酸盐(缓冲液1)、10mM二乙胺盐酸盐(缓冲液2)、40mM二乙胺盐酸盐(缓冲液3)或50mM二乙胺盐酸盐(缓冲液4)。
图7示出了在存在0mM、15mM、37mM、92mM或230mM尿素的情况下，嗜热性Taq DNA聚合酶对来自人类基因组DNA的727bp片段的扩增。抑制剂浓度由图顶部的三角形表示，样品中尿素的浓度从0mM到230mM从左到右递增。PCR缓冲液含有0mM二异丙胺盐酸盐(缓冲液1)、10mM二异丙胺盐酸盐(缓冲液2)、40mM二异丙胺盐酸盐(缓冲液3)或50mM二异丙胺盐酸盐(缓冲液4)。
图8示出了在存在0mM、15mM、37mM、92mM或230mM尿素的情况下，嗜热性Taq DNA聚合酶对来自人类基因组DNA的727bp片段的扩增。抑制剂浓度由图顶部的三角形表示，样品中尿素的浓度从0mM到230mM从左到右递增。PCR缓冲液含有0mM乙基(甲基)胺盐酸盐(缓冲液1)、10mM乙基(甲基)胺盐酸盐(缓冲液2)、40mM乙基(甲基)胺盐酸盐(缓冲液3)或50mM乙基(甲基)胺盐酸盐(缓冲液4)。
图9示出了在存在0mM、15mM、37mM、92mM或230mM尿素的情况下，嗜热性Taq DNA聚合酶对来自人类基因组DNA的727bp片段的扩增。抑制剂浓度由图顶部的三角形表示，样品中尿素的浓度从0mM到230mM从左到右递增。PCR缓冲液含有0mM三甲胺盐酸盐(缓冲液1)、10mM三甲胺盐酸盐(缓冲液2)、40mM三甲胺盐酸盐(缓冲液3)或50mM三甲胺盐酸盐(缓冲液4)。
图10示出了在存在0mM、15mM、37mM、92mM或230mM尿素的情况下，嗜热性Taq DNA聚合酶对来自人类基因组DNA的727bp片段的扩增。抑制剂浓度由图顶部的三角形表示，样品中尿素的浓度从0mM到230mM从左到右递增。PCR缓冲液含有0mM二甲胺盐酸盐(缓冲液1)、10mM二甲胺盐酸盐(缓冲液2)、40mM二甲胺盐酸盐(缓冲液3)或50mM二甲胺盐酸盐(缓冲液4)。
图11示出了在存在0％、0.02％、0.04％、0.05％或0.08％的柠檬酸钠的情况下，嗜热性Taq DNA聚合酶对来自人类基因组DNA的727bp片段的扩增。抑制剂浓度由图顶部的三角形表示，样品中柠檬酸钠的浓度从0％到0.08％从左到右递增。PCR缓冲液含有0mM二乙胺盐酸盐(缓冲液1)、10mM二乙胺盐酸盐(缓冲液2)、40mM二乙胺盐酸盐(缓冲液3)或50mM二乙胺盐酸盐(缓冲液4)。
图12示出了在存在0％、0.02％、0.04％、0.05％或0.08％的柠檬酸钠的情况下，嗜热性Taq DNA聚合酶对来自人类基因组DNA的727bp片段的扩增。抑制剂浓度由图顶部的三角形表示，样品中柠檬酸钠的浓度从0％到0.08％从左到右递增。PCR缓冲液含有0mM二异丙胺盐酸盐(缓冲液1)、10mM二异丙胺盐酸盐(缓冲液2)、40mM二异丙胺盐酸盐(缓冲液3)或50mM二异丙胺盐酸盐(缓冲液4)。
图13示出了在存在0％、0.02％、0.04％、0.05％或0.08％的柠檬酸钠的情况下，嗜热性Taq DNA聚合酶对来自人类基因组DNA的727bp片段的扩增。抑制剂浓度由图顶部的三角形表示，样品中柠檬酸钠的浓度从0％到0.08％从左到右递增。PCR缓冲液含有0mM乙基(甲基)胺盐酸盐(缓冲液1)、10mM乙基(甲基)胺盐酸盐(缓冲液2)、40mM乙基(甲基)胺盐酸盐(缓冲液3)或50mM乙基(甲基)胺盐酸盐(缓冲液4)。
图14示出了在存在0％、0.02％、0.04％、0.05％或0.08％的柠檬酸钠的情况下，嗜热性Taq DNA聚合酶对来自人类基因组DNA的727bp片段的扩增。抑制剂浓度由图顶部的三角形表示，样品中柠檬酸钠的浓度从0％到0.08％从左到右递增。PCR缓冲液含有0mM三甲胺盐酸盐(缓冲液1)、10mM三甲胺盐酸盐(缓冲液2)、40mM三甲胺盐酸盐(缓冲液3)或50mM三甲胺盐酸盐(缓冲液4)。
图15示出了在存在0％、0.02％、0.04％、0.05％或0.08％的柠檬酸钠的情况下，嗜热性Taq DNA聚合酶对来自人类基因组DNA的727bp片段的扩增。抑制剂浓度由图顶部的三角形表示，样品中柠檬酸钠的浓度从0％到0.08％从左到右递增。PCR缓冲液含有0mM二甲胺盐酸盐(缓冲液1)、10mM二甲胺盐酸盐(缓冲液2)、40mM二甲胺盐酸盐(缓冲液3)或50mM二甲胺盐酸盐(缓冲液4)。
图16示出了在存在0M、0.14M、0.28M、0.42M、0.56M、0.70M、0.84M和0.98M尿素的情况下，嗜热性Platinum SuperFi DNA聚合酶对来自人类基因组DNA的1kb片段的扩增。PCR缓冲液含有110mM KCl或110mM二乙胺盐酸盐。
图17示出了在存在0M、0.14M、0.28M、0.42M、0.56M、0.70M、0.84M和0.98M尿素的情况下，嗜热性Platinum SuperFi DNA聚合酶对来自人类基因组DNA的1kb片段的扩增。PCR缓冲液含有110mM KCl、110mM乙基(甲基)胺盐酸盐
图18示出了在存在0M、0.14M、0.28M、0.42M、0.56M、0.70M、0.84M和0.98M尿素的情况下，嗜热性Platinum SuperFi DNA聚合酶对来自人类基因组DNA的1kb片段的扩增。在对照样品中，PCR缓冲液含有110mM二甲胺盐酸盐或110mM KCl
图19示出了在存在0μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl和35μl磁珠的情况下，嗜热性Platinum SuperFi DNA聚合酶对来自人类基因组DNA的1kb片段的扩增。在对照样品中，PCR缓冲液含有110mM二乙胺盐酸盐或110mM KCl。
图20示出了在存在0μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl和35μl磁珠的情况下，嗜热性Platinum SuperFi DNA聚合酶对来自人类基因组DNA的1kb片段的扩增。在对照样品中，PCR缓冲液含有110mM乙基(甲基)胺盐酸盐或110mM KCl。
图21示出了在存在0μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl和35μl磁珠的情况下，嗜热性Platinum SuperFi DNA聚合酶对来自人类基因组DNA的1kb片段的扩增。在对照样品中，PCR缓冲液含有110mM二甲胺盐酸盐或110mM KCl。
序列说明
下表提供了本文引用的某些序列的列表。
具体实施方式
I.定义
如本文所使用的，本文所用的“胺”包含式I的胺：
或其盐，其中
R1为H；R2选自烷基、烯基、炔基或(CH2)n-R5，其中n＝1到3，并且R5为芳基、氨基、硫羟、硫醇、磷酸酯、羟基、烷氧基；并且R3和R4可以是相同或不同的，并且独立地选自H或烷基，条件是如果R2为(CH2)n-R5，则R3和/或R4中的至少一个为烷基。因此，胺包含二乙胺盐酸盐、二异丙胺盐酸盐、乙基(甲基)胺盐酸盐、三甲胺盐酸盐和二甲胺盐酸盐。
如本文所使用的，“模板”是指可用作核酸合成的原料的任何核酸。因此，模板可以存在于生物样品内。因此，模板可以是合成/化学合成的核酸。模板核酸可以是单链的、双链的或部分双链的。示例性模板包含存在于生物样品或任何其它包含核酸的样品(例如，含有先前提取的、分离的或纯化的核酸的样品)中的RNA和DNA。
如本文所使用的，“核酸合成”是指使用聚合酶(即具有聚合酶活性的酶)对核酸链进行模板指导的合成。核酸合成包含通过聚合酶进行的所有此类模板指导的核酸合成，包含但不限于扩增、PCR、端点PCR(epPCR)、实时或定量PCR(qPCR)，一步式RT-PCR、测序等。核酸合成的“应用”是使用核酸合成的任何类型的应用、实验或程序。在一些实施例中，核酸合成用于产生基于不同模板或衍生自不同模板的核酸，如产生来自RNA模板的DNA。在一些实施例中，核酸合成用于产生存在于样品中的模板的拷贝，这将被称为“扩增(amplifying或amplification)”。
如本文所使用的，“核酸合成抑制剂”是指抑制或干扰合成核酸的反应的化合物或试剂。核酸合成抑制剂可能是来自获得的原始样品的样品中固有的。示例性原始样品是有机样品和/或生物样品，如血液、织物、组织、粪便、尿液和/或土壤。核酸合成抑制剂可能是以下样品中固有的：来自血液的样品(例如肝素、血凝素、EDTA、柠檬酸盐、血红素、含血红素的蛋白质)、来自土壤或植物材料的样品(例如腐殖酸或植物多糖(如木聚糖))、来自组织的样品(例如胶原蛋白)、来自尿液的样品(例如尿素)、来自粪便的样品(例如胆汁盐、腐殖酸)等。核酸合成抑制剂也可能在合成核酸的反应之前或期间在上游过程或步骤(如例如，核酸提取步骤)中已经被添加到样品中。可以从提取和纯化过程中使用的试剂(例如SDS、EDTA、乙醇、异丙醇、磁珠)中添加示例性核酸合成抑制剂。
如本文所使用的，“微载体”也被称为“微球”，“珠”涉及大小在0.5μm到100μm范围内的颗粒。优选地，所述大小在1μm到50μm的范围内，更优选地，在1μm到25μm的范围内，更优选地，在1μm到10μm的范围内。微载体可以是磁性的，即包括响应磁场的材料，如但不限于铁磁性材料、顺磁性材料和超磁性材料。
如本文所使用的，“用于长期储存的稳定调配物”是指在长期储存中保持活性的调配物。用于长期储存的稳定调配物的实例包含冻干或在组合物中使用去污剂。用于长期储存的稳定调配物可以使液体形式的组合物在4℃或室温下长期储存一周、两周、一个月或一个月以上。用于长期储存的稳定调配物可以使液体形式的组合物在-20℃下长期储存六个月、一年、两年或更长时间。示例性的稳定调配物可以是包括甘油或白砂糖(蔗糖)和/或去污剂的组合物。
如本文所使用的，“对抑制剂的耐受度”是指在存在一种或多种核酸合成抑制剂的情况下，聚合酶产生核酸合成产物的能力。
如本文所使用的，“产量”是指由聚合酶产生的核酸合成产物的量。
如本文所使用的，“嗜热性聚合酶”或“嗜热性DNA聚合酶”是指在相对高温下具有增强的活性和/或稳定性的聚合酶。嗜热性核酸聚合酶通常具有约70-75℃的最佳温度，并且可以在约50℃到90℃的范围内运作。这些酶是热稳定的蛋白质。耐高温蛋白质通常在高达约95℃的温度下稳定
如本文所使用的，“非嗜热性聚合酶”或“非嗜热性DNA聚合酶”是指在低于约70-75℃的温度下具有最佳活性的聚合酶。
如本文所使用的，“热启动反应”或“热启动PCR”是指用于反应的酶在加热之前是无活性的方案。热启动方案可以通过减少引物与非特异性模板的结合并减少引物二聚体的形成来减少非特异性扩增并增加目标产量和特异性。
II.组合物
包括胺的组合物可以通过核酸合成中的聚合酶提高核酸合成产物的产量或对核酸合成抑制剂的耐受度。在一些实施例中，核酸合成用于扩增核酸模板。
A.胺
本发明组合物包括一种或多种式I的胺：
或其盐，其中R1为H；R2选自烷基、烯基、炔基或(CH2)n-R5，其中n＝1到3，并且R5为芳基、氨基、硫羟、硫醇、磷酸酯、羟基、烷氧基；并且R3和R4可以是相同或不同的，并且独立地选自H或烷基，条件是如果R2为(CH2)n-R5，则R3和/或R4中的至少一个为烷基。
在一些实施例中，R2为烷基。在一些实施例中，R2为C1-C5烷基。在一些实施例中，所述C1-C5烷基是线性的。在一些实施例中，所述C1-C5烷基是支链的。在一些实施例中，R2为C1-C3烷基。在一些实施例中，所述烷基是甲基。
在一些实施例中，R3和R4相同。在一些实施例中，R3和R4不同。在一些实施例中，R3和/或R4为H。在一些实施例中，R3和/或R4为烷基。R3和/或R4为C1-C5烷基。在一些实施例中，所述C1-C5烷基是线性的。在一些实施例中，所述C1-C5烷基是支链的。在一些实施例中，R3和/或R4为C1-C3烷基。在一些实施例中，所述烷基是甲基。
在一些实施方案中，当R2为烯基或炔基时，R3和/或R4中的至少一个为烷基。
胺可以是伯胺、仲胺或叔胺。在一些实施例中，所述胺是单烷基胺。在一些实施例中，所述胺是二烷基胺。在一些实施例中，所述胺是三烷基胺。
表1给出了本发明的R1、R2、R3和R4基团的一些非限制性实例。
表1：本发明的R1、R2、R3和R4基团的一些非限制性实例
根据表1，下面列出的胺盐是优选的。
胺盐可以是伯胺盐，其结构中的C原子总数为1到5，无论原子的排列方式如何(例如，直链、支链、具有不同的饱和度)。在一些实例中，此类胺盐不包括杂原子。
示例性的伯胺是甲胺盐酸盐、乙胺盐酸盐、丙胺盐酸盐、丁胺盐酸盐、戊胺盐酸盐、丙基-2-胺盐酸盐、丁基-2-胺盐酸盐、戊基-2-胺盐酸盐、戊基-3-胺盐酸盐、乙胺盐酸盐、2-丙烯-1-胺盐酸盐、1-丙烯-1-胺盐酸盐、2-甲基-1-乙-1-胺盐酸盐、1-丁烯-1-胺盐酸盐、2-丁烯-1-胺盐酸盐、3-丁烯-1-胺盐酸盐、2-甲基-2-丙烯-1-胺盐酸盐、1-乙基乙胺盐酸盐、2-戊烯-1-胺盐酸盐、3-戊烯-1-胺盐酸盐、4-戊烯-1-胺盐酸盐、1-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、2-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、3-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐，1-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、2-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、3-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、1-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、2-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、3-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、1-乙基-1-丙烯-1-胺盐酸盐、1-乙基-2-丙烯-1-胺盐酸盐。
胺盐可以是C原子总数为2到15的仲胺盐。仲胺盐的C原子总数可以为2到10。进一步地，仲胺中C原子的总数可以为2到6。仲胺盐的C原子总数可以为2到4。在一些实例中，此类胺盐不包括杂原子。
示例性的仲胺是N-甲基甲胺盐酸盐(二甲胺盐酸盐)、N-甲基乙-1-胺盐酸盐(乙基(甲基)胺盐酸盐)、N-甲基丙-1-胺盐酸盐、N-甲基丁-1-胺盐酸盐、N-甲基戊-1-胺盐酸盐、N-乙基乙-1-胺盐酸盐(二乙胺盐酸盐)、N-乙基丙-1-胺盐酸盐、N-乙基丁-1-胺盐酸盐、N-乙基戊-1-胺盐酸盐、N-丙基丙-1-胺盐酸盐、N-丙基丁-1-胺盐酸盐、N-丙基戊-1-胺盐酸盐、N-丁基丁-1-胺盐酸盐、N-丁基戊-1-胺盐酸盐、N-戊基戊-1盐胺盐酸盐、N-甲基丙-2-胺盐酸盐、N-甲基丁-2-胺盐酸盐、N-甲基戊-2-胺盐酸盐、N-甲基戊-3-胺盐酸盐、N-乙基丙-2-胺盐酸盐、N-乙基丁-2-胺盐酸盐、N-乙基戊-2-胺盐酸盐、N-乙基戊-3-胺盐酸盐、N-丙基丙-2-胺盐酸盐、N-2-丙基丙-2-胺盐酸盐(二异丙胺盐酸盐)、N-丙基丁-2-胺盐酸盐、N-2-丙基丁-1-胺盐酸盐、N-2-丙基丁-2-胺盐酸盐、N-丙基戊-2-胺盐酸盐、N-丙基戊-3-胺盐酸盐、N-2-丙基戊-1-胺盐酸盐、N-2-丙基戊-2-胺盐酸盐、N-2-丙基戊-3-胺盐酸盐、N-丁基丁-2-胺盐酸盐、N-2-丁基丁-2-胺盐酸盐、N-2-丁基戊-1-胺盐酸盐、N-丁基戊-2-胺盐酸盐、N-丁基戊-3-胺盐酸盐、N-戊基戊-2-胺盐酸盐、N-戊基戊-3-胺盐酸盐、N-2-戊基戊-2-胺盐酸盐、N-3-戊基戊-3-胺盐酸盐、N-2-戊基戊-3-胺盐酸盐、N-甲基乙胺盐酸盐、N-乙基乙胺盐酸盐、N-丙基乙胺盐酸盐、N-丁基乙胺盐酸盐、N-戊基乙胺盐酸盐、N-甲基-2-丙烯-1-胺盐酸盐、N-甲基-1-丙烯-1-胺盐酸盐、N-甲基-2-甲基-1-乙烯-1-胺盐酸盐、N-乙基-2-丙烯-1-胺盐酸盐、N-乙基-1-丙烯-1-胺盐酸盐、N-乙基-2-甲基-1-乙烯-1-胺盐酸盐、N-丙基-2-丙烯-1-胺盐酸盐、N-丙基-1-丙烯-1-胺盐酸盐、N-丙基-2-甲基-1-乙烯-1-胺盐酸盐、N-丁基-2-丙烯-1-胺盐酸盐、N-丁基-1-丙烯-1-胺盐酸盐、N-丁基-2-甲基-1-乙烯-1-胺盐酸盐、N-戊基-2-丙烯-1-胺盐酸盐、N-戊基-1-丙烯-1-胺盐酸盐、N-戊基-2-甲基-1-乙烯-1-胺盐酸盐、N-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N-甲基-2-甲基-2-丙烯-1-胺盐酸盐、N-甲基-1-乙基乙胺盐酸盐、N-乙基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N-乙基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N-乙基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N-乙基-2-甲基-2-丙烯-1-胺盐酸盐、N-乙基-1-乙基乙胺盐酸盐、N-丙基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N-丙基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N-丙基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N-丙基-2-甲基-2-丙烯-1-胺盐酸盐、N-丙基-1-乙基乙胺盐酸盐、N-丁基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N-丁基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N-丁基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N-丁基-2-甲基-2-丙烯-1-盐胺盐酸盐、N-丁基-1-乙基乙胺盐酸盐、N-戊基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N-戊基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N-戊基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N-戊基-2-甲基-2-丙烯-1-胺盐酸盐、N-戊基-1-乙基乙胺盐酸盐、N-甲基-2-戊烯-1-胺盐酸盐、N-甲基-3-戊烯-1-胺盐酸盐、N-甲基-4-戊烯-1-胺盐酸盐、N-甲基-1-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N-甲基-2-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N-甲基-3-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N-甲基-1-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N-甲基-2-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N-甲基-3-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N-甲基-1-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N-甲基-2-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N-甲基-3-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N-甲基-1-乙基-1-丙烯-1-胺盐酸盐、N-甲基-1-乙基-2-丙烯-1-胺盐酸盐、N-乙基-2-戊烯-1-胺盐酸盐、N-乙基-3-戊烯-1-胺盐酸盐、N-乙基-4-戊烯-1-胺盐酸盐、N-乙基-1-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N-乙基-2-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N-乙基-3-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N-乙基-1-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N-乙基-2-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N-乙基-3-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N-乙基-1-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N-乙基-2-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N-乙基-3-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N-乙基-1-乙基-1-丙烯-1-胺盐酸盐、N-乙基-1-乙基-2-丙烯-1-胺盐酸盐、N-丙基-2-戊烯-1-胺盐酸盐、N-丙基-3-戊烯-1-胺盐酸盐、N-丙基-4-戊烯-1-胺盐酸盐、N-丙基-1-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N-丙基-2-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N-丙基-3-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N-丙基-1-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N-丙基-2-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N-丙基-3-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N-丙基-1-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N-丙基-2-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N-丙基-3-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N-丙基-1-乙基-1-丙烯-1-胺盐酸盐、N-丙基-1-乙基-2-丙烯-1-胺盐酸盐、N-丁基-2-戊烯-1-胺盐酸盐、N-丁基-3-戊烯-1-胺盐酸盐、N-丁基-4-戊烯-1-胺盐酸盐、N-丁基-1-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N-丁基-2-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N-丁基-3-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N-丁基-1-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N-丁基-2-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N-丁基-3-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N-丁基-1-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N-丁基-2-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N-丁基-3-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N-丁基-1-乙基-1-丙烯-1-胺盐酸盐、N-丁基-1-乙基-2-丙烯-1-胺盐酸盐、N-戊基-2-戊烯-1-胺盐酸盐、N-戊基-3-戊烯-1-胺盐酸盐、N-戊基-4-戊烯-1-胺盐酸盐、N-戊基-1-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N-戊基-2-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N-戊基-3-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N-戊基-1-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N-戊基-2-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N-戊基-3-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N-戊基-1-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N-戊基-2-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N-戊基-3-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N-戊基-1-乙基-1-丙烯-1-胺盐酸盐、N-戊基-1-乙基-2-丙烯-1-胺盐酸盐。
更优选的实例是N-甲基甲胺盐酸盐(二甲胺盐酸盐)、N-甲基乙-1-胺盐酸盐(乙基(甲基)胺盐酸盐)、N-甲基丙-1-胺盐酸盐、N-乙基乙-1-胺盐酸盐(二乙胺盐酸盐)、N-乙基丙-1-胺盐酸盐、N-2-丙基丙-2-胺盐酸盐(二异丙胺盐酸盐)，
胺盐可以是C原子总数为3到15的叔胺盐。叔胺盐的C原子总数可以为3到9，其中R2、R3和R4中的任何一个包括不多于5个C原子。进一步地，叔胺中C原子的总数可以为3到6。在一些实例中，此类胺盐不包括杂原子。
示例性的叔胺是N,N-二甲基甲胺盐酸盐(三甲胺盐酸盐)、N,N-二甲基乙-1-胺盐酸盐、N,N-二甲基丙-1-胺盐酸盐、N,N-二甲基丁-1-胺盐酸盐、N,N-二甲基戊-1-胺盐酸盐、N-乙基-N-甲基甲胺盐酸盐、N-乙基-N-甲基丙-1-胺盐酸盐、N-乙基-N-甲基丁-1-胺盐酸盐、N-乙基-N-甲基戊烷-1-胺盐酸盐、N-甲基-N-丙基丙-1-胺盐酸盐、N-甲基-N-丙基丁-1-胺盐酸盐、N-甲基-N-丙基戊-1-胺盐酸盐、N-丁基-N-甲基丁-1-胺盐酸盐、N-丁基-N-甲基戊-1-胺盐酸盐、N,N-二乙基乙胺盐酸盐、N,N-二乙基丙-1-胺盐酸盐、N,N-二乙基丁-1胺盐酸盐、N,N-二乙基戊-1-胺盐酸盐、N-乙基-N-丙基丙-1-胺盐酸盐、N-乙基-N-丙基丁-1-胺盐酸盐、N-乙基-N-丙基戊-1胺盐酸盐、N-乙基-N-丁基丁-1-胺盐酸盐、N-丁基-N-乙基戊胺盐酸盐、N-乙基-N-戊基戊-1-胺盐酸盐、N,N-二丙基丙-1-胺盐酸盐、N,N-二丙基丁-1-胺盐酸盐、N,N-二丙基戊-1-胺盐酸盐、N-丁基-N-丙基丁-1-胺盐酸盐、N,N-二丁基丁-1-胺盐酸盐、N,N-二丁基戊-1-胺盐酸盐、N-甲基-N-戊基戊-1-胺盐酸盐、N-乙基-N-戊基戊-1-胺盐酸盐、N-丙基-N-戊基戊-1-胺盐酸盐、N-丁基-N-戊基戊-1-胺盐酸盐、N,N-二戊基戊-1-胺盐酸盐、N,N-二甲基乙胺盐酸盐、N,N-二乙基乙胺盐酸盐、N,N-二丙基乙胺盐酸盐、N,N-二丁基乙胺盐酸盐、N,N-二戊基乙胺盐酸盐、N,N-二甲基-2-丙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二甲基-1-丙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二甲基-2-甲基-1-乙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二乙基-2-丙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二乙基-1-丙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二乙基-2-甲基-1-乙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丙基-2-丙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丙基-1-丙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丙基-2-甲基-1-乙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丁基-2-丙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丁基-1-丙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丁基-2-甲基-1-乙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二戊基-2-丙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二戊基-1-丙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二戊基-2-甲基-1-乙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二甲基-3-丁烯-1-胺盐酸、N,N-二甲基-2-甲基-2-丙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二甲基-1-乙基乙胺盐酸盐、N,N-二乙基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二乙基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二乙基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二乙基-2-甲基-2-丙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二乙基-1-乙基乙胺盐酸盐、N,N-二丙基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丙基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丙基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丙基-2-甲基-2-丙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丙基-1-乙基乙胺盐酸盐、N,N-二丁基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丁基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丁基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丁基-2-甲基-2-丙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丁基-1-乙基乙胺盐酸盐、N,N-二戊基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二戊基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二戊基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二戊基-2-甲基-2-丙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二戊基-1-乙基乙胺盐酸盐、N,N-二甲基-2-戊烯-1-胺盐酸盐、N,N-二甲基-3-戊烯-1-胺盐酸盐、N,N-二甲基-4-戊烯-1-胺盐酸盐、N,N-二甲基-1-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二甲基-2-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二甲基-3-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二甲基-1-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二甲基-2-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二甲基-3-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二甲基-1-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二甲基-2-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二甲基-3-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二甲基-1-乙基-1-丙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二甲基-1-乙基-2-丙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二乙基-2-戊烯-1-胺盐酸盐、N,N-二乙基-3-戊烯-1-胺盐酸盐、N,N-二乙基-4-戊烯-1-胺盐酸盐、N,N-二乙基-1-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二乙基-2-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二乙基-3-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二乙基-1-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二乙基-2-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二乙基-3-甲基-2-丁烯-1胺盐酸盐、N,N-二乙基-1-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二乙基-2-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二乙基-3-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二乙基-1-乙基-1-丙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二乙基-1-乙基-2-丙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丙基-2-戊烯-1-盐胺盐酸盐、N,N-二丙基-3-戊烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丙基-4-戊烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丙基-1-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸、N,N-二丙基-2-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丙基-3-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丙基-1-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丙基-2-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丙基-3-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丙基-1-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丙基-2-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丙基-3-甲基-1-丁烯-1胺盐酸盐、N,N-二丙基-1-乙基-1-丙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丙基-1-乙基-2-丙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丁基-2-戊烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丁基-3-戊烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丁基-4-戊烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丁基-1-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丁基-2-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丁基-3-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丁基-1-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丁基-2-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丁基-3-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丁基-1-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丁基-2-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丁基-3-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丁基-1-乙基-1-丙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二丁基-1-乙基-2-丙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二戊基-2-戊烯-1-胺盐酸盐、N,N-二戊基-3-戊烯-1-胺盐酸盐、N,N-二戊基-4-戊烯-1-胺盐酸盐、N,N-二戊基-1-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二戊基-2-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二戊基-3-甲基-3-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二戊基-1-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二戊基-2-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二戊基-3-甲基-2-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二戊基-1-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二戊基-2-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二戊基-3-甲基-1-丁烯-1-胺盐酸盐、N,N-二戊基-1-乙基-1-丙烯-1-胺盐酸盐、N,N-二戊基-1-乙基-2-丙烯-1-胺盐酸盐。
更优选的实例是N,N-二甲基甲胺盐酸盐(三甲胺盐酸盐)、N,N-二甲基乙-1-胺盐酸盐、N,N-二甲基丙-1-胺盐酸盐、N-乙基-N-甲基甲胺盐酸盐。
在其它实例中，可以使用所列出的胺的其它盐，如氯化物盐、硫酸盐或乙酸盐。
在一些实施例中，胺为盐形式。在一些实施例中，所述盐是与酶促核酸合成反应相容的任何盐。在一些实施例中，所述盐是阴离子。在一些实施例中，所述盐是氯化物盐、硫酸盐或乙酸盐。
在一些实施例中，组合物包括一种胺。在一些实施例中，组合物包括两种不同的胺。在一些实施例中，组合物包括三种不同的胺。在一些实施例中，组合物包括四种不同的胺。
在一些实施例中，组合物中一种或多种胺的总量约为10-250mM。在一些实施例中，组合物中一种或多种胺的总量约为50-110mM。在一些实施例中，组合物中一种或多种胺的总量小于约250mM。在一些实施例中，组合物中一种或多种胺的总量至少为约10mM、约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约110mM、约120mM、约130mM、约140mM、约150mM、约160mM、约170mM、约180mM、约190mM、约200mM、约210mM、约220mM、约230mM、约240mM或约250mM。
在一些实施例中，一种胺包括二甲胺盐酸盐。在一些实施例中，二甲胺盐酸盐的浓度约为10-250mM。在一些实施例中，二甲胺盐酸盐的浓度约为50-110mM。
在一些实施例中，一种胺包括二乙胺盐酸盐。在一些实施例中，二乙胺盐酸盐的浓度约为10-250mM。在一些实施例中，二乙胺盐酸盐的浓度约为50-110mM。
在一些实施例中，一种胺包括二异丙胺盐酸盐。在一些实施例中，二异丙胺盐酸盐的浓度约为10-250mM。在一些实施例中，二异丙胺盐酸盐的浓度约为50-110mM。
在一些实施例中，一种胺包括乙基(甲基)胺盐酸盐。在一些实施例中，乙基(甲基)胺盐酸盐的浓度约为10-250mM。在一些实施例中，乙基(甲基)胺盐酸盐的浓度约为50-110mM。
在一些实施例中，至少一种胺包括三甲胺盐酸盐。在一些实施例中，三甲胺盐酸盐的浓度约为10-250mM。在一些实施例中，三甲胺盐酸盐的浓度约为50-110mM。
B.核酸合成抑制剂
核酸合成抑制剂可以包含样品中固有的污染物或在上游过程中添加到样品中的试剂。胺可以在核酸合成反应中提高核酸合成产物的产量或对核酸合成抑制剂的耐受度。
在一些实施例中，核酸合成抑制剂降低PCR产量。在一些实施例中，核酸合成抑制剂消除扩增。
在一些实施例中，核酸合成抑制剂存在于生物样品中。在一些实施例中，所述核酸合成抑制剂存在于如血液、血清、血浆、尿液、织物、组织或土壤等生物样品中。
在一些实施例中，核酸合成抑制剂存在于含有核酸(先前提取的、分离的或纯化的核酸)的样品中。
在一些实施例中，核酸合成抑制剂被有意地添加到样品中。在一些实施例中，核酸合成抑制剂由于样品处理和核酸提取步骤而被添加(参见Schrader等人,《应用微生物学杂志(Journal of Applied Microbiology)》113:1014-1026(2012)和国际Alaeddini《国际法医学：遗传学(Forensic Science International:Genetics)》6:297-305(2012))。
在一些实施例中，所述核酸合成抑制剂是聚阴离子。在一些实施例中，所述聚阴离子是肝素或木聚糖。
在一些实施例中，所述核酸合成抑制剂是离液剂。在一些实施例中，所述离液剂是十二烷基硫酸钠或尿素。
在一些实施例中，所述核酸合成抑制剂是金属离子。在一些实施例中，所述金属离子是钙。
在一些实施例中，所述核酸合成抑制剂是蛋白质。在一些实施例中，所述核酸合成抑制剂是胶原蛋白、血红素或含血红素的蛋白质。
在一些实施例中，所述核酸合成抑制剂是有机化合物。在一些实施例中，所述抑制剂是腐殖酸或胆汁盐。
在一些实施例中，所述核酸合成抑制剂是螯合剂。在一些实施例中，所述螯合剂是柠檬酸盐或EDTA。
在一些实施例中，所述核酸合成抑制剂是有机溶剂。在一些实施例中，有机溶剂是乙醇或丙醇。
在一些实施例中，所述核酸合成抑制剂是核酸嵌入染料。
在一些实施例中，磁珠的存在抑制核酸合成反应。
1.磁珠
磁珠被广泛用于生物化学反应中，因为磁珠为广泛的生物磁分离、分子操作和亲和分离提供了出色的固体支持。磁珠可用于核酸分离/纯化方法中(例如，核酸在一种条件下与磁珠结合，并在其它条件下释放)。然而，在存在磁珠的情况下，可能观察到核酸合成抑制。
在一些实施例中，磁珠是羧化的磁珠。在一些实施例中，所述磁珠是XP(贝克曼库尔特公司)、Sera-MagTM SpeedBeadsTM(GE医疗生命科学公司)、MyOne羧化珠(DynaBeads)或RXNPure(欧米茄生物科技公司)。
在一些实施例中，核酸非序列特异性地结合至磁珠。在一些实施例中，核酸可逆地结合至磁珠。在一些实施例中，核酸非序列特异性可逆地结合至磁珠。在一些实施例中，核酸以序列特异性方式结合至磁珠。在一些实施例中，核酸不可逆地结合至磁珠。
在一些实施例中，磁珠被携带或包含在核酸合成步骤中。在一些实施例中，磁珠的抑制是浓度依赖性的。
在一些实施例中，将磁珠故意留在样品中。在一些实施例中，将磁珠故意留在样品中以减少上游处理步骤的数量。在一些实施例中，将磁珠故意留在样品中以减少处理样品所需的时间。在一些实施例中，将核酸(例如核酸模板或引物)结合或固定在磁珠上。在一些实施例中，将核酸(例如核酸模板或引物)结合或固定在磁珠上，并且将磁珠故意留在样品中。
在一些实施例中，在去除珠子的步骤之后，残留有磁珠的痕迹。
C.组合物的类型
本文要求保护的试剂盒或组合物可以进一步包括另外的组分，包含用于核酸合成的酶。在一些实施例中，可以将胺与聚合酶分开提供。在一些实施例中，可以将胺与酶一起提供，其可以被称为“MasterMix”。在一些实施例中，MasterMix包括聚合酶。在一些实施例中，将一种或多种胺和一种或多种用于合成核酸分子的酶包括在单个容器中。
在一些实施例中，在与酶和其它组分分开的容器中提供胺。在一些实施例中，不在反应缓冲液中提供胺。在一些实施例中，以包括胺或其盐的水溶液形式提供胺。
在一些实施例中，将胺与酶和其它组分一起提供。在一些实施例中，在反应缓冲液中提供胺。
在一些实施例中，反应缓冲液可以包括另外的组分。这些另外的组分可以是合成核酸分子(如dNTP或NTP)所必需的组分，或提高性能或反应溶液的储存的试剂(如蛋白质稳定剂或防腐剂)。
在一些实施例中，以2X、5X、10X或更高的浓度提供组合物。例如，如果以2X提供组合物，则本文讨论的浓度加倍(例如，如上所述；对于2X加倍)。例如，当将模板核酸和/或引物添加到组合物中时，通常将2X反应组合物稀释2倍。
在一些实施例中，合成核酸分子所需的组分包含酶、核酸分子、dNTP或NTP、缓冲液和辅助因子。在一些实施例中，除了酶之外，组合物还包括一种或多种另外的组分，所述一种或多种另外的组分选自：(i)一种或多种核酸分子；(ii)一种或多种核苷酸；(iii)一种或多种缓冲盐；和(iv)一种或多种辅助因子。
1.酶
在一些实施例中，本发明的酶包括聚合酶。在一些实施例中，本发明的聚合酶可以是嗜热性聚合酶。在一些实施例中，本发明的聚合酶可以是非嗜热性聚合酶。
在一些实施例中，聚合酶包括DNA聚合酶。在一些实施例中，所述DNA聚合酶包括Phi29或其衍生物(例如US9422535B2)、Bsm、Bst、T4、T7、DNA Pol I或Klenow片段和/或其突变体、变体和衍生物。
在一些实施例中，所述DNA聚合酶包括嗜热性DNA聚合酶。在一些实施例中，所述嗜热性DNA聚合酶包括Taq、Tbr、Tfl、Tth、Tli、Tfi、Tne、Tma、Pfu、Pwo、Kod、VENTTM、DEEPVENTTM、DNA聚合酶；Phusion DNA聚合酶；Phusion U DNA聚合酶；SuperFi DNA聚合酶；SuperFi U DNA聚合酶；和/或其突变体、变体和衍生物(参见例如US20170204384A1、US9493848B2、US6627424B1、62/524,730)；和/或GoTaq G2热启动聚合酶(Promega)、热启动DNA聚合酶(NEB)、TaKaRa TaqTM DNA聚合酶热启动(TaKaRa)、KAPA2G稳健的热启动DNA聚合酶(KAPA)、快速启动Taq DNA聚合酶(Roche)、热启动Taq DNA聚合酶(Qiagen)、Q5 DNA聚合酶、Kapa HiFi DNA聚合酶、PrimeStar Max DNA聚合酶、PrimeStarGXL DNA聚合酶。
在一些实施例中，所述DNA聚合酶包括非嗜热性DNA聚合酶。
在一些实施例中，所述DNA聚合酶包括嵌合DNA聚合酶。在一些实施例中，所述嵌合DNA聚合酶包括序列非特异性双链DNA(dsDNA)结合结构域。示例性DNA结合结构域包含来自硫磺矿硫化叶菌的Sso7d；来自嗜酸热硫化叶菌的Sac7d、Sac7a、Sac7b和Sac7e；以及来自芝田硫化叶菌的Ssh7a和Ssh7b；Pae3192、Pae0384和Ape3192；HMf家族古细菌组蛋白结构域和古细菌PCNA同系物。
在一些实施例中，聚合酶包括RNA聚合酶。在一些实施例中，所述RNA聚合酶包括SP6、T7或T3 RNA聚合酶及其突变体、变体和衍生物。
在一些实施例中，聚合酶包括RNA依赖性DNA聚合酶。在一些实施例中，所述RNA依赖性DNA聚合酶包括逆转录酶(RT)。在一些实施例中，所述逆转录酶包括M-MLV逆转录酶、RSV逆转录酶、AMV逆转录酶、RAV逆转录酶、MAV逆转录酶、HIV逆转录酶和/或其突变体、变体和衍生物(参见例如US8835148、US7056716、US7078208)；和/或SuperScript II逆转录酶、SuperScript III逆转录酶、SuperScript IV逆转录酶、Maxima逆转录酶、GoScript逆转录酶、PrimeScript逆转录酶、iScript逆转录酶、Sensiscript逆转录酶、ProtoScript逆转录酶、AffinityScript逆转录酶、NxtScript逆转录酶、RnaUsScript逆转录酶、RocketScript逆转录酶、GoScript逆转录酶和/或Thermoscript逆转录酶。
.在一些实施例中，逆转录酶具有降低的或基本上降低的RNase H活性。
2.另外的组分
在一些实施例中，除了胺(和任选的酶)组分之外，本发明的组合物还包括一种或多种合成核酸分子所必需的缓冲液和/或辅助因子。
在一些实施例中，所述一种或多种核酸分子包括RNA或DNA。在一些实施例中，所述一种或多种核酸分子包括至少一种引物。
在一些实施例中，所述一种或多种核苷酸包括dNTP或NTP。
在一些实施例中，用于形成本发明组合物的缓冲液包括乙酸盐、硫酸盐、盐酸盐、磷酸盐或三-(羟甲基)氨基甲烷的游离酸形式。在一些实施例中，可以使用与具有相同的近似离子强度和pKa的替代缓冲液。
在一些实施例中，除了缓冲盐之外，组合物中还包含如镁等辅助因子盐(如氯化镁、硫酸镁或乙酸镁)。
在一些实施例中，添加另外的钾盐。在一些实施例中，所述另外的钾盐包括氯化钾或乙酸钾。在一些实施例中，可以基于胺的存在降低氯化钾的浓度或可以省略氯化钾。
在一些实施例中，基于盐形式的胺的存在，可以减少组合物中其它盐的量。在一些实施例中，可以将其它盐的量减少例如至少5％、至少10％、至少20％、至少80％或超过90％。在一些实施例中，在组合物中，盐形式的胺可以为除其它盐之外的形式。
在一些实施例中，组合物中可能不存在KCl。在一些实施例中，如果试剂盒或组合物中的至少一种胺是二甲胺盐酸盐，则不存在KCl。
在一些实施例中，在添加所有缓冲液和盐之后，将缓冲的盐溶液充分混合直至所有盐溶解，并使用本领域已知的方法将pH调节至约8.0到9.0的pH值。在一些实施例中，pH值约为8.4-8.8。
在一些实施例中，组合物包括一种或多种去污剂。在一些实施例中，可用于本文提供的组合物中的示例性去污剂包含非离子去污剂、离子(阴离子、阳离子)去污剂和两性离子去污剂。示例性此类洗涤剂包含但不限于Hecameg(6-0-(N-庚基氨基甲酰基)-甲基-a-D-吡喃葡萄糖苷)、Triton X-200、Brij-58、CHAPS、正十二烷基-b-D-麦芽糖苷、NP-40、十二烷基硫酸钠(SDS)、X-15、X-35、X-45、X-100、X-102、X-l14、X-165、X-305、X-405、X-705、20和/或
在一些实施例中，组合物包括一种或多种蛋白质稳定剂。可用于本文提供的组合物中的非限制性示例性蛋白质稳定剂包含BSA、失活的聚合酶(如灭活的Taq聚合酶；参见例如，美国公开号2011/0059490)和脱铁转铁蛋白。可用于本文提供的组合物中的另外的非限制性示例性稳定剂包含甘油、海藻糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇和山梨糖醇。
在一些实施例中，组合物包括至少一种还原剂。在一些实施例中，所述还原剂包括二硫苏糖醇(DTT)。
在一些实施例中，组合物包括至少一种另外的添加剂。可以添加另外的添加剂，例如，增强高GC含量模板(例如，当GC含量约为65％或更高时)的核酸合成的添加剂。添加剂可以是例如乙二醇、聚乙二醇、1,2-丙二醇、硫酸铵、二甲基亚砜(DMSO)、甘油、甲酰胺、7-脱氮-GTP、乙酰胺或甜菜碱。
在一些实施例中，组合物包括至少一种染料。可用于本文提供的组合物中的非限制性示例性染料包含二甲苯腈FF、酒石黄、苯酚红、喹啉黄、亮蓝、漆蓝、靛蓝胭脂红、菜红、酸红1、间甲酚紫、甲酚红、中性红、溴甲酚绿、酸紫5、溴酚蓝和橙G(参见例如，美国专利号8663925B2)。另外的非限制性示例性染料在例如美国专利号第6,942,964号中描述。本领域技术人员将理解，可以使用不抑制通过本文所述的聚合酶合成核酸的任何染料。
在一些实施例中，组合物处于可长期保存的稳定调配物中。
表2提供了另外的组分的一些非限制性实例。
3.热启动组合物
在一些实施例中，包括至少一种胺和至少一种聚合酶的组合物是热启动组合物。在一些此类实施例中，所述组合物包括双重热启动组合物。在一些实施例中，所述双重热启动组合物包括至少两种不同的热启动机制，所述机制用于抑制或基本上抑制在第一温度下的聚合酶活性。此类热启动机制包含但不限于在较低温度下阻断DNA聚合酶活性的抗体或抗体组合、在较低温度下阻断DNA聚合酶活性的抗体模拟物或抗体模拟物的组合(如例如参见例如US5831012)、在较低温度下阻断DNA聚合酶活性的寡核苷酸(如例如，适体)、在升高的温度下解离的DNA聚合酶的可逆化学修饰、在较低温度下使活性降低的DNA聚合酶的氨基酸修饰、融合蛋白(包含超稳定的DNA结合结构域和拓扑异构酶)、其它抑制DNA聚合酶的温度依赖性配体、在较低温度下隔离引物的单链结合蛋白或经修饰的引物或经修饰的dNTP。在一些实施例中，热启动组合物包括至少一种聚合酶(具有或不具有热启动化学修饰)、至少一种热启动抗体、至少一种热启动适体和/或至少一种热启动
III.使用方法
在一些实施例中，用于由包括模板的样品合成核酸分子的方法包括将所述样品与包括一种或多种式I的胺的组合物混合；提供用于合成核酸分子的酶；在适于合成的条件下孵育所述混合物。在一些实施例中，合成核酸分子是为了扩增核酸模板。
在一些实施例中，模板是存在于样品中的核酸。在一些实施例中，模板是存在于样品中的DNA或RNA。
在一些实施例中，所述方法包括在将样品与包括一种或多种式I的胺的组合物混合的步骤之前用于纯化核酸的纯化步骤。在一些实施例中，在存在磁珠的情况下进行所述纯化步骤。
A.提高产量
在一些实施例中，包括使用一种或多种胺的方法提高或增加了核酸合成产物的产量。在一些实施例中，通过确定在包括一种或多种式I的胺的聚合酶(核酸合成)反应中获得的核酸合成产物的量，并与在相似的反应条件下(但不含胺)进行的反应中获得的产物的量进行比较，可以证明产量增加。基于盐形式的胺的存在，可以减少其它盐的量。
与在相似的反应条件下(但没有胺)进行的反应中获得的产物的量相比，产物的产量可以增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。基于盐形式的胺的存在，可以减少其它盐的量。在一些实施例中，产量可以增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍。
B.提高对抑制剂的耐受度
在一些实施例中，包括使用一种或多种胺的方法提高或增加了对抑制剂的耐受度。在一些实施例中，可以通过测量聚合酶产生产物的能力证明对抑制剂的耐受度增加。在一些实施例中，通过在存在一定量的反应抑制剂的情况下确定在包括式I的胺的聚合酶(核酸合成)反应中获得的产物的量，并与在相似的反应条件下(但不含胺)进行的反应中获得的产物的量进行比较，可以证明对抑制剂的耐受度增加。基于盐形式的胺的存在，可以减少其它盐的量。
在一些实施例中，与在相似的反应条件下(但没有胺)进行的反应中获得的产物的量相比，在存在抑制剂的情况下产物的产量增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。基于盐形式的胺的存在，可以减少其它盐的量。在一些实施例中，产量增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍。
IV.试剂盒
在一些实施例中，用于核酸合成的试剂盒包括(i)一种或多种用于合成核酸分子的酶或用于提供一种或多种用于合成核酸分子的酶的说明，以及(ii)一种或多种式I的胺或其盐。
在一些实施例中，试剂盒包括一种或多种用于合成核酸分子的酶。
实例
提供以下实例以阐释某些公开的实施例，并且以下实例不应被解释为以任何方式限制本公开的范围。
实例1.通过胺增加PCR产量和对Taq DNA聚合酶抑制剂的耐受度
在存在各种量的木聚糖、尿素和柠檬酸钠的情况下，通过扩增727bp PCR片段，评估具有胺(二乙胺盐酸盐、二异丙胺盐酸盐、乙基(甲基)胺盐酸盐、三甲胺盐酸盐、二甲胺盐酸盐之一)的Taq DNA(0.04u/μL)聚合酶的PCR产量和抑制剂耐受度。
在以下PCR缓冲液中进行50μl PCR反应，从62.5ng人类基因组DNA模板中扩增出727bp片段：
·PCR缓冲液1：10mM TRIS-HCl，pH 8.8；0.08％(v/v)Nonidet P40；50mM KCl；2mMMgCl2和0.2mM dNTP。
·PCR缓冲液2：10mM TRIS-HCl，pH 8.8；0.08％(v/v)Nonidet P40；40mM KCl；10mM胺(二乙胺盐酸盐、二异丙胺盐酸盐、乙基(甲基)胺盐酸盐、三甲胺盐酸盐、二甲胺盐酸盐之一)；2mM MgCl2和0.2mM dNTP。
·PCR缓冲液3：10mM TRIS-HCl，pH 8.8；0.08％(v/v)Nonidet P40；10mM Kcl；40mM胺(二乙胺盐酸盐、二异丙胺盐酸盐、乙基(甲基)胺盐酸盐、三甲胺盐酸盐、二甲胺盐酸盐之一)；2mM MgCl2和0.2mM dNTP。
·PCR缓冲液4：10mM TRIS-HCl，pH 8.8；0.08％(v/v)Nonidet P40；50mM胺(二乙胺盐酸盐、二异丙胺盐酸盐、乙基(甲基)胺盐酸盐、三甲胺盐酸盐、二甲胺盐酸盐之一)；2mMMgCl2和0.2mM dNTP。
将正向引物(SEQ ID No:1)和反向引物(SEQ ID No:2)与表3中所述的PCR程序一起使用。通过琼脂糖凝胶电泳以及随后的溴化乙锭染色来检测PCR产物。
表3：使用Taq DNA聚合酶确定PCR产量和对抑制剂的耐受度的PCR程序
A.木聚糖
在存在0ng/μl、19ng/μl、39ng/μl、77ng/μl或154ng/μl木聚糖的情况下，通过TaqDNA聚合酶扩增727bp片段。当与不含胺的PCR缓冲液1相比时，在含有二乙胺盐酸盐(图1)、二异丙胺盐酸盐(图2)、三甲胺盐酸盐(图4)的缓冲液中PCR产物的产量更高。除了增加的PCR产物的产量外，含有乙基(甲基)胺盐酸盐(图3)和二甲胺盐酸盐(图5)的PCR缓冲液对木聚糖的显示出的耐受度(154ng/μl)是PCR缓冲液1的耐受度(77ng/μl)的两倍。
B.尿素
在存在0mM、15mM、37mM、92mM或230mM尿素的情况下，通过Taq DNA聚合酶扩增727bp片段。对于含有二乙胺盐酸盐(图6)、二异丙胺盐酸盐(图7)、乙基(甲基)胺盐酸盐(图8)、二甲胺盐酸盐(图10)的缓冲液，在高达92mM的尿素下观察到可检测的PCR产物，这表明对尿素的耐受度是PCR缓冲液1(37mM)的2.5倍。与含有三甲胺盐酸盐的PCR缓冲液的反应显示出与PCR缓冲液1相同的对尿素的抗性(图9)。这些结果还表明，与PCR缓冲液1相比，胺(如二乙胺盐酸盐、二异丙胺盐酸盐、乙基(甲基)胺盐酸盐、三甲胺盐酸盐、二甲胺盐酸盐)增加了Taq DNA聚合酶的PCR产物产量(图6-10)。
C.柠檬酸钠
在存在0％、0.02％、0.04％、0.05％或0.08％的柠檬酸钠的情况下，通过Taq DNA聚合酶扩增727bp片段。与PCR缓冲液1相比，在含有胺(例如二乙胺盐酸盐、二异丙胺盐酸盐、乙基(甲基)胺盐酸盐、三甲胺盐酸盐、二甲胺盐酸盐)的PCR缓冲液中观察到更高的PCR产物产量。含有乙基(甲基)胺盐酸盐(图13)或三甲胺盐酸盐(图14)的PCR缓冲液中的反应显示出与PCR缓冲液1相同的对柠檬酸钠的耐受度(0.04％)，而含有二乙胺盐酸盐(图11)、二异丙胺盐酸盐(图12)、二甲胺盐酸盐(图15)的PCR缓冲液显示出的对柠檬酸钠的耐受度(0.05％)比PCR缓冲液1的耐受度高1.25倍。
因此，在存在木聚糖、尿素和柠檬酸钠的情况下，胺(如二乙胺盐酸盐、二异丙胺盐酸盐、乙基(甲基)胺盐酸盐、三甲胺盐酸盐、二甲胺盐酸盐)增加了Taq DNA聚合酶的产量和/或耐受度。
使用突变Taq DNA聚合酶的实验(其中反应缓冲液含有70mM、80mM或90mM KCl)显示，当反应缓冲液中的部分或全部钾盐被二甲胺盐酸盐替代时，PCR产物的产量增加(数据未示出)。
实例2.通过胺增加PCR产量和对Platinum SuperFi DNA聚合酶抑制剂的耐受度
通过在50μl PCR反应中扩增来自42ng人类基因组DNA模板的1kb片段，评估与对照预混物(含KCl)相比的具有不同胺的PCR预混物中尿素的产量和耐受度。
PCR预混物(1X)的组成是在1X SuperFi缓冲液中的0.16u/μL Platinum SuperFiDNA聚合酶。在一些实验中，用110mM的KCl替代包括胺的溶液。此外，预混物含有水或0.14M、0.28M、0.42M、0.56M、0.70M、0.84M或0.98M尿素，以测试尿素污染的影响。测试了以下胺：二乙胺盐酸盐、乙基(甲基)胺盐酸盐和二甲胺盐酸盐。所使用的正向引物是SEQ ID No:3并且反向引物是SEQ ID No:4。
用于实验的PCR程序在表4中描述。
表4：使用SuperFi聚合酶确定PCR产量和对抑制剂的耐受度的PCR程序
通过在1％TAE凝胶中进行电泳然后用溴化乙锭染色来检测产物。
在含有二甲胺盐酸盐的PCR反应中，即使在存在0.98mol/L尿素的情况下，也观察到足够量的产物(图18)，而对照预混物仅容许0.14mol/L的尿素。当使用二乙胺盐酸盐(图16)和乙胺盐酸盐(图17)作为胺时，与含有KCl的PCR缓冲液相比，还观察到对尿素的耐受度增加。此外，在存在二甲胺盐酸盐(图18)或二乙胺盐酸盐(图16)的情况下，PCR产量高得多。
这些数据表明，在存在尿素的情况下，胺提高了对尿素的耐受度并增加了PCR产量。
使用SuperFi DNA聚合酶的实验(其中反应缓冲液含有70mM、80mM或90mM KCl)显示，当反应缓冲液中的部分或全部钾盐被二甲胺盐酸盐替代时，PCR产物的产量增加(数据未示出)。
实例3.通过胺增加PCR产量和对Platinum SuperFi DNA聚合酶磁珠的耐受度
通过扩增来自42ng人类基因组DNA模板的1kb片段，评估与对照预混物(含KCl)相比的具有不同胺的PCR预混物中磁珠的PCR产量和耐受度。在存在越来越多的磁珠的情况下，在50μl PCR反应中进行PCR。
测试了以下胺：二乙胺盐酸盐、乙胺盐酸盐、三甲胺盐酸盐和二甲胺盐酸盐。将PCR预混物(1X)浓度的KCl(110mM)替换为包括胺的溶液。
在实验中使用了Agencourt XP磁珠。用80％的EtOH将5到35μl的磁珠洗涤2次，然后干燥(模仿用于纯化核酸的方案)。将干燥的磁珠重悬于50μl PCR反应中(连同PCR预混物、DNA基质和引物一起)。正向引物是SEQ ID No:3，并且反向引物是SEQ ID No:4。表4提供了该实验的PCR程序。
通过在1％TAE凝胶中进行电泳然后用溴化乙锭染色来检测产物。
当PCR溶液包括二乙胺盐酸盐(图19)、乙基(甲基)胺盐酸盐(图20)、三甲胺盐酸盐(数据未示出)或二甲胺盐酸盐(图21)时，观察到在PCR反应中使用多达20μl Agencourt XP磁珠时，PCR产物的产量增加。二甲胺盐酸盐也增加了PCR反应中磁珠的耐受量(图21)。
使用SuperFi DNA聚合酶的实验(其中反应缓冲液含有70mM、80mM或90mM KCl)显示，在存在磁珠的情况下，当反应缓冲液中的部分或全部钾盐被二甲胺盐酸盐替代时，PCR产物的产量增加(数据未示出)。
因此，在存在磁珠的情况下，胺(如二乙胺盐酸盐、乙基(甲基)胺盐酸盐、三甲胺盐酸盐或二甲胺盐酸盐)增加了Platinum SuperFi聚合酶的PCR产量。
等同物
前述书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实践实施例。前述描述和实例详述了某些实施例，并描述了发明人设想的最佳模式。然而，应当理解，无论前述内容在文本中的详细程度如何，实施例可以以多种方式实践，并且应该根据所附权利要求和其任何等同物来解释。
如本文所使用的，术语约是指数值，包含例如整数、分数和百分比，无论是否明确指出。术语约通常是指本领域普通技术人员认为等同于所述值(例如，具有相同的功能或结果)的一系列数值(例如，所述范围的+/-5％到10％)。当如至少和约等术语在数值或范围列表之前时，该术语修改列表中提供的所有值或范围。在一些情况下，术语约可以包含四舍五入到最接近的有效数字的数值。
序列表
<110> THERMO FISHER SCIENTIFIC BALTICS UAB
<120> 包括胺的聚合酶链反应组合物
<130> LT01310PCT
<140>
<141>
<150> 62/610,042
<151> 2017-12-22
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 1
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<212> DNA
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<400> 3
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /备注=“人工序列的描述：合成引物”
<400> 4
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