阅读说明：本技术 长链不饱和脂肪酸在制备预防爱德华氏菌的组合物中的应用 (Application of long-chain unsaturated fatty acid in preparation of composition for preventing Edwardsiella ) 是由 王启要 魏立帆 张元兴 刘琴 刘晓红 马悦 于 2018-05-31 设计创作，主要内容包括：本发明涉及长链不饱和脂肪酸(UFA)在制备预防爱德华氏菌的组合物中的应用。首次揭示UFA对于抑制爱德华氏菌感染宿主具有极其显著的效果。UFA通过结合爱德华氏菌的EsrC蛋白,使EsrC蛋白激活菌体内三型分泌系统(T3SS)和六型分泌系统(T6SS)的能力减弱或被抑制,从而降低爱德华氏菌感染或定植宿主的能力。(The invention relates to application of long-chain Unsaturated Fatty Acid (UFA) in preparation of a composition for preventing Edwardsiella. The UFA is disclosed to have extremely remarkable effect on inhibiting the host from being infected by the Edwardsiella for the first time. UFA reduce the ability of edwardsiella to infect or colonize a host by binding to the EsrC protein of edwardsiella to reduce or inhibit the ability of the EsrC protein to activate the three-type (T3SS) and six-type (T6SS) secretion systems in the organism.)

长链不饱和脂肪酸在制备预防爱德华氏菌的组合物中的应用

技术领域

本发明属于鱼类养殖领域，更具体地，本发明涉及长链不饱和脂肪酸在制备预防爱德华氏菌的组合物中的应用。

背景技术

随着水产养殖业养殖规模的不断扩大，养殖病害的大规模爆发常常发生。鱼类传染性疾病每年造成的损失占产量的20％以上，大规模爆发的疾病已成为水产养殖行业主要的障碍。造成鱼类传染性疾病的主要原因包括细菌、寄生虫以及病毒。

爱德华氏菌可引起爱德华氏菌病，是一种重要的鱼类病原菌，能对鲶鱼、大菱鲆以及鳗鲡等20多种淡水和海水鱼类致病，引起胃肠炎症和出血性败血症，造成鱼类大量死亡，严重威胁水产养殖业。其中，杀鱼爱德华氏菌是爱德华氏菌属中毒性最强的菌种之一。爱德华氏菌成功感染宿主所必需的毒力相关因子主要是三型分泌系统(T3SS)和六型分泌系统(T6SS)。在杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)，迟钝爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)，鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)体内，T3SS和T6SS受到全局调控因子EsrC严格的调控。

目前在海水养殖生产中一般都是通过化学合成的药物或者抗生素来控制该病的大规模爆发，但长期的用药出现很多弊端：1)鱼类疾病有时病因复杂，大量用药存在盲目性，很多疾病目前没有针对性的药物可以治疗；2)化学药物预防作用很弱，生病的鱼摄食很差，无法摄取到有效的药物剂量；3)鱼体摄取的药物往往会残留其中，危害人类健康，且长期用药会带来环境污染，并导致大量微生物抗药性的出现。并且，在长期药物的维持下，大量本该淘汰的抗病能力弱的个体存活下来不仅影响鱼肉的品质，而且会使整个群体抗病能力下降，严重影响海水养殖业的发展。

因此，开发出低毒性或无毒性，环境友好，且效果理想的产品或方法来防治鱼类养殖过程种的病害，是本领域亟待解决的问题。此外，水产养殖业的产业特点要求病害防治技术必须经济、应用实施方便，所以待开发的产品或方法也应满足经济实用的特点。

发明内容

本发明的目的在于提供长链不饱和脂肪酸在制备预防爱德华氏菌的组合物中的应用。

在本发明的第一方面，提供长链不饱和脂肪酸的用途，用于制备抑制爱德华氏菌感染宿主的组合物；所述的长链不饱和脂肪酸包括：油酸(CAS#:143-19-1)，或棕榈油酸(CAS#:373-49-9)。

在本发明的第一方面，提供长链不饱和脂肪酸的用途，用于制备预防鱼受到爱德华氏菌感染的组合物；所述的长链不饱和脂肪酸包括：油酸(CAS#:143-19-1)，或棕榈油酸(CAS#:373-49-9)。

在一个优选例中，所述的组合物是药物、食物或饲料。

在另一优选例中，所述的鱼是作为爱德华氏菌宿主的鱼，也即所述鱼为爱德华氏菌易感性的鱼。

在另一优选例中，所述的鱼包括(但不限于)：鲽形目(包括鲆科)的鱼，鲤形目(包括鲤科)的鱼，鲈形目(包括丽鱼科)；较佳地，包括(但不限于)：鲽形目鲆科的大菱鲆，鲤形目鲤科的斑马鱼，鲇鱼，鳗鲡，比目鱼，大马哈鱼，罗非鱼等。

在另一优选例中，所述的爱德华氏菌是杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiellapiscicida)，迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)，鮰爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)。

在本发明的另一方面，提供一种抑制爱德华氏菌感染宿主的方法，所述方法包括：以长链不饱和脂肪酸处理或培养爱德华氏菌；所述的长链不饱和脂肪酸包括：油酸(CAS#:143-19-1)，或棕榈油酸(CAS#:373-49-9)。

在一个优选例中，所述的长链不饱和脂肪酸通过结合EsrC，使EsrC激活菌体内三型分泌系统(T3SS)和六型分泌系统(T6SS)的能力减弱或被抑制，降低其感染或定植宿主的能力。

在本发明的另一方面，提供一种抑制爱德华氏菌感染宿主的组合物，所述组合物中含有长链不饱和脂肪酸，以及食品学或药学上可接受的载体或赋形剂；所述的组合物中，长链不饱和脂肪酸的含量为20～200μM；较佳地20～100μM。

在一个优选例中，所述的食品学或药学上可接受的载体或赋形剂包括BSA。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、UFA可以抑制EsrC结合DNA。

A-B，不同脂肪酸的加入影响了T3SS的转录和蛋白表达水平。

C，EMSA实验证明UFA影响了EsrC与DNA结合。

D，EsrCR38G不受脂肪酸的影响。

E，模拟脂肪酸和EsrC相互作用的位点。

图2、大菱鲆的死亡曲线。对大菱鲆腹腔注射PBS、爱德华氏菌混合BSA(WT+BSA)、爱德华氏菌混合不饱和脂肪酸(WT+UFA)、爱德华氏菌esrC缺失株(ΔesrC)，记录死亡情况。

图3、斑马鱼的死亡曲线。对斑马鱼肌肉注射PBS、爱德华氏菌混合BSA(WT+BSA)、爱德华氏菌混合不饱和脂肪酸(WT+UFA)、爱德华氏菌esrC缺失株(ΔesrC)，记录死亡情况。

图4、pUTt质粒图谱。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次揭示长链不饱和脂肪酸(UFA)对于抑制爱德华氏菌感染宿主具有极其显著的效果。所述的长链不饱和脂肪酸通过结合爱德华氏菌的EsrC蛋白，使EsrC蛋白激活菌体内三型分泌系统(T3SS)和六型分泌系统(T6SS)的能力减弱或被抑制，从而降低爱德华氏菌感染或定植宿主的能力。

长链不饱和脂肪酸

本发明应用了长链不饱和脂肪酸，其是具有1～2个双键的且碳链长度为16～22个碳原子的直链脂肪酸。更优选地，所述的长链不饱和脂肪酸具有1个双键。更优选地，所述的长链不饱和脂肪酸的碳链长度如16、17、18、19、20、21、22个碳原子。

在本发明的进一步优选的方式中，所述的长链不饱和脂肪酸是油酸或棕榈油酸。

油酸(Oleic acid)为单不饱和脂肪酸，其分子式C₁₈H₃₄O₂，其结构式如下：

棕榈油酸(Palmitoleic acid)为单不饱和脂肪酸，又称为“顺-9-十六烯酸”，其分子式C₁₆H₃₀O₂，其结构式如下：

在上述最为优选的长链不饱和脂肪酸基础上，本发明进一步也包括所述的长链不饱和脂肪酸的类似物或衍生物，例如一个或多个基团被取代但仍保留其活性的物质。

本发明还包括所述长链不饱和脂肪酸的食品学或药学上可接受的盐、水合物或前体，只要它们也具有预防、缓解或治疗爱德华氏菌感染的作用。所述的“食品学或药学上可接受的盐”是指一类化合物与无机酸、有机酸、碱金属或碱土金属等反应生成的盐。这些盐包括(但不限于)：(1)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸；(2)与如下有机酸形成的盐，如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、或精氨酸。其它的盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯，或其它常规的“前体”的形式。

所述的“前体”指当用适当的方法施用后，该前体在体内进行代谢或化学反应而转变成长链不饱和脂肪酸或其类似物。

本发明还包括所述长链不饱和脂肪酸的异构体、外消旋体，只要它们也具有防治爱德华氏菌感染的作用。本文所用的术语“异构体”包括：几何异构体、对映异构体、非对映异构体(如顺反异构体，构象异构体)。化合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。

本领域人员应理解，在得知了长链不饱和脂肪酸的结构以后，可通过多种本领域熟知的方法、利用公知的原料来获得，比如化学合成或从生物(如动物或植物)中提取的方法，这些方法均包含在本发明中。此外，也可通过商购途径获得所述的长链不饱和脂肪酸。

用途

爱德华氏菌中，三型分泌系统(T3SS)和六型分泌系统(T6SS)受到全局调控因子EsrC严格的调控。本发明人研究发现，长链不饱和脂肪酸可以直接结合EsrC，使得EsrC蛋白结构发生改变，导致EsrC失去激活T3SS以及T6SS的能力。当T3SS和T6SS被关闭时，杀鱼爱德华氏菌、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)等不能成功感染宿主。

EsrC是由230个氨基酸(aa)组成的、AraC家族转录调控因子。本发明人研究发现，UFA可以直接结合EsrC，使得EsrC蛋白结构发生改变，导致EsrC失去激活T3SS以及T6SS的能力。当T3SS和T6SS被关闭时，杀鱼爱德华氏菌不能成功感染宿主。

在本发明的实施例中，本发明人研究了蛋白和长链不饱和脂肪酸以及DNA相互作用。结果证明，EsrC可以通过直接结合DNA从而激活T3/T6SS表达，但是当EsrC和长链不饱和脂肪酸结合后，EsrC失去激活T3/T6SS的能力，最终失去感染并且定植宿主的能力。

在本发明的实施例中，本发明人直接对鱼类进行感染实验研究，明确了长链不饱和脂肪酸可以显著保护宿主免受爱德华氏菌的毒害，可以有效预防水产养殖过程中由爱德华氏菌引起的大规模流行病害。

基于本发明人的新发现，本发明提供了长链不饱和脂肪酸的用途，用于制备防治爱德华氏菌感染的组合物。

与爱德华氏菌感染相关的宿主包括海水鱼类和淡水鱼类，所述的宿主包括任何作为爱德华氏菌宿主的鱼。例如包括但不限于：鲽形目(包括鲆科)，鲤形目(包括鲤科)。更具体地例如但不限于：鲽形目鲆科的大菱鲆，鲤形目鲤科的斑马鱼，鲇鱼，鳗鲡，比目鱼，大马哈鱼，罗非鱼等。

组合物

如本文所用，术语“本发明的组合物”通常是食物组合物、饲料组合物或药物组合物，其含有长链不饱和脂肪酸(或其类似物或它们的异构体、外消旋体、食品学或药学上可接受的盐、水合物或前体)作为防治爱德华氏菌感染的活性成分；以及药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本发明中，“食品学或药学上可接受的”成分是适用于动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和***反应)即有合理的效益/风险比的物质。

本发明中，“食品学或药学上可接受的载体”是用于将本发明的长链不饱和脂肪酸(或其类似物或它们的异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物或前体)传送给动物的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。适用于本发明的药学上可接受的载体包括(但并不限于)：BSA、盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。

本发明还提供了制备防治爱德华氏菌感染的组合物的方法，包括使用可将有效量的长链不饱和脂肪酸(或其类似物或它们的异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物或前体)与药学上可接受的载体混合获得本发明的组合物，活性成分在组合物中的重量比例例如可以是0.0001-50wt％；较佳地可以是0.001-20wt％。

本发明所述的组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达动物的剂型都是可以的。从易于制备和给药的立场看，优选的组合物是一种口服或注射的制剂。比如可选自：颗粒剂、片剂、胶囊剂、溶液、或悬浮液、粉末剂。本发明的组合物中可以加入制备不同剂型时所需要的各种常规载体或辅料，如填充剂、矫味剂、抗氧化剂、香料、色素、润滑剂、助流剂、润湿剂、乳化剂、pH缓冲物质等。这些添加剂都是本领域人员所熟知的。

在本发明的优选实施方式中，将所述的不饱和脂肪酸与BSA混合，来制备所述的组合物，在体内实现了优异的技术效果。

本发明还提供了一种防治爱德华氏菌感染的方法，包括步骤：给需要的对象(鱼类)施用有效量的长链不饱和脂肪酸(或其类似物或它们的异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物或前体)。活性成分的给药量是对于预防和治疗有效量的，该有效量通常约10ng-1mg/kg动物体重。当然，具体剂量还应考虑施用途径等因素。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

1、菌种和质粒

本实施例所用到的菌种和质粒列在表1中。所有菌株-80℃保存于含20％甘油的LB培养基中。杀鱼爱德华氏菌的培养温度为30℃，大肠杆菌的培养温度为37℃。无特殊说明时液体培养所采用摇床转速为200rpm。当需要时，在培养基中添加抗生素：多粘菌素(polymyxin，Col，16μg/ml)、羧苄青霉素(Carbenicilin，Carb，24μg/ml)、卡那霉素(kanamycin，Km，50μg/ml)。DMEM培养基购自Gibco公司。

表1、菌株和质粒

2、主要试剂及缓冲液的配制

棕榈酸(palmitate)购自Sigma；棕榈油酸(palmitoleate)购自Sigma；油酸(oleate)购自Sigma；硬脂酸(stearate)购自Sigma。

抗生素溶液配制：抗生素粉末溶于去离子水中或者无水乙醇中，用0.22μm滤膜过滤除菌(Millipore，Germany)，分装于EP管中，-20℃储存备用。硫酸多粘菌素(PolymyxinB，Inalco)、卡那霉素(Kanamycin，Inalco)以及羧苄青霉素(Carbenicilin，Inalco)溶于水，储存液浓度16mg/ml、50mg/ml、50mg/ml，稀释1000倍后作为工作浓度使用。氯霉素(Chloromycetin，Inalco)75mg/ml母液浓度溶于无水乙醇，分装于EP管中，-20℃储存备用。氯霉素稀释3000倍作为工作浓度使用。注意氯霉素有剧毒。

LB：按酵母粉5g/l，胰蛋白胨10g/l，NaCl 10g/l称取各组分，加入去离子水后用10mol/l NaOH调pH至7.0，并用去离子水定容。混匀后121℃高压蒸气灭菌25min。

LB固体琼脂：按酵母粉5g/l，胰蛋白胨10g/l，NaCl 10g/l，琼脂15g/l称取各组分，加入去离子水后用10mol/l NaOH调pH至7.0，并用去离子水定容。混匀后121℃高压蒸气灭菌25min。

10×TAE缓冲液：将242g Tris碱溶于600ml双蒸水中，加入57.1ml冰乙酸和37.2g的Na₂EDTA·2H₂O，定容至1000ml。使用前稀释10倍。

1.0％琼脂糖凝胶：称取1.0g琼脂糖溶于100ml 1×TAE缓冲液中，在微波炉中加热2min左右，待琼脂糖完全溶解后迅速倒入制胶台，冷却15分钟后即可点样电泳。

5×TBE缓冲液：Tris碱54g，硼酸27.5g，EDTA 4.12g，溶于1000ml超纯水。

6％聚丙烯酰胺非变性凝胶：超纯水9.63ml，50％甘油0.75ml，5×TBE缓冲液1.5ml，30％AB液3ml，10％APS 0.11ml，TEMED 0.01ml。

PBS(1L)：8.0g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na₂HPO₄，0.24g KH₂PO₄，加1L去离子水混匀。

PBST(1L)：8.0g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na₂HPO₄，0.24g KH₂PO₄，加1L去离子水混匀，再加入500μl Tween-20，混匀。

封闭液：10％脱脂奶粉溶解于PBST。

电转缓冲液(1L)：3.03g Tris碱，14.4g甘氨酸，800ml去离子水，充分溶解后加入200ml无水甲醇再混匀。

动物实验用脂肪酸溶液配制：棕榈酸，棕榈油酸，油酸，以及硬脂酸均购至于Sigma。将脂肪酸溶解于10％BSA的PBS中，按照与脂肪酸摩尔数比1:1加入KOH，配置母液浓度10mM。存储于-20℃配用。

3、菌株构建

(1)esrC框内缺失株(ΔesrC)构建

本实验中，采用pDMK(pDM4质粒***了卡那抗性基因而成)构建框内无标记缺失株。

抽提pDMK质粒，用SalI/XbaI于37℃水浴中进行酶切1～1.5小时。酶切后的质粒进行DNA琼脂凝胶电泳分离，选取8,700bp大小条带，割胶回收，回收后的线性DNA放置于-20℃备用。

粗提菌株E.piscicida EIB202基因组，以之为模板，分别用引物对P1/P2引物对和P3/P4引物对扩增目的基因上下游片段，纯化回收。再用P1/P4引物对进行Overlap-PCR，将上下游片段连接在一起。将连接的上下游DNA和酶切后的pDMK按照摩尔数3:1混合后加入ITA Mix，于50℃水浴1小时，转入DH5αλpir，涂氯霉素LB琼脂板。平板放入37℃培养箱过夜培养。挑12-24个单克隆，接入LB，37℃，200rpm，2-5h，用通用引物对pDMK-F/pDMK-R验证。阳性克隆接种到新鲜LB中，37℃，200rpm，过夜。抽质粒，测序。测序正确的质粒转SM10λpir，保种。将SM10λpir和EIB202进行接合实验，接合后的菌液涂氯霉素和多粘菌素LB琼脂平板，30℃培养24h左右。取4个单克隆，用引物对pDMK-F/Out-R和引物对pDMK-R/Out-F验证单交换，挑选阳性，分别接种氯霉素和多粘菌素LB保种和12％蔗糖LB，诱导12h，sacB反向筛选。取诱导后的菌液稀释10³～10⁵，涂12％蔗糖LB琼脂板，30℃，24h。双交换后，挑取周围没有雾圈的单克隆24-48个，用Out-F/Out-R引物验证。阳性克隆再次用引物对Out-F/Out-R和In-F/In-R引物验证。

P1引物：cccccccgagctcaggttacccggatctatGCTGCTGGAGGGCATCAGC(SEQ ID NO:1)

P2引物：ACCGTGTTTACATGAGGTGCTCCTGACTGA(SEQ ID NO:2)

P3引物：GCACCTCATGTAAACACGGTAAGGAGCCT(SEQ ID NO:3)

P4引物：gagtacgcgtcactagtggggcccttctagAGTCCGAAGAGCAGAATGGC(SEQ ID NO:4)

通用引物pDMK-F：CTAGAAGGGCCCCACTAGTG(SEQ ID NO:5)

通用引物pDMK-R：ATAGATCCGGGTAACCTGAGC(SEQ ID NO:6)

Out-F引物：CCATCGACGGCGATTTTCAG(SEQ ID NO:7)

Out-R引物：CCTGCGGCGCGTTCATCAGG(SEQ ID NO:8)

In-F:CCAGACAACATCGCGCTCC(SEQ ID NO:9)

In-R:GCAGTAGCCAGCGTTTCGG(SEQ ID NO:10)

(2)esrC回补菌株以及eseB启动子驱动荧光素酶基因(luxAB)报告质粒构建

本实验中，采用pUTt质粒构建回补表达质粒。

质粒pUTt的图谱如图4。抽提pUTt质粒，用HindIII/EcoRI于37℃水浴中进行酶切，1-1.5小时。酶切后的质粒进行DNA琼脂凝胶电泳分离，选取2,700bp大小条带，割胶回收，回收后的线性pUTt质粒放置于-20℃备用。

分别扩增eseB启动子(扩增***鱼爱德华氏菌基因组)、荧光素酶基因(luxAB)，进行DNA凝胶电泳，分别将eseB启动子片段/luxAB片段和酶切后线性化的pUTt载体按照摩尔数3:1混合后加入ITA Mix(Gibson assembly，Gene Company Limited)，于50℃水浴1小时，转入DH5αλpir，涂羧苄青霉素LB琼脂板。平板放入37℃培养箱过夜培养。挑12～24个单克隆，接入LB，37℃，200rpm，2-5h，用通用引物pUTt-F/pUTt-R验证。阳性克隆接种到新鲜LB中，37℃，200rpm，过夜。抽质粒，测序。获得pUTt-P_eseB-luxAB。

(3)esrC^R38G、esrC^H39G、esrC^F43G的构建

esrC点突变回补菌株的构建同(2)。设计引物EsrC-R38G-R/EsrC-R38G-F，EsrC-H39G-R/EsrC-H39G-F，EsrC-F43G-R/EsrC-F43G-F，扩增点突变片段，克隆到pUTt载体上。获得点突变质粒后转入ΔesrC，构建点突变菌株。

(4)荧光素酶检测

将甘油菌接入新鲜LB液体培养基，37℃，200rpm，过夜培养。按照1％OD₆₀₀菌量将菌株接入DMEM培养基，于28℃静置培养。在不同时间点，取200μl菌液加入到底透黑边的96-孔板，每个样本做三组操作重复。先使用Microplate Reader(Bio-Tek)测定96-孔板OD₆₀₀吸光值，再用化学发光仪(Microplate Luminometer)，加入40μl 1％癸醛(溶解于纯酒精)作为底物、测量荧光素酶表达量。

(5)免疫印迹杂交(Western blotting)

电泳结束后取下胶条，浸泡于电转缓冲液中。根据目的区域胶条大小裁剪相应大小的PVDF膜和滤纸，将PVDF膜依次在无水甲醇中浸泡15-30s，去离子水中浸泡2min以及电转缓冲液中浸泡5min以上。按负极黑色碳板、纤维、2层滤纸、蛋白胶、PVDF膜、2层滤纸、纤维、正极白色碳板的顺序依次铺放电转装置。电转过程在冰水浴中进行，电压100V，电转时间(min)大概是目的蛋白分子量(kDa)值的2倍。电转结束后取下PVDF膜至封闭液中封闭1～2h，75rpm、37℃。按1:1000比例用封闭液稀释EseB和DnaK抗体，将PVDF膜转至一抗稀释液中，4℃过夜孵育或者75rpm、37℃封闭2～3h。用PBST洗PVDF膜，75rpm、37℃漂洗10min，重复3次。用封闭液按1:2000比例稀释羊抗鼠或者羊抗兔二抗，将PVDF膜转至二抗稀释液中，75rpm、37℃孵育1.5～2h。用PBST洗PVDF膜3次，每次10min。滴加显色液，曝光，用化学发光仪拍照。

(6)EsrC蛋白表达纯化

将EsrC克隆入pET28b-HisSUMO的BamHI/XhoI位点中，获得pET28b-HisSUMO-EsrC。

将表达菌株pET28b-HisSUMO-EsrC在50ml LB培养基过夜培养，接二级种，二级种摇至OD＝0.6-0.8左右，加入0.2mM IPTG诱导，25℃诱导，诱导时间12-18小时。

破碎前菌体的准备：菌液高速5000g，30min离心，先用PBS将菌沉淀清洗重悬，放入50ml离心管，5000g离心15min，弃上清。将菌体用缓冲液(20mM Tris pH 9.0，1mM EDTA，500mM NaCl)重悬，重选至菌体均匀分散无结块形成。

高压破碎：破碎前将仪器预冷至10℃以下。800-900bar破菌3-5次至菌液成半透明状态。采用耐高压离心管，4℃，13000g离心30min，取上清置于冰上，备用。蛋白样品经Ni柱分离纯化，获得纯化的融合蛋白HisSUMO-EsrC。融合蛋白中加入ULP1切割HisSUMO蛋白标签。酶切后的蛋白混合物再次过Ni柱，分离得到单一的EsrC蛋白。

(7)凝胶迁移阻滞实验(EMSA)

取5×TBE缓冲液，用超纯水稀释十倍，为0.5×TBE缓冲液，120V预电泳1～2h，预电泳后吹孔以除去碎胶块。反应体系20μl：启动子片段10ng，poly(dI-dC)250ng，梯度浓度蛋白，蛋白自身缓冲液补足20μl。上述体系于25℃条件下反应30min后上样。于冰水浴中100V电泳2h。电泳结束后用Typhoon FLA9500扫描拍照。

(8)斑马鱼毒力实验

EIB202野生株以及ΔesrC接LB培养基，过夜培养，二级种接DMEM，于28℃静止培养。5000g离心4min收集菌体，用无菌PBS洗涤菌体3次，并分别稀释到100CFU/μl。以肌肉注射方式向每尾鱼注射5μl稀释菌液，同时以每尾肌肉注射5μl PBS的斑马鱼作为对照。每组设15尾鱼。攻毒后12h观察并且记录实验组和对照组的发病及死亡情况，及时清理死鱼并换水。最后统计每组鱼的存活及死亡情况，绘制存活。

实施例1、证明UFA可以抑制EsrC结合DNA

1、荧光素酶水平测定测定长链不饱和脂肪酸处理对T3SS的影响

将构建好的荧光素酶质粒pUTt-P_eseB-luxAB，转入杀鱼爱德华氏菌野生型菌株(WT)中，作为报告菌株。

培养基培养上述菌株，在培养基中分别加入不同浓度(0.025％，0.050％，0.100％；百分数为质量比)的棕榈酸(palmitate)，棕榈油酸(palmitoleate)，油酸(oleate)，以及硬脂酸(stearate)，培养到12h，检测荧光素酶的表达水平。以pUTt-luxAB转入WT作为阴性对照。

结果如图1A，可见，给予棕榈油酸或油酸处理的细菌培养物，荧光素酶表达水平发生显著性下降，说明棕榈油酸或油酸显著抑制了T3SS表达。

2、免疫印迹杂交测定长链不饱和脂肪酸处理对EseB表达水平的影响

将野生型爱德华氏菌E.piscicida EIB202培养于DMEM培养基，在培养基中分别加入不同浓度的棕榈酸(终浓度0.100％)，棕榈油酸(终浓度0.100％)，油酸(终浓度0.100％)，以及硬脂酸(终浓度0.100％)，pUTt-luxAB转入WT作为阴性对照。培养24h后收集菌体，以抗EseB抗体和抗DnaK抗体(内参)进行免疫印迹杂交。Anti-DnaK用作内参。

如图1B，结果显示，给予棕榈油酸或油酸处理的细胞培养物，EseB的水平显著下降。EseB是T3SS主要的元件蛋白，可以反映T3SS的表达水平。因此表明，棕榈油酸或油酸能够极为显著地影响爱德华氏菌感染宿主所必需的毒力相关系统三型分泌系统(T3SS)。

3、凝胶迁移阻滞实验(EMSA)验证UFA对于EsrC与DNA结合的影响

本发明人构建了带有野生型EsrC及其突变体EsrC^R38G、EsrC^F43G的蛋白表达菌株(esrC^R38G，esrC^F43G)。EsrC蛋白和Cy5荧光标记的esrB启动子部分DNA共孵育，进行EMSA实验。

结果如图1C所示，在不加入油酸时EsrC可以正常结合DNA。当加入UFA(包括棕榈油酸或油酸，浓度分别为0.01％(质量比))影响了EsrC与DNA结合，但是EsrC点突变蛋白EsrC^F43G和EsrC^R38G不受脂肪酸的影响。

4、免疫印迹杂交测定长链不饱和脂肪酸处理对EsrC^R38G的影响

本发明人构建了野生型及EsrC突变的爱德华氏菌菌株esrC^R38G、esrC^H39G、esrC^F43G。点突变回补菌株分别在加入或者不加入油酸(0.100％终浓度)的DMEM培养基中培养。培养24h后收集菌体，以抗EseB抗体和抗DnaK抗体(内参)进行免疫印迹杂交。Anti-DnaK用作内参。

如图1D，结果显示，给予油酸处理的野生型细胞培养物，EseB的水平显著下降；esrC^F43G菌株在给予或不给予油酸情况下均不表达EseB；esrC^R38G菌株在给予或不给予油酸情况下均表达EseB。EseB是T3SS主要的元件蛋白，可以反映T3SS的表达水平。因此表明，esrC^R38G不受脂肪酸的影响。

5、脂肪酸和EsrC相互作用

本发明人利用软件模拟，模拟了脂肪酸和EsrC相互作用，如图1E所示，脂肪酸和EsrC相互作用的位点存在于EsrC蛋白的ARG-38和PHE-43位也是相互作用位点。

实施例2、动物水平的有效性验证

1、针对大菱鲆的有效性验证

对大菱鲆腹腔注射PBS、爱德华氏菌混合BSA(WT+BSA)、爱德华氏菌混合不饱和脂肪酸(WT+UFA)、爱德华氏菌esrC缺失株(ΔesrC)，每组15尾，连续观察记录大菱鲆的死亡情况。

用PBS将爱德华氏菌稀释到10⁴CFU/ml，同时分别混入100μM UFA(母液：10mM UFA溶解在5％BSA的PBS中)和0.05％BSA，然后注射剂量100μl注射进入体重为30±3g的健康大菱鲆腹腔。

动物毒力实验证实，同时注射100μM UFA的大菱鲆死亡数量显著少于对照组。该数据说明UFA可以显著保护宿主免受爱德华氏菌的毒害。

结果如图2，野生型爱德华氏菌给予大菱鲆使得鱼在短期内大量死亡，给予大菱鲆爱德华氏菌esrC缺失株(ΔesrC)的鱼存活良好，给予野生型爱德华氏菌且给予UFA的鱼也存活良好。相对于未注射UFA的大菱鲆，注射UFA的大菱鲆死亡率低于20％，说明UFA能够有效地保护大菱鲆免受爱德华氏菌引起的毒害。

除了油酸，申请人也以同样的工作浓度，将棕榈油酸替换油酸适用于大菱鲆，结果产生与油酸同样的效果。

因此，UFA能够有效地关闭爱德华氏菌毒力表达，使爱德华氏菌失去感染宿主的能力，极为显著地保护了鱼免受爱德华氏菌的伤害。

2、针对斑马鱼的有效性验证

对斑马鱼(斑马鱼重0.5-1g)肌肉注射PBS、爱德华氏菌混合BSA(WT+BSA)、爱德华氏菌混合不饱和脂肪酸(WT+UFA)、爱德华氏菌esrC缺失株(ΔesrC)，UFA(油酸)工作浓度为100μM。记录斑马鱼的死亡情况。注射量500CFU细菌；不饱和脂肪酸(UFA)预先溶于5％BSA的PBS中。

结果如图3，野生型爱德华氏菌给予斑马鱼使得鱼在短期内大量死亡，给予斑马鱼爱德华氏菌缺失株(ΔesrC)的鱼存活良好，给予野生型爱德华氏菌且给予UFA的鱼也存活良好。

除了油酸，申请人也以同样的工作浓度，将棕榈油酸替换油酸适用于斑马鱼，结果产生与油酸同样的效果。

因此，UFA极为显著地保护了鱼免受爱德华氏菌的伤害。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 长链不饱和脂肪酸在制备预防爱德华氏菌的组合物中的应用

<130> 182512

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

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<212> DNA

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<400> 1

cccccccgag ctcaggttac ccggatctat gctgctggag ggcatcagc 49

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