Bapta-am在制备镇痛药物中的应用
阅读说明：本技术 Bapta-am在制备镇痛药物中的应用 (Application of BAPTA-AM in preparing analgesic ) 是由 曹君利 杨俊霞 丁海雷 张红星 姜彦羽 于 2021-04-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种BAPTA-AM在制备镇痛药物中的应用,属于医药技术领域,所述的镇痛药物是抑制神经病理性疼痛的药物。本发明将BAPTA-AM定位注射于神经病理性疼痛小鼠前扣带回,可明显缓解疼痛。本发明采用行为学实验和分子生物学实验相结合的方法,充分证明BAPTA-AM具有明显镇痛作用。(The invention discloses an application of BAPTA-AM in preparing analgesic drugs, belonging to the technical field of medicines. The BAPTA-AM is injected into the anterior cingulum of a mouse with neuropathic pain in a positioning way, so that the pain can be obviously relieved. The invention adopts a method combining behavioral experiments and molecular biological experiments to fully prove that the BAPTA-AM has obvious analgesic effect.)
技术领域
本发明涉及一种BAPTA-AM在制备镇痛药物中的应用，属于医药技术领域。
背景技术
疼痛是机体受外界伤害性刺激引起的一种保护性反应，但在炎症、局部神经受压、外伤等伤害性刺激消除后，疼痛症状并不一定会消除，甚至会加重。神经病理性疼痛被公认是慢性痛之王，是临床最顽固的且对现有镇痛药几乎都不敏感的一类痛，无论周围或中枢起源的神经病理性疼痛都会对个体和社会持续造成很大的负担，尤其是在残疾率的增加、生产力和生活质量的下降以及持续增长的医疗卫生投入等方面。因此深入研究神经病理性疼痛发生、发展、维持的机制，可为该病痛的诊疗提供理论依据，为新药的研发寻找新的靶点。
临床和基础神经影像学证实前扣带回(anterior cingulated cortex，ACC)参与了疼痛调节过程。无论是伤害性刺激还是被告知可能会有伤害性刺激，均能激活ACC脑区。ACC参与处理疼痛的不愉快感受并促进疼痛相关情感、认知和反应的抉择，参与痛觉情绪信息的编码，将痛的感觉和认知信息与情绪信息联合，从而形成完整的痛觉体验。在神经病理性疼痛动物ACC区EPSCs频率和振幅均增高，申请人所在课题组研究表明，ACC神经元突触后膜的支架蛋白小窝蛋白1(Cav-1)介导的NMDA受体2B亚基转位(Trafficking)及其相关胞内信号通路在神经病理性疼痛ACC神经元高兴奋性和调节痛行为中发挥重要作用(Yang JX,et.al.,JNeurosci.2015)。从以上研究显示前扣带回在疼痛的调控中具有非常重要的作用。
研究显示在机体处于疼痛状态时前扣带回谷氨酸增加。细胞内钙离子增多实现突触小泡的胞吐以及神经递质释放。细胞内钙离子增多在神经递质释放中发挥重要作用。BAPTA-AM是一种细胞内钙离子螯合剂，目前研究显示荷载BAPTA-AM的脂质体可以通过清除细胞内钙超载缓解肝衰竭症状，BAPTA-AM的纳米颗粒可以用于治疗缺血再灌注所致的急性肾损伤。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种BAPTA-AM在制备镇痛药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的一种BAPTA-AM在制备镇痛药物中的应用。
作为改进，所述的镇痛药物是抑制神经病理性疼痛的药物。
作为改进，所述的药物是以BAPTA-AM为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的药剂。
作为改进，所述的药剂是注射制剂。
作为改进，所述的注射制剂含有BAPTA-AM溶液，用于注射给药。
作为改进，所述的BAPTA-AM溶液的浓度为1mM。
作为改进，采用的辅料为DMAO。
本发明的原理：神经病理性疼痛时，机体前扣带回谷氨酸释放增多，而谷氨酸的释放需要胞内钙离子的增多来触发和维持，通过在前扣带回给与钙离子螯合剂BAPTA-AM减少谷氨酸的释放，从而达到缓解疼痛的目的。
与现有技术相比，本发明将BAPTA-AM定位注射于神经病理性疼痛小鼠前扣带回，可明显缓解疼痛。本发明采用行为学实验和分子生物学实验相结合的方法，充分证明BAPTA-AM具有明显镇痛作用。
附图说明
图1为本发明中BAPTA-AM对CCI小鼠热痛觉行为学的影响(用热缩爪潜伏期表示)；
图2为本发明中BAPTA-AM定位注射于CCI小鼠前扣带回后谷氨酸释放的变化。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1
1.1本发明中使用的试剂：
BAPTA-AM；二甲基亚砜(DMSO)；平衡盐溶液:sigma公司。
谷氨酸检测试剂盒：上海起发实验试剂有限公司。
无特别注明外，其它化学试剂均购自sigma公司。
实验动物：雄性昆明种小鼠，清洁级，20～25g，由徐州医学院实验动物中心提供。
1.2神经病理性疼痛(CCI)模型的制备：
根据Bennett和Xie描述的方法实施CCI手术：小鼠用戊巴比妥那麻醉(40mg/kg,i.p.)，暴露右侧坐骨神经中上段(本研究均是结扎右侧坐骨神经)，在坐骨神经分叉处用5-0号丝线结扎三道(间距1mm)。对照组(sham)只暴露不结扎。逐层缝合切口，伤口用抗生素处理。以往的研究显示CCI引起的疼痛至少可持续数月。
1.3小鼠ACC区立体定位注射：
小鼠用戊巴比妥那麻醉(40mg/kg,i.p.)，固定在小鼠专用电子立体定位仪上，注意耳杆位置，固定两边耳杆深度为刚好听见清脆的咔嚓声，调整耳杆高度和两门牙高度在同一平面。剪毛，碘伏消毒头部皮肤，在两眼连线后正中0.5cm处剪开皮肤，用棉签蘸3％H2O2反复擦拭切口处，以破坏筋膜暴露颅骨，找到前囟点，调整针的位置在bregma前1.11mm，旁开0.25mm处，将0.5μl准备好的0.1％DMAO和含1mM BAPTA-AM的0.1％DMAO溶液用微量进样针缓慢注入到深2.10mm的位置(注射持续时间30秒)，留针10分钟，缓慢将针拔出，缝合皮肤，碘伏消毒，并在切口处涂上抗生素液体。整个过程至动物苏醒，室温保持在26℃左右。
1.4热痛觉过敏测定：
在sham及CCI组7天小鼠ACC区分别定位注射0.1％DMAO和含1mM BAPTA-AM的0.1％DMAO溶液，在注射前(0h)、注射后15min、0.5h、1h、2h、4h进行行为学检测，方法如下：将有机玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上，按Hargreaves法用热辐射刺激仪照射大鼠足底紧贴玻璃板部位。记录照射开始至小鼠出现抬足时间(截止时间为20s)，即缩爪潜伏期(pawwithdrawal latency)，缩爪潜伏期越长说明疼痛缓解作用越好。每只动物测定3次，取其平均值，每次测定间隔5min。结果显示BAPTA-AM在注射后15分钟起效，2h内具有明显的缓解疼痛的作用，如图1所示。
1.5神经病理性疼痛小鼠ACC区谷氨酸释放的检测：
将各组小鼠直接断头，冰上剥离脑组织，取bregma前2.34mm，后0.22mm，旁开0.6mm的大脑皮层，即ACC区脑组织，用生理盐水冲洗3遍，将脑组织在冰冷的生理盐水中硬化3分钟，用切片机切成300um/片，放入预先准备好的含有37℃、100mM Kcl的人工脑脊液里，30分钟后搜集上清液，离心(12000rpm，2分钟)，待检测，将组织烘干做内参。
谷氨酸检测按Biovision试剂盒K629-100的说明书严格操作，即：
A)试剂准备：在检测前将GlutamateAssay Buffer(谷氨酸检测缓冲液)放入室温，避免温度影响检测结果；用220μlAssay Buffer(缓冲液)溶解Glutamate Enzyme Mix(谷氨酸酶混合物)，用820μl ofddH2O溶解Glutamate developer(谷氨酸显影剂)，反复抽吸助溶，忌漩涡震荡，放冰上待用；将10μl 0.1M谷氨酸标准液加入990μlAssay Buffer(缓冲液)得到1mM的谷氨酸标准液；
B)将96孔板的每孔加入0、2、4、6、8、10μl的谷氨酸标准液得到0、2、4、6、8、10nmol/空的量；用GlutamateAssay Buffer(谷氨酸检测缓冲液)补足使每孔达到50μl的体积，即得到每孔0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2nmol/μl的浓度，做标准曲线用，每孔加入待检测样本50μl；
C)按比例配置反应液：每孔90μlAssay Buffer、8μl Glutamate Developer(谷氨酸显影剂)、2μl Glutamate Enzyme Mix(谷氨酸显影剂)；空白对照加入92μlAssay Buffer(缓冲液)、8μl Glutamate Developer(谷氨酸显影剂)；
D)避光，37℃，30min后用酶标仪检测450nm处的吸光度值；
E)根据标准曲线计算每个样本的谷氨酸含量。
由图2结果证明，在神经病理性疼痛小鼠前扣带回脑区定位注射含1mM BAPTA-AM的0.1％DMAO溶液可减少谷氨酸释放。
本发明证实了BAPTA-AM在制备神经病理性疼痛镇痛药物中的应用，镇痛作用是通过降低神经病理性疼痛小鼠前扣带回谷氨酸释放实现的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。