阅读说明：本技术 富马酸二甲酯dmf在调节肿瘤代谢、抑制肿瘤生长方面的应用 (Application of dimethyl fumarate DMF in regulating tumor metabolism and inhibiting tumor growth ) 是由 殷雷 雷骏 方嘉凌 杨怡 李永征 于 2020-01-02 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物技术及医学领域,具体涉及富马酸二甲酯DMF在调节肿瘤代谢、抑制肿瘤生长方面的应用。本发明首次发现小分子抑制剂DMF调控肿瘤代谢从而抑制肿瘤生长方面的应用；DMF可以在体外抑制多种肿瘤细胞的增殖并降低肿瘤细胞代谢,在体内对肿瘤的发生发展具有一定的抑制作用；通过抑制肿瘤代谢,改善肿瘤酸性微环境降低对T细胞功能的抑制,提高T细胞反应性,增强免疫治疗的效率,为肿瘤治疗提供新靶点和新思路。(The invention belongs to the field of biotechnology and medicine, and particularly relates to application of dimethyl fumarate DMF in regulation of tumor metabolism and inhibition of tumor growth. The invention discovers the application of a small molecular inhibitor DMF in the aspect of regulating and controlling tumor metabolism so as to inhibit tumor growth for the first time; DMF can inhibit the proliferation of various tumor cells in vitro and reduce the metabolism of the tumor cells, and has certain inhibiting effect on the generation and development of tumors in vivo; by inhibiting tumor metabolism, the tumor acidic microenvironment is improved, the inhibition of T cell functions is reduced, the T cell reactivity is improved, the immunotherapy efficiency is enhanced, and a new target and a new thought are provided for tumor therapy.)

富马酸二甲酯DMF在调节肿瘤代谢、抑制肿瘤生长方面的应用

技术领域

本发明属于生物技术及医学领域，具体涉及富马酸二甲酯DMF在调节肿瘤代谢、抑制 肿瘤生长方面的应用。

背景技术

新陈代谢是机体生命活动的基本特征，是细胞获得能量的最重要方式。在肿瘤发生发展 过程中，能量代谢常出现紊乱，造成肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)的变化，帮助 肿瘤细胞得以生存、转移及免疫逃逸。研究已经证实，在某些肿瘤中，由于肿瘤处于乏氧的 微环境中，以糖酵解作用作为主要的能量代谢方式。上世纪30年代，OttoWarburg博士发现， 在O₂充足的条件下，肿瘤细胞仍依赖有氧糖酵解产能。这种肿瘤细胞即使在有氧情况下也 不利用线粒体氧化磷酸化产能，转而利用糖酵解产能的现象称为瓦博格效应(Warburg effect) 或者称作有氧糖酵解。很多肿瘤细胞通过增强糖酵解途径消耗葡萄糖产生乳酸和ATP，研究 表明：在小鼠肾癌模型中，肿瘤代谢活性和激活与T细胞的浸润呈负相关性；在黑色素瘤和 非小细胞肺癌患者中，肿瘤代谢活性增强，导致T细胞的不良浸润。并且，肿瘤有氧糖酵解 刺激粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的表达， 招募骨髓源抑制细胞(MDSC)进入TEM，抑制免疫细胞的抗肿瘤应答的能力。

TME是肿瘤存在的细胞环境，包括周围血管、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)、 其他非恶性细胞以及信号分子3,4。具体表现为低氧、低pH、低糖等特征。肿瘤微环境中存 在大量的生长因子，细胞趋化因子和各种蛋白水解酶所产生的免疫炎性反应分子，这些特性 有利于肿瘤的增殖、侵袭、粘附、血管生成以及抵抗放射治疗及化疗，促使肿瘤存活、增殖 及转移。肿瘤微环境对于肿瘤的生长、转移与免疫逃逸等行为密切相关，肿瘤的弱酸、乏氧、 免疫抑制等微环境特征也是导致临床抗肿瘤治疗耐受的一个重要原因。研究表明，肿瘤有氧 糖酵解对肿瘤的治疗有一定的影响，如：肿瘤的有氧糖酵解引起化学治疗和放射治疗的治疗 性抵抗等。因此，TME被认为是成功治疗肿瘤的最大障碍之一。肿瘤的有效治疗需要克服 TME的障碍。

肿瘤中除了肿瘤细胞外，还有各种非癌细胞，包括成纤维细胞、血管内皮细胞和免疫细 胞，包括T细胞、巨噬细胞和中性粒细胞，其发挥的功能各有不同。初始T细胞依赖氧化磷 酸化维持能源需求；当初始T细胞接受抗原刺激后，经过增殖，分化形成效应T细胞。T细胞的快速复制和细胞因子的分泌，增加了对生物能量和合成代谢的需求。为了应对这些需求， 活化的T细胞通过增强糖酵解作用，谷氨酰胺的分解以及支链氨基酸的分解代谢等途径增加 了葡萄糖和氨基酸的摄取和利用。葡萄糖是T细胞和M1型巨噬细胞的关键底物，其发挥抗 肿瘤作用依赖有氧糖酵解来维持激活状态和效应功能。肿瘤微环境中营养和O₂的平衡控制 着免疫细胞的功能。并且，在肿瘤微环境中，肿瘤细胞和免疫细胞处于代谢竞争的关系。肿 瘤细胞和增殖活化的T细胞共享类似的代谢途径以及关键底物。然而，肿瘤细胞快速消耗葡 萄糖和氨基酸，剥夺了免疫细胞维持效应功能的营养物质。灌注不良的肿瘤区域引起肿瘤细 胞和T细胞的乏氧应答。在乏氧或其他机制下，HIF-1α的活性增加，促进糖酵解作用，抑制 代谢物的浓度增加并导致局部环境的酸化。乳酸进一步分泌到肿瘤细胞外引发肿瘤酸性微环 境，进一步损害T细胞的功能。Warburg效应是肿瘤特有的代谢方式，快速分裂的肿瘤表现 出高水平的有氧糖酵解能力，迅速消耗周围环境的葡萄糖。因此，肿瘤细胞的这种异常的代 谢方式，剥夺了T细胞的营养物质，抑制了T细胞的免疫代谢，削弱了T细胞的糖酵解代谢 作用，使T细胞分泌的细胞因子减少，最终导致效应T细胞转变为无效细胞。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供富马酸二甲酯DMF在调节肿瘤代谢、抑制 肿瘤生长方面的应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

富马酸二甲酯DMF在制备用于调控肿瘤代谢药物中的应用。

富马酸二甲酯DMF在制备用于抑制肿瘤生长药物中的应用。

富马酸二甲酯DMF在制备用于提高T细胞反应性药物中的应用。

富马酸二甲酯DMF在制备用于增强肿瘤免疫治疗效率药物中的应用。

富马酸二甲酯DMF在制备用于降低IL-2治疗肿瘤副反应药物中的应用。

富马酸二甲酯DMF和IL-2药物组合物在制备用于抑制肿瘤生长药物中的应用。

本发明的有益效果：本发明首次发现小分子抑制剂DMF调控肿瘤代谢从而抑制肿瘤生 长方面的应用；DMF可以在体外抑制多种肿瘤细胞的增殖并降低肿瘤细胞代谢，在体内对肿 瘤的发生发展具有一定的抑制作用；通过抑制肿瘤代谢，改善肿瘤酸性微环境降低对T细胞 功能的抑制，提高T细胞反应性，增强免疫治疗的效率，为肿瘤治疗提供新靶点和新思路。

附图说明

图1为实施例1中利用DMF抑制多种肿瘤细胞的增殖过程。

图2为实施例2中利用DMF调节多种肿瘤细胞的代谢过程。

图3为实施例3中利用DMF抑制荷瘤小鼠体内肿瘤生长。

图4为实施例4中利用生物信息分析GAPDH在肿瘤组织标本中的表达差异以及与患者 预后的负相关性。

图5为实施例5中利用DMF改善肿瘤微环境后对免疫相关细胞的增殖和正常功能的改 善。

图6为实施例6中利用结构生物学技术解析DMF抑制GAPDH酶活的结构机制。

图7为实施例7中利用DMF降低IL-2治疗肿瘤过程中产生的副反应。

图8为实施例8中利用DMF联合IL-2疗法抑制荷瘤小鼠体内肿瘤生长。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不 仅仅局限于下面的实施例。

实施例1利用DMF抑制多种肿瘤细胞的增殖过程

以MTT实验测定不同浓度DMF对4T1乳腺癌细胞和CT26结肠癌细胞增殖的抑制作用， 包括如下步骤：

(1)取对数生长期的细胞，消化后用血球计数板计数；

(2)向96孔板中加入1×10⁴个细胞，每孔100μL；贴壁2～4h后加入不同浓度的DMF处理24h或48h；

(3)每个孔内加入10μL CCK8试剂，24或48小时后用酶标仪检测450nm处每个孔的吸 光度；

(4)绘制标准曲线并计算不同浓度DMF对肿瘤细胞增殖的抑制作用。

按照上述方法的得到的DMF对肿瘤细胞增殖的抑制作用如图1所示。图1结果显示：我 们在体外用DMF处理4T1乳腺癌细胞和CT26结肠癌细胞，发现可以抑制肿瘤细胞的增殖。

实施例2利用DMF调控多种肿瘤细胞的代谢过程

以不同浓度的DMF处理4T1乳腺癌细胞和CT26结肠癌细胞，检测其细胞外乳酸释放水平以及细胞内ATP和ROS水平。

乳酸释放检测：

将5×10⁵的肿瘤细胞接种在6孔板的每个孔中，DMF处理48小时。收集细胞培养基，用乳酸检测试剂盒检测乳酸含量。

细胞内ATP水平检测：

将5×10⁵的肿瘤细胞接种在6孔板的每个孔中，DMF处理48小时。收集细胞培养基，用ATP检测试剂盒检测ATP含量。

细胞内ROS水平检测：

(1)检测前一天铺板，种一定密度的细胞于6孔板，DMF处理48小时；

(2)弃去旧培养基，用无血清培养基清洗两次；

(3)探针装载前按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使其终浓度为10μM；

(4)加入适当体积稀释好的DCFH-DA工作液，37℃细胞培养箱内避光孵育30min；

(5)用无血清培养液洗涤细胞1～2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA；

(6)胰酶消化细胞，完全培养基终止消化，1,000rpm，3min，去掉培养基和胰酶，流式 上机检测；

按照上述方法得到的实验结果如图2所示，我们在体外用DMF处理4T1乳腺癌细胞和 CT26结肠癌细胞，对肿瘤细胞能量代谢进行分析，检测乳酸分泌，ATP生成和活性氧水平。 结果提示：DMF处理肿瘤细胞后，细胞外乳酸分泌量下降即糖酵解能力下降(图2A)，但是ATP水平上升即氧化磷酸化能力有所恢复，同时活性氧水平上升(图2B)。

实施例3利用DMF抑制荷瘤小鼠体内肿瘤生长

建立对应的小鼠肿瘤模型，待肿瘤大小约100～200mm³时后将小鼠随机分为对照组和实 验组。

A.对照组：静脉注射PBS，每天注射，持续7周；

B.DMF靶向治疗组：静脉注射负载DMF的自组装纳米多肽，每天注射，持续7周；

每隔两天测量一次肿瘤体积，计算公式：V＝1/2×L×W²，L为肿瘤最长径，W为 肿瘤最短径。同时检测小鼠体重变化。

按照上述方法得到的实验结果如图3所示。建立小鼠肿瘤模型，待肿瘤长至一定大小后 开始给药。结果提示：DMF对4T1乳腺癌和CT26结肠癌有一定的抑制作用(图3A)和(图3C)。

实施例4利用生物信息分析GAPDH在肿瘤组织标本中的表达差异以及与患者预后的 负相关性

我们利用Kaplan-Meier Plotter、癌症基因组计划(TCGA)在线数据库对GAPDH在不 同肿瘤组织及癌旁组织中的转录本进行深入细致的分析，并更进一步地通过Kaplan-Meier log rank方法分析GAPDH转录本与乳腺癌患者预后的相关性。

按照上述方法的得到的表达差异和预后负相关性如图4所示。如图4A所示，GAPDH在 不同类型肿瘤中的转录本具有表达差异。患者肿瘤组织中GAPDH的表达量显著高于其癌旁 组织。在乳腺癌和结肠癌患者样本中，GAPDH在两者之间具有表达差异(图4B)。通过Kaplan-Meier log rank生存分析法对1402例乳腺癌患者的生存情况进行分析，结果如图4C 所示：GAPDH^Low与GAPDH^High的乳腺癌患者的术后生存情况具有显著的差异(P＝0.027)。以上结果提示GAPDH的异常高表达在乳腺癌的发生发展过程中，可能发挥着一定的作用。

实施例5

利用环境中不同浓度的乳酸浓度模拟不同浓度DMF对肿瘤微环境的改善作用。模拟分 析改善后的肿瘤微环境中相关免疫细胞的增殖能力以及相关细胞因子的分泌能力，为利用 DMF结合肿瘤免疫治疗提供新思路。

1.乳酸对T细胞增殖的影响

(1)配置含0mM、10mM、20mM乳酸浓度的1640培养基；

(2)分离原代CD8 T细胞；

(3)CFSE染色；

(4)CD3、CD28抗体刺激T细胞增殖72h；

(5)流式上机检测。

2.乳酸对T细胞分泌细胞因子的影响

(1)配置含0mM、10mM、20mM乳酸浓度的1640培养基；

(2)分离原代CD8 T细胞；

(3)CD3、CD28抗体刺激T细胞增殖72h；

(4)在不同浓度乳酸条件下，加入PMA和离子霉素非特异性激活T细胞；

(5)流式上机检测。

3.肿瘤浸润淋巴细胞功能分析：

(1)建立小鼠肿瘤模型，当肿瘤大小约100～200mm³时，对实验动物进行分组。对照组： 灌胃vehicle(0.8％的甲基纤维素)；药物治疗组：DMF 30mg/kg灌胃治疗；

(2)无菌条件下取出肿瘤组织，充分剪碎，置于含0.5μg/mL的胶原酶Ⅳ溶液中；

(3)37℃，消化1h；

(4)40～70％的Percoll分离液分离免疫细胞；

(5)将离心机升降速设为1，于25℃，800g条件下，离心30min，离心后可见明显的白色层，即淋巴细胞层，小心吸取淋巴层细胞；

(6)用PBS将分离的肿瘤浸润淋巴细胞清洗两次；

(7)根据实验情况进行细胞表面染色，细胞因子染色；

(8)用0.5mL PBS重悬固定细胞，上机检测分析IFN-γ⁺CD8⁺ T细胞和TNF-α⁺CD8⁺ T细 胞的变化。

按照上述方法得到的实验结果如图5所示，不同浓度的乳酸环境模拟了不同浓度DMF 对肿瘤微环境的改善作用。乳酸可以抑制CD8 T细胞的增殖和相关细胞因子的分泌(图5(a), 图5(b))。DMF可以降低肿瘤微环境中乳酸的浓度，从而改善CD8 T细胞的增殖和细胞因子 分泌。DMF可以结合肿瘤免疫疗法起到治疗肿瘤的作用。在对荷瘤小鼠注射DMF后，可以 有效改善小鼠体内的肿瘤微环境，抑制肿瘤细胞代谢，从而提高肿瘤浸润淋巴细胞的效应功 能。结果表明：降低肿瘤代谢后，肿瘤浸润T淋巴细胞具有更强的分泌细胞因子的能力(图 5(c))。

实施例6

利用结构生物学技术解析DMF抑制GAPDH酶活的结构机制：

蛋白质晶体的培养，通常以蒸汽扩散法(Vapor Diffusion Method)为主。该方法主要包 括两种技术：悬滴蒸汽扩散和坐滴蒸汽扩散。本课题选择坐滴法(sitting drop)初筛蛋白质晶体 条件，将等体积蛋白质溶液与结晶试剂混合，然后封闭于高浓度溶剂环境中，利用气相平衡 的原理，使挥发性的组分在小液滴和大样品池之间达到平衡，蛋白质溶液浓度相对较低，体 系中的水扩散至高浓度的溶剂中，蛋白质液滴中沉淀剂及蛋白浓度逐渐增加，在过饱和状态 产生晶核，最终析出晶体。

蛋白样品的准备

(1)利用大肠杆菌表达系统，表达纯化GAPDH；

(2)将蛋白浓缩至10mg/mL，4℃，12,000rpm离心，除去沉淀；

结晶条件初筛

(3)使用晶体筛选机器人Rorbot，对1000种结晶条件进行初步筛选，结晶孔中蛋白和池 液的含量为0.1μL：0.1μL，并在显微镜下观察结晶情况；

结晶条件优化

(4)由于机器人初筛所需的蛋白溶液和池液的混合液体积较小，把初筛的结晶条件进行 重复，并等比扩大蛋白溶液与池液的含量。在初筛结晶条件附近，分别对温度、pH梯度、 盐离子浓度、沉淀剂浓度等进行二维梯度细化，最终确定最优的结晶条件。

X射线衍射数据的收集和处理

(5)本实验将于上海同步辐射光源(SSRF)BL17U进行X射线衍射。关于数据处理，目前主流的软件有：HKL2000/3000,iMosflm,XDS.本研究将使用HKL2000/3000和iMosflm处理数据。

结构解析和修正

(6)本实验将使用分子置换的方法解析结构。使用HKL2000/3000处理完衍射数据后，可 直接进行后续结构解析，使用iMosflm处理衍射数据后，还需CCP4i进行进一步数据处理。 将处理完的数据导入Phaser进行分子置换，填写相关参数，运行软件，并在此基础上用Coot 手动进行结构模型搭建，在使用Phenix.refine修正结构，以得到符合要求的结构模型。

我们将得到的蛋白晶体在上海同步辐射光源(SSRF)BL17U进行X射线衍射。关于数据处理，目前主流的软件有：HKL2000/3000,iMosflm,XDS。我们使用HKL2000/3000和iMosflm处理数据。我们使用分子置换的方法解析结构。使用HKL2000/3000处理完衍射数据后，可直接进行后续结构解析，使用iMosflm处理衍射数据后，还需CCP4i进行进一步数据处理。随后，我们将处理完的数据导入Phaser进行分子置换，填写相关参数，运行软件，并在此基础上用Coot手动进行结构模型搭建，在使用Phenix.refine修正结构，以得到符合要 求的结构模型。

我们解析了DMF与全酶的晶体结构，明确DMF与GAPDH的结合区域，如图6A,B所 示。我们可以看到，四聚的酶蛋白GAPDH，有三条链上，每一个亚基都结合一个DMF，DMF 位于GAPDH的底物NAD⁺附近。DMF占据了底物和GAPDH结合的位置。

我们对DMF(红色)和底物G3P(绿色)结合GAPDH的区域进行分析。结果如图6C 显示：DMF，G3P与GAPDH的结合区域几乎完全一致，其与GAPDH相互作用的残基也大 致一致。因此，我们认为：DMF可能占据了G3P与GAPDH的结合区域，导致G3P与GAPDH 不能有效结合，从而降低了GAPDH的酶活，进而降低了肿瘤细胞有氧糖酵解作用，导致其 快速分裂所需的合成生物大分子的反应底物和能量不足，最终抑制肿瘤的生长。

实施例7

利用DMF降低IL-2(人白细胞介素2)治疗肿瘤过程中产生的副反应：

注射IL-2是一种被FDA批准的治疗转移性黑色素瘤和肾癌的疗法，可以有效地激活T 细胞和促进其分泌相关细胞因子。但是IL-2治疗肿瘤具有严重的有毒副作用，如肺水肿等， 利用DMF可以在一定程度上降低其治疗肿瘤的副作用。

IL-2副作用缓解检测：

1、将正常小鼠随机分为4组：对照组，DMF组，IL-2组，IL-2+DMF组；

A.对照组：腹腔注射PBS，每天注射，持续六天；第2、4、6天灌胃0.8％甲基纤维素。

B.DMF组：第2、4、6天灌胃DMF，每只小鼠30mg/kg。

C.IL-2组：腹腔注射IL-2，每天注射，持续六天，每只小鼠10⁵U。

D.IL-2+DMF组：腹腔注射IL-2，每天注射，持续六，每只小鼠10⁵U；第2、4、6天灌 胃DMF，每只小鼠30mg/kg。

2、第7天处死小鼠，观察肺部变化并称重；

3、在65℃环境内烘干肺部3天，重新称重，前后肺部重量变化差值即为肺水肿重量。

按照上述方法得到的实验结果如图7所示，图7A显示了小鼠灌胃DMF和腹腔注射IL-2 的时间，在第7天处死小鼠观察其肺水肿情况。我们可以发现高浓度的IL-2可以导致严重的 肺水肿，而DMF可以显著缓解其肺水肿情况(图7B)。称量烘干前后肺部肿瘤可以发现DMF 处理的小鼠肺水肿减少(图7C)，有效地减少IL-2对小鼠产生的有毒副作用。

实施例8

DMF联合IL-2抑制荷瘤小鼠体内肿瘤生长

1、建立对应的小鼠肿瘤模型，待肿瘤大小约100～200mm³时后将小鼠随机分为4组：对 照组，DMF组，IL-2组，IL-2+DMF组；

A.对照组：建模后第21～26天腹腔注射PBS，每天注射；第7～20天和第22,24,26天每 天灌胃0.8％甲基纤维素；

B.DMF组：第7～20天和第22,24,26天每天灌胃DMF，每只小鼠30mg/kg；

C.IL-2组：建模后第21～26天腹腔注射IL-2，每天注射，每只小鼠10⁵U；

D.IL-2+DMF组：建模后第21～26天腹腔注射IL-2，每天注射，每只小鼠10⁵U；第7-20 天和第22,24,26天每天灌胃DMF，每只小鼠30mg/kg；

2、成功建立相关肿瘤模型后每隔2天测量肿瘤体积，计算公式：V＝1/2×L×W²，L为 肿瘤最长径，W为肿瘤最短径。

按照上述方法得到的实验结果如图8所示，图8A显示了小鼠灌胃DMF和腹腔注射IL-2 的时间，从第7天开始每隔2天观察记录小鼠肿瘤大小。结果显示：相比于对照组，DMF联合IL-2治疗可以显著抑制小鼠体内肿瘤的生长，并且相比于单一的IL-2治疗方法有更好的效果。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所 属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。 这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于 本发明创造的保护范围之内。