具体实施方式

本发明提供了允许有效递送TCA循环中间体以用于治疗代谢障碍的组合物和方法。特别地，本发明的组合物和方法能够通过皮下施用或静脉内施用递送琥珀酸盐。琥珀酸盐的合成在丙酸血症和甲基丙二酸血症中是有缺陷的，并且在患有这些障碍的患者中错误的代谢会导致各种潜在的致命效应，诸如神经损伤、心肌病和感染。琥珀酸盐的非口服制剂允许以比利用现有的口服琥珀酸盐制剂可以实现的生物利用度高得多的生物利用度递送化合物。因此，非口服制剂以足够的水平提供琥珀酸盐，以防止有缺陷的TCA循环代谢的严重的长期影响。

本发明还提供了联合疗法，其包括琥珀酸盐的非口服制剂和柠檬酸盐——TCA循环的另一中间体的口服制剂。与琥珀酸盐相反，柠檬酸盐可以以治疗有效剂量口服施用。因此，联合疗法通过不同的方式提供不同TCA循环中间体的递送。琥珀酸盐的非口服制剂和柠檬酸盐的口服制剂可以顺序或同时提供。顺序联合疗法允许患者(尤其是婴儿)在患者年龄达到足以摄入治疗有效量的柠檬酸盐时，从非口服疗法过渡到口服施用。此类疗法允许对新生儿进行早期干预，同时允许在没有医疗保健专业人员的情况下可以施用的长期护理。当诸如呕吐、皮疹等临床问题限制可以通过任一施用模式递送的中间体的量时，同步联合疗法是有用的。

TCA循环与相关的障碍

TCA循环如下所示：

异常的TCA循环代谢与多种病症有关。在TCA循环的遗传性代谢障碍(诸如2-氧代戊二酸尿症、富马酸酶缺乏和琥珀酰CoA合成酶缺乏)中，遗传突变影响TCA循环的酶或催化相关反应的酶。因此，TCA循环的单独的反应受损，导致循环进行所需的中间体耗尽。此类疾病通常在早期出现，伴有严重症状，诸如智力低下、小头畸形、耳聋和张力减退，并且在幼儿期经常是致命的。

其它代谢障碍影响其中其它代谢物(诸如脂肪酸和氨基酸)被转化为TCA循环中间体的途径。例如，丙酰CoA通过奇数链脂肪酸的氧化以及氨基酸异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸和蛋氨酸的分解生成，然后被转化为琥珀酰CoA。丙酰CoA转化为琥珀酰CoA涉及以下反应序列：

丙酸血症(PA)由丙酰CoA羧化酶的缺乏引起。在患有PA的患者中，过量的丙酰CoA被转化为丙酸，其在血流中积聚。以类似的方式，甲基丙二酸血症(MMA)由甲基丙二酰CoA变位酶的缺乏引起。在患有MMA的患者中，过量的甲基丙二酰CoA被转化为甲基丙二酸，其在血流中积聚。在PA和MMA中，血液中高水平的酸导致各种潜在的致命效应，诸如器官损伤、卒中和癫痫。

PA和MMA的治疗侧重于饮食管理，以避免触发酸积累的氨基酸。因此，患有PA或MMA的患者必须严格遵守低蛋白饮食，以使其触发氨基酸的摄入最小化。患有PA或MMA的患者中的氨基酸的受限的摄入通常导致左旋肉碱——一种参与脂肪酸跨线粒体膜转运的季铵化合物的短缺。因此，患有PA或MMA的患者通常接受补充的左旋肉碱。患有PA或MMA的婴儿的低蛋白饮食也使其面临细菌感染的风险，因此他们可以预防性给予抗生素。

PA和MMA是常染色体隐性遗传障碍。编码丙酰CoA羧化酶的基因PCCA或PCCB的纯合突变导致PA。MMA可以由编码甲基丙二酰CoA变位酶的MUT中的纯合突变产生。甲基丙二酰CoA变位酶需要维生素B₁₂作为辅助因子，并且参与维生素B₁₂代谢的基因中的突变(诸如LMBRD1、MCEE、MMAA、MMAB、MMACHC和MMADHC)也可以导致MMA。维生素B₁₂的饮食缺乏也可以导致MMA。

在与这一代谢途径没有直接遗传联系的其它疾病中也观察到了异常的TCA循环代谢。例如，在神经退行性障碍(诸如肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病或享廷顿病)和多种癌症中观察到改变的TCA代谢。尽管这一组不同疾病的症状各不相同，但在许多情况下，已经观察到特定TCA酶的活性降低或线粒体ATP生成减少，并且认为提高TCA循环中间体的水平将缓解症状并改善预后。

本发明提供了治疗与改变的TCA循环代谢相关的或可以通过提供TCA循环的中间体而改善的任何疾病、障碍或病症的方法。病症可以是遗传性病症，诸如PA、MMA、2-氧代戊二酸尿症、富马酸酶缺乏或琥珀酰CoA合成酶缺乏。病症可以是神经变性病症，诸如肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病或享廷顿病。病症可以是癌症，诸如胰腺癌、肾癌、宫颈癌、前列腺癌、肌癌、胃癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、副神经节瘤、白血病、肝癌、乳腺癌、癌和成神经细胞瘤。

可以用本发明的组合物或方法治疗的另外的代谢疾病、障碍或病症包括急性心绞痛、急性肾损伤、急性饥饿、肾上腺脑白质营养不良(ALD)、肾上腺脊髓神经病(AMN)、年龄相关疾病、Alpers病(进行性婴儿脊髓灰质炎营养不良)、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、心房纤颤、自闭症和自闭症谱系障碍(ASD)、Barth综合征(致死性婴儿心肌病)、β-氧化缺陷、生物能代谢缺陷、双相型障碍、肉碱-酰基肉碱缺乏、肉碱缺乏、肉碱棕榈酰转移酶I(CPT I)缺乏、肉碱棕榈酰转移酶II(CPT II)缺乏、脑血管意外、慢性进行性外眼肌麻痹综合征(CPEO)、辅酶Q10缺乏、复合物I缺乏(NADH脱氢酶(NADH-CoQ还原酶)缺乏)、复合物II缺乏(琥珀酸脱氢酶缺乏)、复合物III缺乏(泛醌-细胞色素c氧化还原酶缺乏、复合物IV缺乏/COX缺乏、复合物V缺乏(ATP合成酶缺乏)、冠状动脉闭塞、COX缺乏、肌酸缺乏综合征(例如，脑肌酸缺乏综合征(CCDS)、胍基乙酸甲基转移酶缺乏(GAMT缺乏)、L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶缺乏(AGAT缺乏)和SLC6A8相关的肌酸转运体缺乏(SLC6A8缺乏))、糖尿病、与POLG突变相关的障碍、内毒素血症、能量障碍、癫痫、弗里德希氏共济失调(FRDA或FA)、II型戊二酸尿症、享廷顿病、缺氧、缺血、卡恩斯-塞尔综合征(KSS)、乳酸性酸中毒、长链酰基CoA脱氢酶缺乏(LCAD、VLCAD、VLCADD)、长链3-羟基酰基CoA脱氢酶缺乏(LCHAD)、Leigh病或综合征(亚急性坏死性脑脊髓病)、Leber遗传性视神经病变(LHON)、Luft病、黄斑变性、男性不育、中链酰基CoA脱氢酶缺乏(MCAD)、线粒体相关疾病、线粒体细胞病、线粒体脑肌病乳酸性酸中毒和卒中样综合征(MELAS)、线粒体脑病(包括脑肌病、脑脊髓病)、线粒体DNA耗竭、线粒体肌病、线粒体隐性共济失调综合征(MIRAS)、线粒体呼吸链缺陷、多器官功能障碍综合征、心境障碍、运动神经元疾病、肌营养不良(例如，杜兴氏肌营养不良和贝克尔氏肌营养不良)、心肌梗死、肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维(MERRF)、肌神经胃肠障碍(myoneurogastrointestinaldisorder)和脑病(MNGIE)、神经病、共济失调和色素性视网膜炎(NARP)、与帕金森病相关的神经变性障碍、Pearson综合征、丙酮酸羧化酶缺乏、丙酮酸脱氢酶缺乏、难治性癫痫、肾小管酸中毒、呼吸链缺乏、精神分裂症、脓毒症、短链酰基CoA脱氢酶缺乏(SCAD)、短链羟基酰基CoA脱氢酶缺乏(SCHAD，SCHADD)、卒中、琥珀酰CoA裂解酶缺乏、全身炎性反应综合征和极长链酰基CoA脱氢酶缺乏(VLCAD)。

疾病、障碍或病症可以继发于另一种疾病、障碍或病症或者与另一种疾病、障碍或病症相关。例如，疾病、障碍或病症可以与心脏病、胃肠障碍、缺血再灌注损伤、中毒、肝病、运动控制丧失、肌无力和疼痛、线粒体基因组中的突变、神经疾病、障碍或病症、疼痛或疲劳疾病、癫痫发作、感觉性听力丧失、吞咽困难、耳鸣或视觉/听觉问题相关。

与改变的TCA循环代谢相关的疾病、障碍和病症通常影响具有高能量需求的器官、组织和系统，诸如脑、耳蜗、内分泌系统、心脏、肾脏、肝脏、呼吸系统、视网膜和骨骼肌。因此，本发明的组合物和方法可以用于治疗影响这些器官、组织或系统中的一个或多个的疾病、障碍或病症。

另一个临床上重要的代谢途径是线粒体电子传递链。电子传递链利用一系列复杂的氧化还原反应在线粒体内膜上产生质子梯度，并且来自质子梯度的化学基序电位用于驱动三磷酸腺苷(ATP)的合成。电子传递链涉及线粒体内膜中的四种酶复合物:NADH脱氢酶，也被称为呼吸复合体I；琥珀酸脱氢酶，也被称为呼吸复合体II；辅酶Q:细胞色素c还原酶，也被称为呼吸复合体III；以及细胞色素c氧化酶，也被称为呼吸复合体IV。电子以两种方式中的任一种进入传递链。首先，NADH脱氢酶可以将电子从NADH转移到泛素(链中第一中间电子载体)上。可替代地，来自琥珀酸盐的电子可以通过琥珀酸脱氢酶被转移到泛醌。在电子传递链的下一步中，电子通过辅酶Q:细胞色素c还原酶从泛醌转移到第二中间电子载体细胞色素c。在最后一步中，细胞色素c氧化酶将电子从细胞色素c转移到分子氧中，以形成水(电子传递的净产物)。琥珀酸脱氢酶是唯一参与TCA循环和电子传递链的酶。

Leber遗传性视神经病变(LHON)是由电子传递链的缺陷引起的视网膜变性病症。LHON由编码NADH脱氢酶的组分(诸如MT-ND1、MT-ND4、MT-ND4L和MT-ND6)的线粒体基因中的突变引起。因为导致LHON的突变是由线粒体基因组(其从卵子而不是精子传递给胚胎)中的基因编码的，所以LHON仅可以通过母系遗传。

本发明的见解是琥珀酸盐可用于治疗LHON。由于降低的NADH脱氢酶活性，电子传递和ATP合成在患有LHON的患者中减少。特别是，链中第一中间电子载体泛醌的形成减少。然而，可以通过提供补充的琥珀酸盐来恢复电子传递活性，该补充的琥珀酸盐可以通过琥珀酸脱氢酶贡献电子以形成泛醌。因此，在患有LHON的患者中提供另外的琥珀酸盐作为电子传递链的电子供体补偿了NADH的电子传递的不足。

含有TCA循环中间体的组合物

本发明提供了被配制成用于非口服施用的包含一种或多种TCA循环中间体或其前药、类似物或衍生物的组合物。例如但不限于，TCA循环中间体或其前药、类似物或衍生物可以是柠檬酸盐、顺乌头酸盐、D-异柠檬酸盐、α-酮戊二酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、苹果酸盐、草酰乙酸盐、丙酮、乙酰乙酸盐、β-羟基丁酸盐、β-酮戊酸盐或β-羟基戊酸盐。优选地，TCA循环中间体是琥珀酸盐。TCA循环中间体或其前药、类似物或衍生物可以以游离酸、盐或非盐形式提供。

含有一种或多种TCA循环中间体或其前药、类似物或衍生物的组合物可以被配制成用于通过任何非口服途径施用。例如但不限于，组合物可以被配制成用于皮下施用、静脉内施用、动脉内施用、肌内施用、皮内施用或直肠施用。优选地，组合物被配制成用于静脉内施用或皮下施用。

前药是一种药物或化合物，其在施用后被代谢(即在体内转化)为药理活性药物。前药本身可能没有药理活性。前药可以用于改善药物的吸收、分布、代谢和排泄的方式。当活性药物经胃肠道被较差地吸收时，前药可以改善活性药物的生物利用度。前药可以改善药物与不是其预期目标的细胞或过程的选择性相互作用的方式，从而减少非预期的和不期望的副作用。前药可以在细胞内(I型前药)或在细胞外(II型前药)被转化为生物活性形式(生物活化的)。前药可以在胃肠道中、在体循环中、在靶组织以外的代谢组织中或在靶组织中被生物活化。

TCA循环中间体或其前药、类似物或衍生物可以作为药学上可接受的盐提供，诸如无毒的酸加成盐，其是与无机酸诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸或与有机酸诸如乙酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸形成的氨基基团的盐，或通过使用本领域中使用的其它方法诸如离子交换形成的。在一些实施例中，药学上可接受的盐包括但不限于己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡糖庚酸盐、甘油磷酸盐、葡萄糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘化物、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。在一些实施例中，药学上可接受的盐是碱金属盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐是钠盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐是碱土金属盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐包括，当合适时，无毒的铵、季铵和使用抗衡离子形成的胺阳离子，诸如卤根、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、具有1至6个碳原子的烷基、磺酸根和芳基磺酸根。

琥珀酸盐的前药在本领域中是已知的，并且描述于例如国际公开第WO 1997/047584、WO 2014/053857、WO 2015/155230、WO 2015/155231、WO 2015/155238、WO 2017/060400、WO 2017/060418和WO 2017/060422号；欧洲专利公开第EP 2903609、EP 3129016、EP 3129364、EP 3129058和EP 3391941号；以及美国专利公开第US 2017/0100359、US2017/0105960和US 2017/0105961号中，其各自的内容通过引用并入本文。来自这些文件的代表性化合物在下面提供。

式(I)和(IA)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中A和B之间的点键表示任选的键以形成闭环结构，并且其中

当式为式(I)时，Z选自-CH₂-(例如，衍生自丙二酸)、-CH₂-CH₂-CH₂(例如，衍生自戊二酸)、-CH＝CH₂-(例如，衍生自富马酸)、-CH₂-CH(OH)-(例如，衍生自苹果酸)、-CH(OH)-CH₂-(例如，衍生自苹果酸)、CH₂C(OH)(COOH)-CH₂-(例如，衍生自柠檬酸)、-C(O)-CH₂-CH₂-(例如，衍生自α-酮戊二酸)、-CH₂-CH₂-C(O)-(例如，衍生自α-酮戊二酸)、-CH₂-C(COC(OH)-C(COOH)-CHOH)＝CH-(例如，衍生自乌头酸)、-CH＝C(COOH)-CH₂-(例如，衍生自乌头酸)、-CH(OH)-CH(COOH)-CH₂-(例如，衍生自异柠檬酸)、-CH₂-CH(COOH)-CH(OH)-(例如，衍生自异柠檬酸)、-CH₂-CH(COOH)-C(＝O)-(例如，衍生自草酰琥珀酸)、-C(＝O)-CH(COOH)-CH₂-(例如，衍生自草酰琥珀酸)、-C(＝O)-CH₂-(例如，衍生自草酰乙酸)、-CH₂-C(＝O)-(例如，衍生自草酰乙酸)；或

当式为式(IA)时，Z选自-CH(OH)-CH₂(OH)并且n为0(例如，衍生自甘油酸)；或Z不存在或是-CH₂-并且n为1且B为烷基基团(例如，分别衍生自丙酮酸或乙酰乙酸)；

A和B独立地不同或相同，并且选自-OR、-OR'、-NHR"、-SR'"

或-OH；其中R是

或者在这些情况下，其中化合物是根据式(IA)，那么B是支链或直链的C₁-C₄-烷基，优选地R是Me；

R'选自下式(II)、(V)或(IX)：

并且A和B都不是-OH，

R'、R"和R"'独立地不同或相同，并且选自下式(VII-VIII)：

R₁和R₃独立地不同或相同，并且选自H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、O-酰基、O-烷基、N-酰基、N-烷基、X酰基、CH₂X烷基、CH₂CH₂CH₂OC(＝O)CH₂CH₂COX₆R₈或

X选自O、NH、NR₆、S，

R₂选自Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、C(O)CH₃、C(O)CH₂C(O)CH₃、C(O)CH₂CH(OH)CH₃，

p是整数并且是1或2，

R₆选自H、烷基、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、乙酰基、酰基、丙酰基、苯甲酰基或式(II)或式(VIII)，

X₅选自-H、-COOH、-C(＝O)XR₆、CONR₁R₃或下式之一

R₉选自H、Me、Et或O₂CCH₂CH₂COXR₈，

R₁₀选自O酰基、NH烷基、NH酰基或O₂CCH₂CH₂COX₆R₈，

X₆是O或NR₈，并且R₈选自H、烷基、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、乙酰基、酰基、丙酰基、苯甲酰基、琥珀酰基或式(II)或式(VIII)，

R₁₁和R₁₂独立地相同或不同，并且选自H、烷基、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、乙酰基、酰基、丙酰基、苯甲酰基、琥珀酰基、酰基、-CH₂X烷基、-CH₂X酰基，其中X选自O、NR₆或S，

R₁₃、R₁₄和R₁₅独立地不同或相同，并且选自H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、-COOH、O-酰基、O-烷基、N-酰基、N-烷基、X酰基、CH₂X烷基，

R_c和R_d独立地是CH₂X烷基、CH₂X酰基，其中X＝O、NR₆或S，并且烷基是例如H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基，并且酰基是例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丙酰基、丁酰基、叔丁酰基、戊酰基、苯甲酰基、琥珀酰基等，

R_f、R_g和R_h独立地选自X酰基、-CH₂X烷基、-CH₂X酰基和R9，

烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、异戊基、己基、异己基、庚基、辛基、壬基或癸基，并且酰基选自甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、苯甲酰基、琥珀酰基等，

R₂₀和R₂₁独立地不同或相同，并且选自H、低级烷基，即C₁-C₄烷基，或者R₂₀和R₂₁一起可以形成C₄-C₇环烷基或芳族基团，两者可以任选地被卤素、羟基或低级烷基取代，或

R₂₀和R₂₁可以是

CH₂X-酰基、F、CH₂COOH、CH₂CO₂烷基，并且

当在A和B之间存在环键时，化合物为

并且酰基和烷基可以任选地被取代。

式(I)和(IV)的化合物或其药学上可接受的盐，其中A和B之间的点键表示任选的键以形成闭环结构，并且

其中A是–OR₁，并且R₁是H或其药学上可接受的盐，或任选地取代的烷基基团或式(II)的基团，并且式(I)中的B是-OR₂且R₂独立地是根据式(II)的基团，其中式(II)是

其中R₃和R₄独立地是H、任选取代的C₁-C₃烷基，或被连接在一起以形成环，并且其中R₅被连接到R₁以形成环，或R₅选自OCOR_a、OCOOR_b、OCONR_cR_d、SO₂R_e、OPO(OR_f)(OR_g)或CONR_cR_d，其中R_a是任选取代的烷基或任选取代的环烷基，R_b是任选取代的烷基，R_c和R_d独立地是H、任选取代的烷基或被连接在一起以形成可以含有一个或多个进一步的杂原子的环，R_e是任选取代的烷基，R_f和R_g独立地是H、甲基、乙基或被连接在一起以形成环；

其中式(IA)中的B是支链或直链的C₁-C₄烷基；

并且其中

当式为式(I)时，Z选自-CH₂-(例如，衍生自丙二酸)、-CH₂-CH₂-CH₂(例如，衍生自戊二酸)、-CH＝CH₂-(例如，衍生自富马酸)、-CH₂-CH(OH)-(例如，衍生自苹果酸)、-CH(OH)-CH₂-(例如，衍生自苹果酸)、CH₂C(OH)(COOH)-CH₂-(例如，衍生自柠檬酸)、-C(O)CH₂-CH₂-(例如，衍生自α-酮戊二酸)、-CH₂-CH₂-C(O)-(例如，衍生自α酮戊二酸)、-CH₂-C(COC(OH)-C(COOH)-CHOH)＝CH-(例如，衍生自乌头酸)、-CH＝C(COOH)-CH₂-(例如，衍生自乌头酸)、-CH(OH)-CH(COOH)-CH₂-(例如，衍生自异柠檬酸)、-CH₂-CH(COOH)-CH(OH)-(例如，衍生自异柠檬酸)、-CH₂-CH(COOH)-C(＝O)-(例如，衍生自草酰琥珀酸)、-C(＝O)-CH(COOH)-CH₂-(例如，衍生自草酰琥珀酸)、-C(＝O)-CH₂-(例如，衍生自草酰乙酸)、-CH₂-C(＝O)-(例如，衍生自草酰乙酸)；或

当式为式(IA)时，Z选自-CH(OH)-CH₂(OH)并且n为0(例如，衍生自甘油酸)；或Z不存在或是-CH₂-并且n为1且B为烷基基团(例如，分别衍生自丙酮酸或乙酰乙酸)。

式(I)和(IA)的化合物或其药学上可接受的盐，其中A和B之间的点键表示任选的键以形成闭环结构，

并且其中

当式为式(I)时，Z选自-CH₂-(例如，衍生自丙二酸)、-CH₂-CH₂-CH₂(例如，衍生自戊二酸)、-CH＝CH₂-(例如，衍生自富马酸)、-CH₂-CH(OH)-(例如，衍生自苹果酸)、-CH(OH)-CH₂-(例如，衍生自苹果酸)、CH₂C(OH)(COOH)-CH₂-(例如，衍生自柠檬酸)、-C(O)-CH₂-CH₂-(例如，衍生自α-酮戊二酸)、-CH₂-CH₂-C(O)-(例如，衍生自α-酮戊二酸)、-CH₂-C(COC(OH)-C(COOH)-CHOH)＝CH-(例如，衍生自乌头酸)、-CH＝C(COOH)-CH₂-(例如，衍生自乌头酸)、-CH(OH)-CH(COOH)-CH₂-(例如，衍生自异柠檬酸)、-CH₂-CH(COOH)-CH(OH)-(例如，衍生自异柠檬酸)、-CH₂-CH(COOH)-C(＝O)-(例如，衍生自草酰琥珀酸)、-C(＝O)-CH(COOH)-CH₂-(例如，衍生自草酰琥珀酸)、-C(＝O)-CH₂-(例如，衍生自草酰乙酸)、-CH₂-C(＝O)-(例如，衍生自草酰乙酸)；或

当式为式(IA)时，Z选自-CH(OH)-CH₂(OH)并且n为0(例如，衍生自甘油酸)；或Z不存在或是-CH₂-并且n为1且B为烷基基团(例如，分别衍生自丙酮酸或乙酰乙酸)；

A选自-SR、-OR和NHR，并且R是

当Z是CH₂，R是Me、Et、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基或琥珀酰基时，那么X₅、R₁₅、R₁₄和R₁₃不能都是H；

当Z是-CH₂-CH₂-CH₂、-CH＝CH-、-CH₂-CH(OH)-、-CH(OH)-CH₂-、-CH₂C(OH)(COOH)-CH₂-、-C(O)-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-、-CH₂-C(COOH)＝CH-、-CH＝C(COOH)-CH₂-、-CH(OH)-CH(COOH)-CH2-、-CH2-CH(COOH)-CH(OH)-、-CH2-CH(COOH)-C(＝O)-、-C(＝O)-CH(COOH)-CH2-、-C(＝O)-CH2-或-CH2-C(＝O)-并且R₁是Me、辛基或琥珀酰基时，X₅、R₁₅、R₁₄和R₁₃不能都是H；

R₁不能含有基序-CH2CH2N-酰基；R₁不能是谷氨酸盐；当在式(IA)中，Z是-CH(OH)-CH2(OH)并且n是0，或者Z不存在并且n是1且B是烷基基团(例如，衍生自丙酮酸)时，那么当X₅是-COOH或-C(＝O)XR₆时，R₁不能是Me；

B选自-O-R'、-NHR"、-SR'"或-OH；并且R'选自下式(II)至(IX)：

或者在这些情况下，其中化合物是根据式(IA)，那么B是支链或直链的C₁-C₄-烷基，优选地R是Me；

R'、R"和R'"独立地不同或相同，并且选自下式(VII-VIII)：

R₁和R₃独立地不同或相同，并且选自H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、O-酰基、O-烷基、N-酰基、N-烷基、X酰基、CH₂X烷基、-CH₂X-酰基、F、-CH₂COOH、-CH₂CO₂烷基，

X选自O、NH、NR₆、S，

R₂选自Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、-C(O)CH₃、-C(O)CH₂C(O)CH₃、-C(O)CH₂CH(OH)CH₃，

p是整数，并且是1或2，

R₆选自H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、乙酰基、酰基、丙酰基、苯甲酰基或式(II)或式(VIII)，

X₅选自-H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、-COOH、-C(＝O)XR₆、CONR₁R₃，或为下式

X₇选自R₁、-NR₁R₃，

R₉选自H、Me、Et或O₂CCH₂CH₂COXR₈，

R₁₀选自-O酰基、-NH烷基、-NH酰基或O₂CCH₂CH₂COX₆R₈，

X₆选自O、NR₈、NR₆R₈，其中R₆和R₈独立地不同或相同，并且选自H、烷基、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、乙酰基、酰基、丙酰基、苯甲酰基或式(II)或式(VIII)，

R₁₁和R₁₂独立地不同或相同，并且选自H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、乙酰基、丙酰基、苯甲酰基、-CH₂X烷基、-CH₂X酰基，其中X是O、NR₆或S，

R_c和R_d独立地不同或相同，并且选自CH₂X烷基、CH₂X酰基，其中X＝O、NR₆或S，

R₁₃、R₁₄和R₁₅独立地不同或相同，并且选自H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、-COOH、O-酰基、O-烷基、N-酰基、N-烷基、X酰基、CH₂X烷基；

R₁₃和R₁₄或R₁₃和R₁₅上的取代基可以桥连以形成环状体系，形成环烷基、杂环烷基、内酯或内酰胺。

R_f、R_g和R_h独立地不同或相同，并且选自X酰基、CH₂X烷基、-CH₂X酰基和R_g，

烷基选自Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基，

酰基选自甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丙酰基、丁酰基、叔丁酰基、戊酰基、苯甲酰基、琥珀酰基。

酰基和/或烷基可以任选地被取代，并且

当在A和B之间存在点键时，根据式(I)的化合物是

其中X₄选自-COOH、-C(＝O)XR₆，

式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中A和B之间的点键表示任选的键以形成闭环结构，

并且其中

Z选自-CH₂-CH₂-或>CH(CH₃)，

A选自-SR、-OR和NHR，并且R是

B选自-O-R'、-NHR"、-SR'"或-OH；并且R'选自下式(II)至(IX)：

R'、R"和R'"独立地不同或相同，并且选自下式(IV-VIII)：

R₁和R₃独立地不同或相同，并且选自H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、O-酰基、O-烷基、N-酰基、N-烷基、X酰基、CH₂X烷基、CH₂X酰基、F、CH₂COOH、CH₂CO₂烷基，

X选自O、NH、NR₆、S，

R₂选自Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、C(O)CH₃、C(O)CH₂C(O)CH₃、C(O)CH₂CH(OH)CH₃，

p是整数，并且是1或2，

R₆选自H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、乙酰基、酰基、丙酰基、苯甲酰基或式(II)或式(VIII)，

X₅选自-H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、-COOH、-C(＝O)XR₆、CONR₁R₃或为下式，

X₇选自R₁、-NR₁R₃，

R₉选自H、Me、Et或O₂CCH₂CH₂COXR₈，

R₁₀选自O酰基、NH烷基、NH酰基或O₂CCH₂CH₂COX₆R₈，

X₆选自O、NR₈、NR₆R₈，其中R₆和R₈独立地不同或相同，并且选自H、烷基、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、乙酰基、酰基、丙酰基、苯甲酰基或式(II)或式(VIII)，

R₁₁和R₁₂独立地不同或相同，并且选自H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、乙酰基、丙酰基、苯甲酰基、-CH₂X烷基、CH₂X酰基，其中X是O、NR₆或S，

R_c和R_d独立地不同或相同，并且选自CH₂X烷基、CH₂X酰基，其中X＝O、NR₆或S，

R₁₃、R₁₄和R₁₅独立地不同或相同，并且选自H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、-COOH、O-酰基、O-烷基、N-酰基、N-烷基、X酰基、CH₂X烷基；

R₁₃和R₁₄或R₁₃和R₁₅上的取代基可以桥连以形成环状体系，形成环烷基、杂环烷基、内酯或内酰胺。

R_f、R_g和R_h独立地不同或相同，并且选自X酰基、-CH₂X烷基、-CH₂X酰基和Rg，

烷基选自Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基，

酰基选自甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丙酰基、丁酰基、叔丁酰基、戊酰基、苯甲酰基、琥珀酰基。

酰基和/或烷基可以任选地被取代，并且

当在A和B之间存在点键时，根据式(I)的化合物是

其中X₄选自-COOH、-C(＝O)XR₆，

式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中A和B之间的点键表示任选的键以形成闭环结构，

并且其中

Z选自-CH₂-CH₂-或>CH(CH₃)，

A和B独立地不同或相同，并且选自-OR、-OR'、-NHR"、-SR'"或-OH；其中R是

R'选自下式(II)、(V)或(IX)：

并且A和B都不是-OH，

R'、R"和R"'独立地不同或相同，并且选自下式(VII-VIII)：

R₁和R₃独立地不同或相同，并且选自H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、O-酰基、O-烷基、N-酰基、N-烷基、X酰基、CH₂X烷基、CH₂CH₂CH₂OC(＝O)CH₂CH₂COX₆R₈或

X选自O、NH、NR₆、S，

R₂选自Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、C(O)CH₃、C(O)CH₂C(O)CH₃、C(O)CH₂CH(OH)CH₃，

p是整数并且是1或2，

R₆选自H、烷基、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、乙酰基、酰基、丙酰基、苯甲酰基或式(II)或式(VIII)，

X₅选自-H、-COOH、-C(＝O)XR₆、CONR₁R₃或下式之一

R9选自H、Me、Et或O₂CCH₂CH₂COXR₈，

R10选自O酰基、NH烷基、NH酰基或O₂CCH₂CH₂COX₆R₈，

X₆是O或NR₈，并且R₈选自H、烷基、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、乙酰基、酰基、丙酰基、苯甲酰基、琥珀酰基或式(II)或式(VIII)，

R₁₁和R₁₂独立地相同或不同，并且选自H、烷基、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、乙酰基、酰基、丙酰基、苯甲酰基、琥珀酰基、酰基、-CH₂X烷基、-CH₂X酰基，其中X选自O、NR₆或S，

Ris、RM和RI5独立地不同或相同，并且选自H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、-COOH、O-酰基、O-烷基、N-酰基、N-烷基、X酰基、CH₂X烷基，R_c和R_d独立地是CH₂X烷基、CH₂X酰基，其中X＝O、NR₆或S，并且烷基是例如H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基，并且酰基是例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丙酰基、丁酰基、叔丁酰基、戊酰基、苯甲酰基、琥珀酰基等，

R_f、R_g和R_h独立地选自X酰基、-CH₂X烷基、-CH₂X酰基和R9，

烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、异戊基、己基、异己基、庚基、辛基、壬基或癸基，并且酰基选自甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、苯甲酰基、琥珀酰基等，

R₂₀和R₂₁独立地不同或相同，并且选自H、低级烷基，即C₁-C₄烷基，或者R₂₀和R₂₁一起可以形成C₄-C₇环烷基或芳族基团，两者可以任选地被卤素、羟基或低级烷基取代，或

R₂₀和R₂₁可以是

或

CH₂X-酰基、F、CH₂COOH、CH₂CO₂烷基，并且

当在A和B之间存在环键时，化合物为

并且酰基和烷基可以任选地被取代。

一种式(A)的化合物，

其中和R₂相同或不同并且选自式(B)

并且其中R₃选自H或任选取代的C_1-C₃烷基，诸如例如，甲基、乙基、丙基或异丙基，并且其中R₅是-OC(＝O)R_a，其中R_a是甲基或式(C)

一种式(XX)的化合物，

其中R-\是H或其药学上可接受的盐，或任选取代的烷基或式(II)的基团，并且R₂独立地是根据式(II)的基团，其中式(II)是

其中R₃和R₄独立地是H，任选取代的C₁-C₃烷基，或被连接在一起以形成环，并且其中R₅被连接到R₁以形成环，或R₅选自OCOR_a、OCOOR_b、OCONR_cR_d、SO₂R_e、OPO(OR_f)(OR_g)或CONR_cR_d，其中R_a是任选取代的烷基或任选取代的环烷基，R_b是任选取代的烷基，R_c和R_d独立地是H，任选取代的烷基或被连接在一起以形成可以包含一个或多个另外的杂原子的环，R_e是任选取代的烷基，R_f和R_g独立地是H、甲基、乙基或被连接在一起以形成环，并且其中该化合物不是琥珀酸双(2,2-二甲基丙酰氧基甲基)酯；琥珀酸二丁酰氧基甲基酯；或琥珀酸双-(l-丁酰氧基-乙基)酯。

本发明还提供了治疗组合物，其含有柠檬酸盐、柠檬酸或柠檬酸盐或柠檬酸的前药、类似物或衍生物作为联合疗法的一种组分，该联合疗法还包括含有TCA循环中间体或其前药、类似物或衍生物的组合物。含有柠檬酸盐、柠檬酸或柠檬酸盐或柠檬酸的前药、类似物或衍生物的组合物可以被配制成用于口服施用，或者它们可以被配制成用于非口服施用。

本发明的组合物可以含有缓冲剂。可以使用任何合适的缓冲剂。缓冲剂可以是氨基酸或其衍生物。例如，氨基酸可以是丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸。优选地，氨基酸是赖氨酸或鸟氨酸。缓冲剂可以是金属离子或可以含有金属离子。例如，金属离子可以是Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺或Cu^{2 +}。

缓冲剂可以将组合物的pH保持在中性或接近中性。例如但不限于，缓冲剂可以将组合物的pH保持在约3.0至约10.0、约3.0至约9.0、约3.0至约8.0、约3.0至约7.0、约3.0至约6.0、约4.0至约10.0、约4.0至约9.0、约4.0至约8.0、约4.0至约7.0、约4.0至约6.0、约5.0至约10.0、约5.0至约9.0、约5.0至约8.0、约5.0至约7.0、约6.0至约10.0、约6.0至约9.0、约6.0至约8.0、约7.0至约10.0、约7.0至约9.0或约8.0至约10.0。

在另一个方面中，本发明提供了一种制剂，其包含柠檬酸或其前药、类似物、衍生物；至少一种柠檬酸盐或其前药、类似物或衍生物；以及氨基酸。制剂可以包含柠檬酸和至少一种柠檬酸盐，例如，至少一种柠檬酸盐可以选自由以下组成的群组：柠檬酸一钠和柠檬酸一钾。在其它实施例中，制剂可以是柠檬酸和至少两种柠檬酸盐，例如，该至少两种柠檬酸盐可以是柠檬酸一钠和柠檬酸一钾。

制剂可以包含任何天然氨基酸或非天然氨基酸。在某些实施例中，氨基酸是阳离子氨基酸，诸如赖氨酸或精氨酸。制剂可以包含其它组分，诸如糖，例如蔗糖。

制剂可以通过任何施用途径提供，并且优选的途径是口服。示例性的口服制剂是能够溶于水性介质的粉末。在一个特定的实施例中，制剂包含柠檬酸、柠檬酸一钠、柠檬酸一钾、蔗糖以及赖氨酸和精氨酸中的一种或多种。

本发明的其它方面提供了治疗受试者中与改变的TCA循环代谢相关的病症的方法。此类方法可以涉及向患有与改变的TCA循环代谢相关的病症的受试者提供制剂，该制剂包含(i)柠檬酸或其前药、类似物、衍生物；(ii)至少一种柠檬酸盐或其前药、类似物或衍生物；以及(iii)氨基酸，其中通过制剂中组分(i)、(ii)和(iii)中的两种或更多种的组合的活性在受试者中实现治疗效果。在某些实施例中，氨基酸被掺入到受试者的TCA循环中并且有助于在受试者中实现的治疗效果。

示例性的病症包括与POLG突变相关的障碍、能量障碍、1型或2型戊二酸血症、长链脂肪酸氧化障碍、甲基丙二酸血症(MMA)、线粒体相关疾病、线粒体脑肌病乳酸性酸中毒和卒中样综合征(MELAS)、肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维(MERRF)、线粒体肌病、线粒体呼吸链缺陷、肌营养不良(例如，杜兴氏肌营养不良和贝克氏肌营养不良)、神经障碍、疼痛或疲劳疾病、丙酸血症(PA)、丙酮酸羧化酶缺乏、难治性癫痫或琥珀酰CoA裂解酶缺乏。

制剂可以包含柠檬酸和至少一种柠檬酸盐，例如，至少一种柠檬酸盐可以选自由以下组成的群组：柠檬酸一钠和柠檬酸一钾。在其它实施例中，制剂可以是柠檬酸和至少两种柠檬酸盐，例如，该至少两种柠檬酸盐可以是柠檬酸一钠和柠檬酸一钾。

制剂可以包含任何天然氨基酸或非天然氨基酸。在某些实施例中，氨基酸是阳离子氨基酸，诸如赖氨酸或精氨酸。制剂可以包含其它组分，诸如糖，例如蔗糖。

制剂可以通过任何施用途径提供，并且优选的途径是口服。示例性的口服制剂是能够溶于水性介质的粉末。在一个特定的实施例中，制剂包含柠檬酸、柠檬酸一钠、柠檬酸一钾、蔗糖以及赖氨酸和精氨酸中的一种或多种。制剂可以每天一次或多次提供。例如，一种或多种制剂可以以每天1、2、3、4、5、6或更多个剂量提供。

含有柠檬酸盐或其前药、类似物或衍生物的制剂可以以任何治疗有效剂量提供。例如，柠檬酸盐或其前药、类似物或衍生物可以以下述量提供：约0.1mg/kg受试者重量至约5g/kg受试者重量、约0.1mg/kg受试者重量至约5g/kg受试者重量、约0.2mg/kg受试者重量至约2g/kg受试者重量、约0.5mg/kg受试者重量至约1g/kg受试者重量、约1mg/kg受试者重量至约500mg/kg受试者重量、约2mg/kg受试者重量至约200mg/kg受试者重量或约5mg/kg受试者重量至约100mg/kg受试者重量。

制剂或制剂中的可溶性组分可以含有柠檬酸、柠檬酸一钠、柠檬酸一钾、赖氨酸和蔗糖。制剂可以按质量计含有约40％至约60％的柠檬酸；约1％至约10％的柠檬酸一钠；约0.1％至约5％的柠檬酸一钾；约30％至约40％的赖氨酸；以及约10％至约15％的蔗糖。制剂或制剂中的可溶性组分可以按质量计含有约49.2％的柠檬酸、约2％的柠檬酸一钠、约0.3％的柠檬酸一钾、约37.5％的赖氨酸和约11％的蔗糖。制剂或制剂中的可溶性组分可以按质量计含有约44.2％的柠檬酸、约8.3％的柠檬酸一钠、约2.3％的柠檬酸一钾、约33.8％的赖氨酸和约11.5％的蔗糖。制剂或制剂中的可溶性组分可以按质量计含有约50％至约60％的柠檬酸盐、柠檬酸或其组合；约0.2％至约1％的钠；约0.02％至约0.5％的钾；约30％至约40％的赖氨酸；以及约10％至约15％的蔗糖。

本发明的制剂可以含有一种或多种TCA循环中间体或前药、类似物或其衍生物的水性悬浮液。水性悬浮液可以含有与适合于制造水性悬浮液的赋形剂混合的TCA循环中间体。此类赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂或湿润剂，诸如天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或氧化烯与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或氧化乙烯与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七碳亚乙基氧基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或氧化乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，诸如聚氧乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。水性悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙基酯、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂，和一种或多种甜味剂，诸如蔗糖或糖精。

油性悬浮液可以通过将TCA循环中间体悬浮在植物油(例如，花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(诸如液体石蜡)中来配制。油性悬浮液可以含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以加入甜味剂(诸如上述那些)和调味剂以提供可口的口服制品。这些组合物可以通过加入抗氧化剂诸如抗坏血酸进行保存。

适合于通过加入水制备水性悬浮液的可分散粉末和颗粒提供了与分散剂或湿润剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的TCA循环中间体。合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂是示例性的，例如也可以存在甜味剂、调味剂和着色剂。

本发明的组合物也可以是水包油乳液的形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，或矿物油，例如液体石蜡或它们的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如阿拉伯胶或黄蓍胶，天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂，以及衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如脱水山梨醇单油酸酯和该偏酯与氧化乙烯的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。乳液还可以含有甜味剂和调味剂。

本发明的组合物可以包括其它药学上可接受的载体，诸如糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉末黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；多元醇，诸如甘油(丙三醇)、赤藓糖醇、木糖醇、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原的水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；以及药物制剂中使用的其它无毒相容物质。

含有TCA循环中间体的组合物可以是适合于口服使用的形式。例如，口服制剂可以包括片剂、糖锭剂、锭剂、速熔剂(fast-melt)、水性或油性悬浮液、可分散粉末或颗粒、乳液、硬胶囊或软胶囊、糖浆或酏剂。用于口服使用的组合物可以根据药物组合物制造领域中已知的任何方法制备，并且此类组合物可以含有一种或多种选自甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂的药剂，以便提供药学上精致和可口的制品。片剂含有与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的柠檬酸盐或柠檬酸，该赋形剂适用于片剂的生产。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶，以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以不进行包衣，或者可以通过已知技术包衣，以延迟在胃中的崩解和在胃肠道中向下的吸收，从而在更长的时间内提供持续作用。例如，可以使用延时材料诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。它们也可以通过美国专利4,256,108、4,166,452和4,265,874中描述的技术进行包衣，以形成用于控制释放的渗透治疗片剂。

用于口服使用的制剂也可以以硬明胶胶囊的形式提供，其中柠檬酸盐、柠檬酸或柠檬酸盐或柠檬酸的前药、类似物或衍生物与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合；或者以软明胶胶囊的形式提供，其中化合物与水或油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。

一种替代的口服制剂(其中寻求控制柠檬酸盐、柠檬酸或柠檬酸盐或柠檬酸的前药、类似物或衍生物的胃肠道水解)可以使用控释制剂来实现，其中本发明的化合物被包封在肠溶衣中。

用于口服施用柠檬酸盐、柠檬酸或柠檬酸盐或柠檬酸的前药、类似物或衍生物的糖浆和酏剂可以与甜味剂诸如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖一起配制。此类制剂还可以含有缓和剂、防腐剂和用于调味和/或着色的药剂。药物组合物可以是无菌可注射水性或油性悬浮液的形式。这种悬浮液可以根据已知技术使用上述那些合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制品也可以是在无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。在可以使用的可接受的媒介物和溶剂中的是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌固定油通常被用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的固定油，包括合成的单甘油酯或双甘油酯。此外，脂肪酸诸如油酸可在制备注射剂中使用。

本发明的方法包括作为眼内制剂提供的组合物。眼内制剂包括任何适合于向眼睛输送药剂的制剂。例如但不限于，眼内制剂包括水性凝胶、隐形眼镜、树枝状聚合物、乳液、乳剂、滴眼剂、植入物、原位热敏凝胶、脂质体、微针、纳米胶束、纳米颗粒、纳米悬浮液、软膏和悬浮液。眼用制剂在本领域中是已知的，并且描述于例如Patel,A.等人，眼部药物输送系统：概述，世界药理学杂志(World J Pharmacol.)2013；2(2):47–64.Doi:10.5497/wjp.v2.i2.47；美国专利第9,636,347号；美国公开第2017/0044274和2009/0148527号；和国际公开第WO 2015/105458号中，其各自的内容通过引用并入本文。

本发明还提供了含有以下组分的治疗组合物：柠檬酸盐、柠檬酸或柠檬酸盐或柠檬酸的前药、类似物或衍生物的非盐形式；婴儿营养源，诸如婴儿配方奶粉或人类母乳；以及缓冲剂。该组合物适合于口服施用给人类婴儿，并提供基本营养和柠檬酸盐或柠檬酸的补充来源。

营养源可以含有脂肪源、碳水化合物源和蛋白质或氨基酸源中的一种或多种。蛋白质源可以含有乳清和/或酪蛋白。蛋白质源可以含有乳糖。脂肪源可以含有植物油。营养源可以含有维生素和/或矿物质。

营养源可以被设计成满足患有代谢障碍(诸如PA或MMA)的婴儿的饮食需求。例如，蛋白质或氨基酸的来源可以基本上不含缬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸。脂肪源可以不含奇数链脂肪酸。营养源可以补充有肉碱或抗生素。与用于健康婴儿的推荐值相比，营养源可以具有降低的蛋白质和/或氨基酸含量，或者它可以基本上不含蛋白质和/或氨基酸。

含有柠檬酸盐或柠檬酸的非盐形式和营养源的组合物中的缓冲剂可以含有任何缓冲剂，诸如上述那些缓冲剂。优选地，缓冲剂是氨基酸，诸如赖氨酸或鸟氨酸。缓冲剂可以是金属离子或可以含有金属离子。

本发明的组合物可以含有一种或多种抗生素。

本发明还提供了这样的制剂，该制剂允许口服递送足够量的柠檬酸盐以治疗与改变的TCA循环代谢相关的疾病、障碍和病症，而不提供过量的任何矿物质或金属离子。制剂含有一定量的柠檬酸盐，使得当该制剂被施用于人时，提供给人的每种盐的阳离子组分不超过该组分的每日推荐用量。在优选的实施例中，制剂含有每种柠檬酸盐的量不超过该柠檬酸盐中阳离子的每日推荐用量。可替代地或另外地，制剂可以包括这样的制剂，其中释放到受试者体内的每种柠檬酸盐的量不超过该柠檬酸盐中阳离子的每日推荐用量。

优选地，制剂含有以下组分：柠檬酸或其前药、类似物或衍生物；一种或多种柠檬酸盐或其前药、类似物、衍生物；以及氨基酸(作为活性剂、缓冲剂或两者)。

制剂可以是能够溶于水性介质的粉末。例如，制剂可以以干粉形式提供，可以向其中加入水以提供可以被受试者口服消耗的水溶液或悬浮液。可替代地，制剂可以以水溶液形式提供。制剂可以以单份或多份形式提供。

氨基酸可以是任何氨基酸，诸如任何上述氨基酸。优选地，氨基酸是赖氨酸、精氨酸或鸟氨酸。

在制剂中可以使用任何合适的柠檬酸盐或柠檬酸盐的组合。盐可以含有钠、锂、钾、钙、镁或锰。盐可以含有其一元、二元或三元状态的柠檬酸盐。优选地，盐是柠檬酸一钠或柠檬酸一钾。

优选的制剂包含柠檬酸和柠檬酸盐的组合，诸如柠檬酸一钠和柠檬酸一钾的组合。此类组合允许以各种离子化状态递送大量柠檬酸盐，而不会提供过量的任何单独的金属离子。

盐或矿物质的每日推荐用量可以是被确定为适合于一个人一天摄入的任何量。每日推荐用量可以是应被摄入的最小量，不应超过的最大量，或者介于两者之间的值或值的范围。每日推荐用量可以对应于本领域中已知的标准，诸如由私人、政府、医疗或健康机构颁布的标准。例如但不限于，该标准可以是由食品及农业组织和世界卫生组织(Food andAgriculture Organization and the World Health Organization)发布的可接受日摄入量(ADI)；由澳大利亚食品和杂货委员会(Australian Food and Grocery Council)发布的每日摄入量指南(DIG)；由加拿大卫生部(Health Canada)发布的每日数值(DV)和参考每日摄入量(RDI)；由美国食品和药物管理局(FDA)发布的每日数值(DV)或参考每日摄入量(RDI)；由美国国家科学院医学研究所(Institute of Medicine(IOM)of the NationalAcademies in the United States)发布的膳食参考摄入量(DRI)、估计的平均需求量(EAR)或推荐的膳食/每日津贴(RDA)；由英国卫生部发布的膳食参考值(DRV)、较低参考营养素摄入量(LRNI)或参考营养素摄入量(RNI)；由欧盟欧洲食品安全局发布的膳食参考值(DRV)、较低参考营养素摄入量(LRNI)或参考营养素摄入量(RNI)；由食品杂货批发协会(Institute of Grocery Distribution)发布的每日指导量(GDA)；或由美国国立卫生研究院发布的适当摄入量(AI)。

每日推荐用量可以考虑与个体相关的状况，诸如年龄、性别、重量、妊娠状态、哺乳状态或绝经状态。例如，对于怀孕和/或哺乳的妇女，诸如钙、铁和钾等几种矿物质的每日推荐用量高于未怀孕的未哺乳的妇女。矿物质的需求可能不同的其它患者群体包括儿童(即儿科患者)、绝经后妇女和老年人。

例如但不限于，特定矿物质的每日推荐用量可以如下：约700mg、约800mg、约1000mg、约1200mg、约1300mg、约1500mg、约2000mg或约2500mg的钙；约0.2mg、约0.22mg、约0.34mg、约0.44mg、约0.7mg、约0.89mg、约0.9mg、约1mg、约1.3mg、约2mg、约4mg、约6mg、约8mg或约10mg的铜；约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约13mg、约16mg、约18mg、约24mg、约27mg、约30mg、约36mg、约40mg或约45mg的铁；约80mg、约150mg、约200mg、约250mg、约310mg、约320mg、约350mg、约360mg、约400mg或约420mg的镁；约1.2mg、约1.5mg、约1.6mg、约1.8mg、约1.9mg、约2mg、约2.2mg、约2.3mg、约2.6mg、约3mg、约4mg、约6mg、约8mg、约10mg或约11mg的锰；约3000mg、约3500mg、约3800mg、约4000mg、约4500mg、约4700mg或约5100mg的钾；约1500mg、约2000mg、约2300mg或约2400mg、约3000mg或约3400mg的钠；以及约8mg、约9.4mg、约11mg、约12mg、约13mg、约15mg、约20mg、约25mg、约30mg、约35mg或约40mg的锌。制剂可以含有一种或多种糖，以在向受试者口服提供该制剂时改善风味。例如但不限于，糖可以是蔗糖、果糖、半乳糖、麦芽糖或乳糖。

制剂或制剂中的可溶性组分可以含有柠檬酸、柠檬酸一钠、柠檬酸一钾、赖氨酸和蔗糖。制剂可以按质量计含有约40％至约60％的柠檬酸；约1％至约10％的柠檬酸一钠；约0.1％至约5％的柠檬酸一钾；约30％至约40％的赖氨酸；以及约10％至约15％的蔗糖。制剂或制剂中的可溶性组分可以按质量计含有约49.2％的柠檬酸、约2％的柠檬酸一钠、约0.3％的柠檬酸一钾、约37.5％的赖氨酸和约11％的蔗糖。制剂或制剂中的可溶性组分可以按质量计含有约44.2％的柠檬酸、约8.3％的柠檬酸一钠、约2.3％的柠檬酸一钾、约33.8％的赖氨酸和约11.5％的蔗糖。制剂或制剂中的可溶性组分可以按质量计含有约50％至约60％的柠檬酸盐、柠檬酸或其组合；约0.2％至约1％的钠；约0.02％至约0.5％的钾；约30％至约40％的赖氨酸；以及约10％至约15％的蔗糖。

治疗代谢障碍的方法

本发明提供了通过提供一种或多种被配制成用于非口服施用的TCA循环中间体或前药、类似物或其衍生物来治疗代谢障碍、疾病或病症的方法。该组合物可以通过任何非口服途径施用。例如但不限于，该组合物可以皮下、静脉内、动脉内、肌内、皮内或直肠施用。优选地，该组合物皮下或静脉内施用。

被配制成用于非口服施用的含有TCA循环中间体或其前药、类似物或衍生物的组合物可以是上述中的任一种，诸如柠檬酸盐、顺乌头酸盐、D-异柠檬酸盐、α-酮戊二酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、苹果酸盐、草酰乙酸盐、丙酮、乙酰乙酸盐、β-羟基丁酸盐、β-酮戊酸盐或β-羟基戊酸盐。优选地，TCA循环中间体是琥珀酸盐。

代谢障碍、疾病或病症可以是与改变的TCA循环代谢相关的或者可以通过提供TCA循环的中间体来改善的任何疾病、障碍或病症，诸如任何上述的那些。

TCA循环中间体或其前药、类似物或衍生物可以以任何治疗有效剂量提供。例如但不限于，TCA循环中间体或前药、类似物或其衍生物可以以下述量提供：约0.1mg/kg受试者重量至约5g/kg受试者重量、约0.2mg/kg受试者重量至约5g/kg受试者重量、约0.5mg/kg受试者重量至约5g/kg受试者重量、约1mg/kg受试者重量至约5g/kg受试者重量、约2mg/kg受试者重量至约5g/kg受试者重量、约5mg/kg受试者重量至约5g/kg受试者重量、约0.1mg/kg受试者重量至约2g/kg受试者重量、约0.2mg/kg受试者重量至约2g/kg受试者重量、约0.5mg/kg受试者重量至约2g/kg受试者重量、约1mg/kg受试者重量至约2g/kg受试者重量、约2mg/kg受试者重量至约2g/kg受试者重量、约5mg/kg受试者重量至约2g/kg受试者重量、约0.1mg/kg受试者重量至约1g/kg受试者重量、约0.2mg/kg受试者重量至约1g/kg受试者重量、约0.5mg/kg受试者重量至约1g/kg受试者重量、约1mg/kg受试者重量至约1g/kg受试者重量、约2mg/kg受试者重量至约1g/kg受试者重量、约5mg/kg受试者重量至约1g/kg受试者重量、约1mg/kg受试者重量至约500mg/kg受试者重量、约2mg/kg受试者重量至约200mg/kg受试者重量或约5mg/kg受试者重量至约100mg/kg受试者重量。

该组合物可以根据任何合适的时间表来提供。例如但不限于，组合物可以每1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天或更长时间以单剂量提供。每种制剂可以独立地每天提供一次、两次、三次、四次或更多次。

该组合物可以在一段时间内提供。例如但不限于，该组合物可以提供持续1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周、6周、8周、12周、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、10个月、12个月、18个月或24个月。一个或多个时间段的界限可以由患者的年龄来定义。例如但不限于，提供组合物的时间段可以在患者出生时、1周、2周、3周、4周、6周、8周、10周、12周、3个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、10个月、12个月、18个月或24个月开始或结束。

本发明提供了用于治疗代谢障碍、疾病或病症的联合疗法。该联合疗法包括提供含有琥珀酸盐或其前药、类似物或衍生物的非口服制剂和含有柠檬酸盐、柠檬酸或其前药、类似物或衍生物的另一种制剂。非口服制剂可以通过任何非口服途径施用。例如但不限于，非口服制剂可以皮下、静脉内、动脉内、肌内、皮内或直肠施用。优选地，非口服制剂皮下或静脉内施用。含有柠檬酸盐、柠檬酸或柠檬酸盐或柠檬酸的前药、类似物或衍生物的制剂可以通过任何途径施用，诸如口服、肠道、胃肠外、皮下、静脉内、动脉内、肌内、皮内或直肠施用。优选地，含有柠檬酸盐、柠檬酸或柠檬酸盐或柠檬酸的前药、类似物或衍生物的制剂口服提供。

本发明的联合疗法可以用于治疗与改变的TCA循环代谢相关的或者可以通过提供TCA循环中间体改善的任何疾病、障碍或病症，诸如任何上述的那些。

在本发明的联合疗法中，琥珀酸盐或其前药、类似物或衍生物和柠檬酸盐或柠檬酸盐或柠檬酸的前药、类似物或衍生物中的每一种都以治疗有效剂量提供。例如，每种独立地可以以下述量提供：约0.1mg/kg受试者重量至约5g/kg受试者重量、约0.1mg/kg受试者重量至约5g/kg受试者重量、约0.2mg/kg受试者重量至约2g/kg受试者重量、约0.5mg/kg受试者重量至约1g/kg受试者重量、约1mg/kg受试者重量至约500mg/kg受试者重量、约2mg/kg受试者重量至约200mg/kg受试者重量或约5mg/kg受试者重量至约100mg/kg受试者重量。

在本发明的联合疗法中，含有琥珀酸盐或其前药、类似物或衍生物的非口服制剂和含有柠檬酸盐、柠檬酸或柠檬酸盐或柠檬酸的前药、类似物或衍生物的其它制剂可以以任何时间关系提供。例如，两种制剂可以同时提供，以任一次序顺序提供，或者以交替的顺序提供。在优选的方法中，首先提供含有琥珀酸盐或其前药、类似物或衍生物的非口服制剂，并且随后提供含有柠檬酸盐、柠檬酸或柠檬酸盐或柠檬酸的前药、类似物或衍生物的制剂。

在本发明的联合疗法中，如上所述，可以根据任何合适的方案独立地提供每种制剂。

如上所述，在本发明的联合疗法中，可以在一段时间内独立地提供每种制剂。

在本发明的联合疗法中，含有琥珀酸盐或其前药、类似物或衍生物的非口服制剂和含有柠檬酸盐、柠檬酸或柠檬酸盐或柠檬酸的前药、类似物或衍生物的其它制剂可以在不同的时期、同延时期或重叠时期提供。因此，联合疗法可以包括从提供一种制剂的时期到提供另一种制剂的时期的过渡。过渡可以是离散的，或者它们可以含有提供两种制剂的时期。过渡可以是逐渐的，并且可以包括第一制剂剂量的减少和第二制剂剂量的增加。

实例

实例1：琥珀酸盐的皮下施用

总结

在雄性Sprague-Dawley大鼠中皮下(SC)施用¹³C₄-琥珀酸盐后，测定其生物利用度。¹³C₄-琥珀酸盐以10mg/kg、50mg/kg和100mg/kg皮下给药。给药后8小时内采集血液样本，并通过LC-MS/MS测定测试制品的血浆浓度。药代动力学参数使用Phoenix WinNonlin(v8.0)软件测定。

在SC给药10mg/kg的¹³C₄-琥珀酸盐后，在给药后15分钟观察到最大血浆浓度(平均为3480±1512ng/mL)。皮下给药后的平均半衰期无法确定；然而，一只大鼠的半衰期为0.453小时。基于剂量标准化的AUC_last的平均暴露量为160±55.4h*kg*ng/mL/mg。根据来自先前研究的IV数据，¹³C₄-琥珀酸盐在10mg/kg时的平均生物利用度为74.4±25.7％。

在SC给药50mg/kg的¹³C₄-琥珀酸后，在给药后15分钟观察到最大血浆浓度(平均为17333±2214ng/mL)。皮下给药后的平均半衰期无法确定，这是因为相关系数(r²)小于0.85。基于剂量标准化的AUC_last的平均暴露量为210±41.0h*kg*ng/mL/mg。根据来自先前研究的IV数据，¹³C₄-琥珀酸盐在50mg/kg时的平均生物利用度为97.6±19.0％。

在SC给药100mg/kg的¹³C₄-琥珀酸盐后，在给药后15分钟观察到最大血浆浓度(平均为31000±7451ng/mL)。皮下给药后的平均半衰期为1.07小时。基于剂量标准化的AUC_last的平均暴露量为216±52.9h*kg*ng/mL/mg。根据来自先前研究的IV数据，¹³C₄-琥珀酸盐在100mg/kg时的平均生物利用度为100±24.6％。

在皮下给药10mg/kg、50mg/kg和100mg/kg的¹³C₄-琥珀酸后，暴露量随着剂量的增加呈非线性增加。较高剂量的暴露与剂量成比例，但大于与低剂量暴露成比例的剂量。

观察结果和不良反应

在雄性Sprague-Dawley大鼠中皮下给药¹³C₄-琥珀酸盐后，未观察到不良反应。

给药溶液分析

通过LC-MS/MS来分析给药溶液。测得的给药溶液浓度在表1中示出。将给药溶液稀释到大鼠血浆中，并且一式三份进行分析。所有浓度均以游离碱的mg/mL表示。在所有计算中都使用标称给药水平。

表1.测量的给药溶液浓度(mg/mL)

定量血浆样本分析

血浆样本使用以下在样本提取部分中描述的方法进行提取和分析。个体和平均血浆浓度在表2至表4中示出。所有数据均以游离碱的ng/mL表示。低于定量限度的样本不用于平均值的计算。在图1至图6中绘制了浓度相对于时间的数据。

数据分析

药代动力学参数由血浆浓度的时间进程计算并且在表2至表4中呈现。药代动力学参数由Phoenix WinNonlin(v8.0)软件使用非隔室模型确定。根据数据观察SC给药后的最大血浆浓度(C_max)和达到最大血浆浓度的时间(t_max)。使用线性梯形规则计算时间-浓度曲线下的面积(AUC)，其中计算到最后一个可量化数据点，并且其中如果适用，外推至无穷大。血浆半衰期(t_1/2)从0.693/末端消除阶段的斜率计算。平均停留时间MRT通过将力矩曲线下的面积(AUMC)除以AUC来计算。生物利用度通过将来自研究18CARNP11的单个剂量标准化的PO AUC_last值除以平均剂量标准化的IV AUC_last值来确定。对于药代动力学数据分析，任何低于定量限度(1.00ng/mL)的样本均被视为零。

表2.在雄性Sprague-Dawley大鼠中皮下施用10mg/kg的¹³C₄-琥珀酸盐后的个体和平均血浆浓度(ng/mL)

C_max：最大血浆浓度；t_max：最大血浆浓度的时间；t_1/2：半衰期，用于半衰期测定的数据点，以粗体显示；MRT_last：平均停留时间，计算到最后可观察到的时间点；AUC_last：曲线下面积，计算到最后可观察的时间点；AUC_∞：曲线下面积，外推至无穷大；ND：未确定；BLOQ：低于定量限度(1ng/mL)。

¹通过将参数除以标称剂量(以mg/kg计)进行的剂量标准化。

²通过将单个口服剂量标准化的AUC_last值除以来自先前研究的平均IV剂量标准化的AUC_last值215h*kg*ng/mL/mg确定的生物利用度。

³未确定，因为定义终点消除阶段的线具有r²<0.85。

图1是在皮下施用10mg/kg的¹³C₄-琥珀酸盐之后在单独的大鼠中在不同时间点的¹³C₄-琥珀酸盐的血浆浓度的图。

图2是在皮下施用10mg/kg的¹³C₄-琥珀酸盐之后在大鼠中在不同时间点的¹³C₄-琥珀酸盐的平均血浆浓度的图。

表3.在雄性Sprague-Dawley大鼠中皮下施用50mg/kg的¹³C₄-琥珀酸盐后的个体和平均血浆浓度(ng/mL)

C_max：最大血浆浓度；t_max：最大血浆浓度的时间；t_1/2：半衰期，用于半衰期测定的数据点，以粗体显示；MRT_last：平均停留时间，计算到最后可观察到的时间点；AUC_last：曲线下面积，计算到最后可观察的时间点；AUC_∞：曲线下面积，外推至无穷大；ND：未确定；BLOQ：低于定量限度(1ng/mL)。

¹通过将参数除以标称剂量(以mg/kg计)进行的剂量标准化。

²通过将单个口服剂量标准化的AUC_last值除以来自先前研究的平均IV剂量标准化的AUC_last值215h*kg*ng/mL/mg确定的生物利用度。

³未确定，因为定义终点消除阶段的线具有r²<0.85。

图3是在皮下施用50mg/kg的¹³C₄-琥珀酸盐之后在单独的大鼠中在不同时间点的¹³C₄-琥珀酸盐的血浆浓度的图。

图4是在皮下施用50mg/kg的¹³C₄-琥珀酸盐之后在大鼠中在不同时间点的¹³C₄-琥珀酸盐的平均血浆浓度的图。

表4.在雄性Sprague-Dawley大鼠中皮下施用100mg/kg的¹³C₄-琥珀酸盐后的个体和平均血浆浓度(ng/mL)

C_max：最大血浆浓度；t_max：最大血浆浓度的时间；t_1/2：半衰期，用于半衰期测定的数据点，以粗体显示；MRT_last：平均停留时间，计算到最后可观察到的时间点；AUC_last：曲线下面积，计算到最后可观察的时间点；AUC_∞：曲线下面积，外推至无穷大；ND：未确定；BLOQ：低于定量限度(1ng/mL)。

¹通过将参数除以标称剂量(以mg/kg计)进行的剂量标准化。

²通过将单个口服剂量标准化的AUC_last值除以来自先前研究的平均IV剂量标准化的AUC_last值215h*kg*ng/mL/mg确定的生物利用度。

³未确定，因为定义终点消除阶段的线具有r²<0.85。

图5是在皮下施用100mg/kg的¹³C₄-琥珀酸盐之后在单独的大鼠中在不同时间点的¹³C₄-琥珀酸盐的血浆浓度的图。

图6是在皮下施用100mg/kg的¹³C₄-琥珀酸盐之后在大鼠中在不同时间点的¹³C₄-琥珀酸盐的平均血浆浓度的图。

给药溶液制备和动物数据表

材料清单

动物给药与样本采集与处理

在给药前的一整夜，从动物撤回食物，直到给药后四小时才恢复食物。

*EE,1616,Is,8/21/18

所使用的天平：AS-1273

评述/观察结果：

所有动物在实验期间均表现出正常活动-CS、EE、8/21/18、CS 8/21/18

动物给药与样本采集与处理

在给药前的一整夜，从动物撤回食物，直到给药后四小时才恢复食物。

所使用的天平：AS-1273

评述/观察结果：

所有动物在研究期间均表现出正常活动-CS 8/21/18

动物给药与样本采集与处理

在给药前的一整夜，从动物撤回食物，直到给药后四小时才恢复食物。

所使用的天平：AS-1273

评述/观察结果：

所有动物在研究期间均表现出正常活动-CS 8/21/18

分析储备溶液制备

在DMSO中制备分析储备溶液(1.00mg/mL的游离药物)。

标准制品

在含有肝素钠作为抗凝剂的Sprague-Dawley大鼠血浆中制备标准品。工作溶液在50:50乙腈:水中制备，然后被加入到大鼠血浆中，以制成最终浓度为2000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL、100ng/mL、50.0ng/mL、10.0ng/mL、5.00ng/mL和1.00ng/mL的校准标准品。标准品与研究样本相同地处理。

样本提取

血浆样本在96孔板中使用乙腈手动提取，如表5中所概述的。

表5.血浆样本的制备

HPLC条件

仪器： Waters Acquity

柱： Waters HSS T3,50×2.1mm id,1.8μm

水性储层(A)： 0.1％的甲酸水溶液

有机层(B)： 在乙腈中的0.1％的甲酸

梯度计划：

流量： 800μL/分钟

注射体积： 10μL

运行时间： 1.0分钟

柱温度： 40℃

样本温度： 8℃

强自动进样器清洗： 含0.2％甲酸的1:1:l(v:v:v)水:甲醇:异丙醇

弱自动进样器清洗： 4mM甲酸铵

质谱仪条件

仪器： PE Sciex API4000

界面： 电喷雾(“涡轮离子喷雾”)

模式： 多反应监测(MRM)

气体： CUR 30、CAD 10、GS1 50、GS2 50

源温度： 500℃

监测的电压和离子*：

IS：离子喷雾电压；DP：去簇电压(declustering potential)；EP：入口电压；CE：碰撞能量；CXP：碰撞池出口电压；*所有设置均以伏特为单位

实例2：柠檬酸盐和琥珀酸盐对基础呼吸的影响

图7是示出了柠檬酸盐和琥珀酸盐对患有丙酸血症(PA)的患者的细胞中基础呼吸的影响的图。来自正常患者的成纤维细胞(样本826)和来自患有PA的患者的成纤维细胞在单独的培养基、补充有0.2mM的柠檬酸盐的培养基或补充有4mM的琥珀酸盐的培养基中培养72小时，如所指示的。氧消耗速率(OCR)采用XFe96细胞外通量分析仪(SeahorseBioscience)测量。所示出的数据为平均值±SD，并且被归一化为蛋白量平均值。在GraphPad Prism 7中，对来自单个生物学复制品和8个技术复制品的样本使用不成对的t检验来计算在所示出的组之间比较的****P<0.0001，**P<0.01。

实例3：口服施用的柠檬酸盐或静脉内施用的琥珀酸盐的药代动力学、排泄和组织分布

总结

在大鼠中分析了在单次口服施用¹⁴C-标记的柠檬酸盐或单次口服施用¹⁴C-标记的琥珀酸盐后的血浆时间进程、排泄的途径和速率以及放射性的组织分布。

剂量制剂和制备

将¹⁴C-琥珀酸盐和¹⁴C-柠檬酸盐溶解在去离子水(用于口服施用)或0.9％氯化钠(用于静脉内注射)中。在给药前一天制备制剂。

测试系统

大鼠来自Charles River Laboratories。在研究开始时，动物年龄为9-11周。

研究设计

治疗组在表6中示出。

表6.治疗组

口服给予¹⁴C-柠檬酸盐的动物在给药前保持空腹状态持续8小时，并且在给药后保持空腹状态持续4小时。¹⁴C-柠檬酸盐通过口腔喂食给予。静脉内给予¹⁴C-琥珀酸盐的动物未保持空腹状态。¹⁴C-琥珀酸盐通过尾静脉注射施用。

样本采集和分析

在口服给药后，用纱布擦拭管和给药部位，收集纱布用于后续放射性分析。在IV给药后，用纱布擦拭针和给药部位，收集纱布用于后续放射性分析。根据SOP ADME，从施用的总剂量中减去给药部位擦布总放射性，以确定剂量损失。

在给药后0.5、1、2、4、8和24小时通过心脏穿刺来采集血液和血浆，用于终末采集。将血液储存在冰块或湿冰上，直到离心以获得血浆。称取三份等分试样，与闪烁混合液混合，并通过LSC计数。

在给药后0-24小时采集尿液和粪便，并储存在湿冰上。根据MPI Research SOP，在给药后0-8小时和8-24小时通过含有2N NaOH的捕集阱抽取空气，来收集呼出的CO₂。将样本储存在环境温度下并称重。提交等分试样用于放射性分析。

在给药后24小时，用1％磷酸三钠(TSP)溶液冲洗笼子，并用纱布垫擦拭。将最终的笼子冲洗液样本和笼子擦布样本采集到单独的适当容器中，并记录每次笼子冲洗液和笼子擦布的重量。

通过液体闪烁计数(LSC)对样本进行放射性分析持续至少5分钟或100,000次累积计数。样本一式三份进行分析。

在给药后0.5、1、2、4、8和24小时，在终末采血后，将被安乐死的动物冷冻在已烷/干冰浴中，并且根据MPI Research SOP IMG-23包埋在5％的羧甲基纤维素基质中。

根据MPI Research SOP EQP-145，在设定为保持-10℃至-30℃的LeicaCM3600Cyromacrotome上对包埋的尸体进行切片。在矢状面上获取约30μm厚度的切片。在可能的情况下，采集了在块中不同关注水平处选择的适当切片，以尽可能涵盖以下组织、器官和生物体液：肾上腺、膀胱和内容物(尿)、血液(心脏)、骨、骨髓、脑、附睾、眼、脂肪(棕色)、脂肪(白色)、心脏、肾脏、大肠/盲肠和内容物、肝、肺、肌肉、胰腺、前列腺/子宫、唾液腺、皮肤、小肠和内容物、脾、胃和内容物、睾丸/卵巢、胸腺、甲状腺和肠系膜淋巴结。根据MPIResearch SOP EQP-146，使用Storm 860图像采集系统安装切片，暴露于荧光成像屏幕，并在50μm下进行扫描。

根据MPI Research SOP IMG-24，使用MCID^TM图像分析软件通过图像密度测定法进行相对于校准标准品的定量。根据积分响应(MDC/mm²)和[¹⁴C]校准标准品的标称浓度构建标准曲线。放射性的浓度以μCi/g表示，并且使用施用的[¹⁴C]测试制品剂量制剂的比活性换算为每克样本的[¹⁴C]测试制品的μg或ng当量(ng-eq/g或μg-eq/g)。对数据应用定量下限(LLOQ)。使用用于生成校准曲线的最低校准标准的放射性浓度除以剂量制剂的比活性(μCi/mg)来测定LLOQ。在图像分析期间，伪像(诸如由消化道内容物移位产生的伪像)被排除在分析之外。

样本如表7所示存储。

表7.样本储存条件

结果

在表8中示出了在来自使用单剂量口服¹⁴C-柠檬酸盐或单剂量静脉内¹⁴C-琥珀酸盐治疗24小时后处死动物的各种样本中回收的放射性百分比。

表8.放射性剂量的回收百分比

在表9中示出了在用单剂量口服¹⁴C-柠檬酸盐或单剂量静脉内¹⁴C-琥珀酸盐治疗的大鼠中放射性物质的血浆浓度。

表9.放射性物质的血浆浓度

在表10中示出了在用单剂量静脉¹⁴C-琥珀酸盐治疗的大鼠中的血液和组织中的放射性浓度。

表10.在用IV ¹⁴C-琥珀酸盐治疗的大鼠的组织中的放射性

BLQ：低于定量限度(<320ng当量测试制品/g)。

ND：不可检测(无法从背景或周围组织中辨别出样本的形状)。

NR：未显示(在切片上未显示组织)。

在表11中示出了在用单剂量口服¹⁴C-柠檬酸盐治疗的大鼠中的血液和组织中的放射性浓度。

表11.在用口服¹⁴C-柠檬酸盐治疗的大鼠的组织中的放射性

BLQ：低于定量限度(<320ng当量测试制品/g)。

ND：不可检测(无法从背景或周围组织中辨别出样本的形状)。

NR：未显示(在切片上未显示组织)。

实例4：琥珀酸盐的口服生物利用度

总结

在雄性Sprague-Dawley大鼠中评估了¹³C₄-琥珀酸盐的口服生物利用度。¹³C₄-琥珀酸盐分别以10mg/kg和50mg/kg的剂量通过静脉内(IV)和口服(PO)施用途径给药。在给药后8小时内采集血液样本，并且通过LC-MS/MS测定测试制品的血浆浓度。药代动力学参数使用Phoenix WinNonlin(v8.0)软件测定。

在IV给药10mg/kg的¹³C₄-琥珀酸盐后，平均半衰期为2.46±2.04小时。其平均清除率为4.61±0.341L/h/kg。平均分配体积为0.982±0.584L/kg。在PO给药50mg/kg的¹³C₄-琥珀酸盐后，在给药后15分钟观察到最大血浆浓度(平均为211±186ng/mL)。口服给药后的平均半衰期无法确定，因为相关系数(r²)小于0.85，或因为缺少跟随C_max的可量化数据点。基于剂量标准化的AUC_last的平均暴露量为1.84±1.58h*kg*ng/mL/mg。在以50mg/kg施用后，¹³C₄-琥珀酸盐的平均口服生物利用度为0.854±0.735％。

观察结果和不良反应

在雄性Sprague-Dawley大鼠中静脉和口服给药¹³C₄-琥珀酸盐后，未观察到不良反应。

给药溶液分析

通过LC-MS/MS来分析给药溶液。测得的给药溶液浓度在表12中示出。将给药溶液稀释到大鼠血浆中，并且一式三份进行分析。所有浓度均以游离碱的mg/mL表示。在所有计算中都使用标称给药水平。

表12.测量的给药溶液浓度(mg/mL)

*5％葡萄糖溶液

定量血浆样本分析

血浆样本使用以下在样本提取部分中描述的方法进行提取和分析。个体和平均血浆浓度在表13和表14中示出。所有数据均以游离碱的ng/mL表示。低于定量限度的样本不用于平均值的计算。在图8-11中绘制了浓度相对于时间的数据。

数据分析

药代动力学参数由血浆浓度的时间进程计算并且在表13和表14中呈现。药代动力学参数由Phoenix WinNonlin(v8.0)软件使用非隔室模型确定。在IV给药后的最大血浆浓度(C₀)通过将前两个时间点外推回t＝0来估计。根据数据观察PO给药后的最大血浆浓度(C_max)和达到最大血浆浓度的时间(T_max)。使用线性梯形规则计算时间浓度曲线下的面积(AUC)，其中计算到最后一个可量化数据点，并且其中如果适用，外推至无穷大。血浆半衰期(t_1/2)从0.693/末端消除阶段的斜率计算。平均停留时间MRT通过将力矩曲线下的面积(AUMC)除以AUC来计算。清除率(CL)根据剂量/AUC计算。稳态分布体积(V_ss)由CL*MRT(平均停留时间)计算。生物利用度通过将单个剂量标准化的PO AUC_last值除以平均剂量标准化的IV AUC_last值来确定。对于药代动力学数据分析，任何低于定量限度(1ng/mL)的样本均被视为零。

表13.在雄性Sprague-Dawley大鼠中在静脉内施用10mg/kg的¹³C₄-琥珀酸盐后的个体和平均血浆浓度(ng/mL)及药代动力学参数

C₀：外推至t＝0的最大血浆浓度；t_max：最大血浆浓度的时间；t_1/2：半衰期，用于半衰期测定的数据点，以粗体显示；MRTlast：平均停留时间，计算至最后一个可观察时间点；CL：清除率；V_ss：稳态分布体积；AUC_last：曲线下面积，计算至最后一个可观察时间点；AUC∞：曲线下面积，外推至无穷大；ND：未确定；BLOQ：低于定量限度(1ng/mL)。

¹外推至t＝0。

²通过将参数除以标称剂量(以mg/kg计)进行的剂量标准化。

图8是在静脉内施用10mg/kg的¹³C₄-琥珀酸盐之后在单独的大鼠中在不同时间点的¹³C₄-琥珀酸盐的血浆浓度的图。

图9是在静脉内施用10mg/kg的¹³C₄-琥珀酸盐之后在大鼠中在不同时间点的¹³C₄-琥珀酸盐的平均血浆浓度的图。

表14.在雄性Sprague-Dawley大鼠中口服施用50mg/kg的¹³C₄-琥珀酸盐后的个体和平均血浆浓度(ng/mL)

C_max：最大血浆浓度；t_max：最大血浆浓度的时间；t_1/2：半衰期，用于半衰期测定的数据点，以粗体显示；MRT_last：平均停留时间，计算到最后可观察到的时间点；AUC_last：曲线下面积，计算到最后可观察的时间点；AUC_∞：曲线下面积，外推至无穷大；ND：未确定；BLOQ：低于定量限度(1ng/mL)。

¹通过将参数除以标称剂量(以mg/kg计)进行的剂量标准化。

²通过将单个口服AUC_last值除以平均IV AUC_last值确定的生物利用度。

³未确定，因为定义终点消除阶段的线具有r²<0.85。

⁴未确定，由于缺少跟随C_max的可量化数据点。

图10是在口服施用50mg/kg的¹³C₄-琥珀酸盐之后在单独的大鼠中在不同时间点的¹³C₄-琥珀酸盐的血浆浓度的图。

图11是在口服施用50mg/kg的¹³C₄-琥珀酸盐之后在大鼠中在不同时间点的¹³C₄-琥珀酸盐的平均血浆浓度的图。

给药溶液制备和动物数据表

动物给药与样本采集与处理

在给药前的一整夜，从动物撤回食物，直到给药后四小时才恢复食物。

所使用的天平：AS-1273

评述/观察结果：

所有动物在实验期间均表现出正常行为-CS 6/15/18

动物给药与样本采集与处理

在给药前的一整夜，从动物撤回食物，直到给药后四小时才恢复食物。

所使用的天平：AS-1273

评述/观察结果：

所有动物在实验期间均表现出正常行为-CS 6/15/18

分析储备溶液制备

在DMSO中制备分析储备溶液(1.00mg/mL的游离药物)。

标准制品

在含有肝素钠作为抗凝剂的Sprague-Dawley大鼠血浆中制备标准品。工作溶液在50:50乙腈:水中制备，然后被加入到大鼠血浆中，以制成最终浓度为2000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL、100ng/mL、50.0ng/mL、10.0ng/mL、5.00ng/mL、2.50ng/mL和1.00ng/mL的校准标准品。标准品与研究样本相同地处理。

样本提取

血浆样本在96孔板中使用乙腈手动提取，如表15中所概述的。

表15.血浆样本的制备

HPLC条件

仪器： Waters Acquity

柱： Waters HSS T3,50×2.1mm id,1.8μm

水性储层(A)： 0.1％的甲酸水溶液

有机层(B)： 在乙腈中的0.1％的甲酸

梯度计划：

流量： 800μL/分钟

注射体积： 10μL

运行时间： 1.0分钟

柱温度： 40℃

样本温度： 8℃

强自动进样器清洗： 含0.2％甲酸的1:1:1(v:v:v)水:甲醇:异丙醇

弱自动进样器清洗： 4mM甲酸铵

质谱仪条件

质谱仪条件

仪器： PE Sciex API4000

界面： 电喷雾(“涡轮离子喷雾”)

模式： 多反应监测(MRM)

气体： CUR 30、CAD 10、GS1 50、GS2 50

源温度： 500℃

监测的电压和离子*：

IS：离子喷雾电压；DP：去簇电压；EP：入口电压；CE：碰撞能量；CXP：碰撞池出口电位；*所有设置均以伏特为单位

实例5：柠檬酸盐的口服生物利用度

总结

在雄性Sprague-Dawley大鼠中评估了¹³C₆-柠檬酸盐的口服生物利用度。¹³C₆-柠檬酸盐分别以10mg/kg和50mg/kg通过静脉内(IV)和口服(PO)施用途径给药。给药后8小时内采集血液样本，并通过LC-MS/MS测定测试制品的血浆浓度。药代动力学参数使用PhoenixWinNonlin(v8.0)软件测定。

在IV给药10mg/kg的¹³C₆-柠檬酸盐后，平均半衰期为2.34±0.207小时。其平均清除率为2.96±0.345L/h/kg。平均分布体积为1.75±0.223L/kg。在PO给药50mg/kg的¹³C₆-柠檬酸盐后，在给药后15分钟观察到最大血浆浓度(平均为1580±191ng/mL)。无法确定口服给药后的平均半衰期；然而，一只大鼠的半衰期为0.865小时。基于剂量标准化的AUClast的平均暴露量为33.2±10.9h*kg*ng/mL/mg。在以50mg/kg给药后，¹³C₆-柠檬酸盐的平均口服生物利用度为9.86±3.24％。

观察结果和不良反应

在雄性Sprague-Dawley大鼠中口服给药¹³C₆-柠檬酸盐后，未观察到不良反应。

给药溶液分析

通过LC-MS/MS来分析给药溶液。测量的给药溶液浓度在表16中示出。将给药溶液稀释到大鼠血浆中，并且一式三份进行分析。所有浓度均以游离碱的mg/mL表示。在所有计算中都使用标称给药水平。

表16：测量的给药溶液浓度(mg/mL)

*5％葡萄糖溶液

定量血浆样本分析

血浆样本使用以下在样本提取部分中描述的方法进行提取和分析。个体和平均血浆浓度在表17和表18中示出。所有数据均以游离碱的ng/mL表示。低于定量限度的样本不用于平均值的计算。在图12-15中绘制了浓度相对于时间的数据。

数据分析

药代动力学参数由血浆浓度的时间进程计算并且在表17和表18中呈现。药代动力学参数由Phoenix WinNonlin(v8.0)软件使用非隔室模型确定。在IV给药后的最大血浆浓度(C₀)通过将前两个时间点外推回t＝0来估计。根据数据观察PO给药后的最大血浆浓度(C_max)和达到最大血浆浓度的时间(T_max)。使用线性梯形规则计算时间浓度曲线下的面积(AUC)，其中计算到最后一个可量化数据点，并且其中如果适用，外推至无穷大。血浆半衰期(t_1/2)从0.693/末端消除阶段的斜率计算。平均停留时间MRT通过将力矩曲线下的面积(AUMC)除以AUC来计算。清除率(CL)根据剂量/AUC计算。稳态分布体积(V_ss)由CL*MRT(平均停留时间)计算。生物利用度通过将单个剂量标准化的PO AUC_last值除以平均剂量标准化的IV AUC_last值来确定。对于药代动力学数据分析，任何低于定量限度(1ng/mL)的样本均被视为零。

表17.在雄性Sprague-Dawley大鼠中在静脉内施用10mg/kg的¹³C₆-柠檬酸盐后的个体和平均血浆浓度(ng/mL)及药代动力学参数

C₀：外推至t＝0的最大血浆浓度；t_max：最大血浆浓度的时间；t_1/2：半衰期，用于半衰期测定的数据点，以粗体显示；MRTlast：平均停留时间，计算至最后一个可观察时间点；CL：清除率；Vss：稳态分布体积；AUC_last：曲线下面积，计算至最后一个可观察时间点；AUC∞：曲线下面积，外推至无穷大；ND：未确定；BLOQ：低于定量限度(1ng/mL)。

¹外推至t＝0。

²通过将参数除以标称剂量(以mg/kg计)进行的剂量标准化。

图12是在静脉内施用10mg/kg的¹³C₆-柠檬酸盐之后在单独的大鼠中在不同时间点的¹³C₆-柠檬酸盐的血浆浓度的图。

图13是在静脉内施用10mg/kg的¹³C₆-柠檬酸盐之后在大鼠中在不同时间点的¹³C₆-柠檬酸盐的平均血浆浓度的图。

表18.在雄性Sprague-Dawley大鼠中口服施用50mg/kg的¹³C₆-柠檬酸盐后的个体和平均血浆浓度(ng/mL)

C_max：最大血浆浓度；t_max：最大血浆浓度的时间；t_1/2：半衰期，用于半衰期测定的数据点，以粗体显示；MRT_last：平均停留时间，计算到最后可观察到的时间点；AUC_last：曲线下面积，计算到最后可观察的时间点；AUC_∞：曲线下面积，外推至无穷大；ND：未确定；BLOQ：低于定量限度(1ng/mL)。

¹通过将参数除以标称剂量(以mg/kg计)进行的剂量标准化。

²通过将单个口服AUC_last值除以平均IV AUC_last值确定的生物利用度。

³未确定，因为定义终点消除阶段的线具有r²<0.85。

图14是在口服施用50mg/kg的¹³C₆-柠檬酸盐之后在单独的大鼠中在不同时间点的¹³C₆-柠檬酸盐的血浆浓度的图。

图15是在口服施用50mg/kg的¹³C₆-柠檬酸盐之后在大鼠中在不同时间点的¹³C₆-柠檬酸盐的平均血浆浓度的图。

给药溶液制备和动物数据表

动物给药与样本采集与处理

在给药前的一整夜，从动物撤回食物，直到给药后四小时才恢复食物。

所使用的天平：AS-1273

评述/观察结果：

所有动物在实验期间均表现出正常行为-CS 6/6/18

动物给药与样本采集与处理

在给药前的一整夜，从动物撤回食物，直到给药后四小时才恢复食物。

所使用的天平：AS-1273

评述/观察结果：

所有动物在实验期间均表现出正常行为-CS 6/6/18

分析储备溶液制备

在DMSO中制备分析储备溶液(1.00mg/mL的游离药物)。

标准制品

在含有肝素钠作为抗凝剂的Sprague-Dawley大鼠血浆中制备标准品。工作溶液在50:50乙腈:水中制备，然后被加入到大鼠血浆中，以制成最终浓度为2000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL、100ng/mL、50.0ng/mL、10.0ng/mL、5.00ng/mL、2.50ng/mL和1.00ng/mL的校准标准品。标准品与研究样本相同地处理。

样本提取

血浆样本在96孔板中使用乙腈手动提取，如表19中所概述的。

表19.血浆样本的制备

HPLC条件

仪器： Waters Acquity

柱： AcquityHSS T3,50×2.1mm id,1.8μm

水性储层(A)： 0.1％的甲酸水溶液

有机层(B)： 在乙腈中的0.1％的甲酸

梯度计划：

流量： 800μL/分钟

注射体积： 10μL

运行时间： 1.0分钟

柱温度： 40℃

样本温度： 8℃

强自动进样器清洗： 含0.2％甲酸的1:1:1(v:v:v)水:甲醇:异丙醇

弱自动进样器清洗： 4mM甲酸铵

质谱仪条件

仪器： PE Sciex API4000

界面： 电喷雾(“涡轮离子喷雾”)

模式： 多反应监测(MRM)

气体： CUR 30、CAD 10、GS1 50、GS2 50

源温度： 500℃

监测的电压和离子*：

IS：离子喷雾电压；DP：去簇电压；EP：入口电压；CE：碰撞能量；CXP：碰撞池出口电位；*所有设置均以伏特为单位

实例6：柠檬酸在赖氨酸缓冲的溶液中的溶解度

分析了不同pH值下赖氨酸缓冲液对柠檬酸的溶解度的影响。结果在表20中示出。

表20.柠檬酸在赖氨酸缓冲的溶液中的溶解度

实例7：含有柠檬酸盐的制剂

在表21中提供了根据本发明的实施例的含有柠檬酸盐的制剂。

表21.含有柠檬酸盐的制剂

通过引用并入

在整个本公开中已经对其它文件，诸如专利、专利申请、专利公开、期刊、书籍、论文、网络内容进行了引用和引证。出于所有目的，所有此类文件据此通过引用以其整体并入本文。

等同物

除了本文中示出和描述的那些之外，本发明的各种修改及其许多进一步的实施例对于本领域技术人员来说将从本文件的全部内容变得显而易见，包括参考本文引用的科学和专利文献。本文的主题含有重要的信息、范例和指南，这些信息、范例和指南可以适用于本发明在其各种实施例及其等同物中的实践。