阅读说明：本技术 羟基十八碳二烯酸在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物的用途及其分离方法 (Application of hydroxyoctadecadienoic acid in preparation of alpha-glucosidase inhibitor drugs and separation method thereof ) 是由 龚萌 刘月秋 于 2020-06-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了羟基十八碳二烯酸在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物的用途,属于降糖药领域。发明人通过研究中药地骨皮中的抑制α-葡萄糖苷酶的物质,发现9-羟基-10,12-十八碳二烯酸是其中重要的抑制α-葡萄糖苷酶的成分。将9-羟基-10,12-十八碳二烯酸作为α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物中的活性成分,有望取代现有的α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物,应用前景好。(The invention discloses application of hydroxyoctadecadienoic acid in preparation of alpha-glucosidase inhibitor drugs, and belongs to the field of hypoglycemic drugs. The inventor finds that 9-hydroxy-10, 12-octadecadienoic acid is an important alpha-glucosidase inhibiting component in Chinese medicinal cortex lycii radicis by researching alpha-glucosidase inhibiting substances. The 9-hydroxy-10, 12-octadecadienoic acid is used as an active ingredient in the alpha-glucosidase inhibitor drugs, is expected to replace the existing alpha-glucosidase inhibitor drugs, and has good application prospect.)

羟基十八碳二烯酸在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物的用途 及其分离方法

技术领域

本发明属于降糖药领域。

背景技术

据2016年世界卫生组织的相关统计报道，现今全世界范围内有大约4.42 亿糖尿病患者。据2010年的调查，中国已有高达1.14亿糖尿病患者，占成人比例11.6％，前驱糖尿病患者更是达到50％之多，中国成为世界上糖尿病发病率最高的国家，且每年糖尿病新增病例有增无减(Xu Y.etal.,Journal of the American Medical Association,2013,310:948-958.)。2型糖尿病占据糖尿病病例当中的90％，糖尿病的惊人发病率，已成为继癌症、心血管疾病、慢性呼吸道疾病后的社会医疗系统的最大负担之一。

α-葡萄糖苷酶，又称葡萄糖基转移酶(α-glucosidase，EC.3.2.1.20)，系统命名为α-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶。α-葡萄糖苷酶能催化α-1.4-糖苷键水解，使小肠内麦芽糖、蔗糖等寡糖水解。抑制α-葡萄糖苷酶的活性，可使葡萄糖的生成及吸收减缓、减少，降低血糖。因此，α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物(以α-葡萄糖苷酶抑制剂为活性成分的药物)是少数可干预糖耐量受损的口服降糖药之一，适用于II型糖尿病的降糖治疗，以及I型糖尿病在使用胰岛素治疗时的辅助治疗。另外，α-葡萄糖苷酶抑制剂通过降低血糖，从而抑制血糖在肝脏内转化为脂肪，因此，α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物还能用于减肥。

羟基十八碳二烯酸(hydroxyoctadecaenoic acids，HODEs)是亚油酸的氧化产物，研究表明，内源性的HODEs具有病理生理学作用，与人类某些疾病的形成和发展有关；而外源性的HODEs对人体的作用并不清楚(姜春姣等，亚油酸氧化产物——羟基十八碳二烯酸的研究进展，食品科学，2018,Vol.39, No.07)。

9-羟基-10,12-十八碳二烯酸是一类HODEs，目前未见9-羟基-10,12-十八碳二烯酸的α-葡萄糖苷酶抑制活性的报道。

地骨皮是一种可用于治疗糖尿病的中成药，但其药理活性与其物质基础的对应关系鲜有报道。其主要原因是：对复杂提取物中生物活性成分的研究既费力又费时，馏分活性追踪分离法(Bioassay-guided fraction)多年来被作为药用植物中新的活性化合物寻求的经典途径，多环节的分离及馏分活性测试，工作量非常之大而繁琐，且容易丢失含量较小的活性化合物。

发明内容

本发明要解决的问题是：提供9-羟基-10,12-十八碳二烯酸在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物的用途，并提供从地骨皮中分离9-羟基-10,12-十八碳二烯酸的方法。

本发明的技术方案如下：

9-羟基-10,12-十八碳二烯酸在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物的用途。

术语“α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物”指：主要或唯一活性成分为α-葡萄糖苷酶抑制剂的药物。

如前述的用途，所述9-羟基-10,12-十八碳二烯酸为(9S,10E,12Z)-9-羟基-10,12-十八碳二烯酸或(9R,10E,12Z)-9-羟基-10,12-十八碳二烯酸。

如前述的用途，所述α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物是治疗糖尿病的药物。

如前述的用途，所述α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物是减肥药。

一种治疗糖尿病的药物，所述药物以9-羟基-10,12-十八碳二烯酸为活性成分。

如前述的药物，所述9-羟基-10,12-十八碳二烯酸为(9S,10E,12Z)-9-羟基-10,12-十八碳二烯酸或(9R,10E,12Z)-9-羟基-10,12-十八碳二烯酸。

一种减肥药，所述药物以9-羟基-10,12-十八碳二烯酸为活性成分。

如前述的减肥药，所述9-羟基-10,12-十八碳二烯酸为(9S,10E,12Z)-9- 羟基-10,12-十八碳二烯酸或(9R,10E,12Z)-9-羟基-10,12-十八碳二烯酸。

一种从中药地骨皮中分离9-羟基-10,12-十八碳二烯酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)地骨皮粉碎，用乙酸乙酯提取，真空干燥，得粗提物；

2)甲醇溶解粗提物，进行液相色谱分析，每隔1min收集一个馏分；

3)进行超高效液相色谱-质谱进行检测，找出具有ESI-295.2291离子峰的馏分。

如前述的方法，步骤3)中：

超高效液相色谱的流动相为：

A：5％v/v乙腈溶于水中，水中包含0.1％v/v甲酸；B：95％v/v乙腈溶于水中，水中包含0.1％v/v甲酸；

超高效液相色谱的洗脱条件为：0min 8％ v/v B，5min 40％ v/v B，9min 80％v/v B，13min 100％ v/v B；

质谱源温150℃，锥孔电压40kv，去溶剂温度200℃，锥孔气流50L/h，除溶剂气流600L/h，正离子和负离子模式的喷雾电压为3kV。

本发明的具有如下有益效果：

1.α-葡萄糖苷酶抑制剂能抑制小肠内麦芽糖、蔗糖等寡糖水解，具有降低血糖的作用；而本发明公开了9-羟基-10,12-十八碳二烯酸抑制α-葡萄糖苷酶的活性高于传统α-葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖，且不受羟基碳手性的影响；根据该发现，提供了9-羟基-10,12-十八碳二烯酸在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物的用途，应用前景良好。

2.本发明提供的从中药地骨皮中分离9-羟基-10,12-十八碳二烯酸的方法，可从地骨皮中提纯其降糖活性成分，为9-羟基-10,12-十八碳二烯酸的制备提供新的途径。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的

具体实施方式

，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1是9S-HODE、9R-HODE、阿卡波糖的α-葡萄糖苷酶抑制剂活性IC₅₀曲线。

图2是样品6的液相色谱分析及馏分收集示意图。

图3是9-羟基-10,12-十八碳二烯酸以及9S-HODE、9R-HODE的结构。

具体实施方式

实施例1 9-羟基-10，12-十八碳二烯酸的α-葡萄糖苷酶抑制活性鉴定

购买9-羟基-10,12-十八碳二烯酸的两种标准品：(9S,10E,12Z)-9-羟基 -10,12-十八碳二烯酸(简称9S-HODE)和(9R,10E,12Z)-9-羟基-10,12-十八碳二烯酸(简称9R-HODE)(Cayman Chemical Company,MI,USA)，测定其α- 葡萄糖苷酶抑制活性，以阿卡波糖为阳性对照。

测定方法如下：

样品溶解于DMSO，配制成40mg/mL溶液，使用DMSO稀释成不同浓度梯度，各取10μL置于96孔板中，加入90μL 0.1M磷酸缓冲液(pH7.5,0.02％ NaN₃)，加入80μL溶解于上述磷酸缓冲液浓度为0.05U/mL的α-葡萄糖苷酶，混合物充分混合并在置于培养箱中在28℃培养10min，之后加入20μL 用磷酸缓冲液配制的浓度为10mM的对硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷(PNPG)，未加入样品并用相应溶剂代替的处理作为空白对照，阿卡波糖作为阳性对照，所有处理重复三次，α-葡萄糖苷酶抑制活性通过实验微孔板分光光度计在405 nm下每30s对α-葡萄糖苷酶水解产物对硝基苯酚的监测获得，计算抑制率：抑制率(％)＝(斜率空白－斜率样品)/斜率空白×100，使用Grafit 7 (Erithacus Software,London,UK)计算各样品的IC₅₀值。

结果：9S-HODE和9R-HODE的IC₅₀分别为1.0423±0.0495mM、 1.0413±0.0551mM，低于阳性对照阿卡波糖的IC₅₀(图1)，表明9-羟基-10,12- 十八碳二烯酸具有比阿卡波糖更高的α-葡萄糖苷酶抑制活性，且不受羟基碳手性的影响。

实施例2 地骨皮中分离9-羚基-10，12-十八碳二烯酸

本实施例的目的是从地骨皮中分离出9-羟基-10,12-十八碳二烯酸。

分离步骤如下：

1.粗提

将地骨皮进行粉碎，称取10g样品于带塞三角瓶中，加入100mL乙酸乙酯，振荡1h，放置48h，振荡10min后过滤，滤液置于真空干燥器干燥，得粗提物。

2.分离

粗提物溶解于甲醇配制为40mg/mL的溶液，用0.45μm孔径滤膜过滤后进行液相色谱的分析，并每隔1min收集一个馏分。

色谱条件为：流动相流速为0.5mL/min，流动相组成为(A)5％乙腈溶于水中(包括0.1％甲酸)和(B)95％乙腈溶于水中(包含0.1％甲酸)；洗脱条件为0min 14％B，20min80％B，35min 90％B，50min 100％B，60min 100％B，曲线模式(Curve)为6，色谱柱为4.6mm×100mm，填料为2.6μm的C18柱(Phenomenex,Torrance,CA,USA)；温度设置为40℃；进样量为2μL。

3.进一步分离

将前述馏分分别进行超高效液相色谱-质谱进行检测，找出具有ESI^- 295.2291离子峰的馏分(图2)，在此基础上纯化并制备馏分，即得。

超高效液相色谱设置条件为：流动相流速为450μL/min，流动相组成为(A)5％v/v乙腈溶于水中(包括0.1％v/v甲酸)和(B)95％v/v乙腈溶于水中(包含0.1％v/v甲酸)，洗脱条件为0min 8％v/vB，5min 40％v/v B， 9min 80％v/v B，13min 100％v/v B，曲线模式(Curve)为6；色谱柱(Waters BEH C18 2.1mm×100mm，1.7μm)温度设置为35℃；进样量为0.5μL。

所述质谱设置条件为：质谱由电喷雾电离源(ESI)和四极杆串联时间飞行质量分析仪组成，无论正负模式，源温150℃，锥孔电压40kv，去溶剂温度200℃，锥孔气流50L/h，除溶剂气流600L/h，正离子和负离子模式的喷雾电压为3kV。

4.鉴定

取“3.进一步分离”中所得馏分，进行核磁共振(NMR)鉴定分析，其¹H-NMR及¹³C-NMR数据见表1。解析质谱及NMR数据，得到活性化合物结构式为C₁₈H₃₂O₃，结构为多不饱和脂肪酸9-羟基-10,12-十八碳二烯酸(图 3)。

表1 ¹H-NMR及¹³C-NMR

综上，本发明发现了9-羟基-10,12-十八碳二烯酸具有明显的α-葡萄糖苷酶抑制活性，并提供了从地骨皮中成功分离得到9-羟基-10,12-十八碳二烯酸的方法。将本发明的发现与方法应用于产业上α-葡萄糖苷酶抑制剂类降糖药物的生产，将具有良好的应用前景。