阅读说明：本技术 小分子化合物Salubrinal在治疗或预防骨质疏松和骨量减少性疾病药物中的应用 (Application of small molecular compound Salubrinal in medicine for treating or preventing osteoporosis and osteopenia diseases ) 是由 张平 于 2020-05-14 设计创作，主要内容包括：小分子化合物Salubrinal在治疗或预防骨质疏松和骨量减少性疾病药物中的应用。本发明利用OVX卵巢去势所致的绝经后骨质疏松小鼠模型、鼠尾悬吊所致的废用性骨质疏松小鼠模型,体内和原代骨髓来源细胞的体外分析以及基于细胞系的实验结果表明,Salubrinal给药可有效减轻OVX相关症状,并刺激成骨细胞的分化和抑制破骨细胞的发育。上述Salubrinal精确分子机制表明Salubrinal可在治疗或预防绝经后骨质疏松、废用性骨质疏松、以及其他因素导致的骨量减少性疾病药物中进行应用。(The application of a small molecular compound Salubrinal in medicines for treating or preventing osteoporosis and osteopenia diseases. The invention utilizes the mouse model of postmenopausal osteoporosis caused by OVX ovarian castration, the mouse model of disuse osteoporosis caused by rat tail suspension, in-vivo and in-vitro analysis of primary bone marrow source cells and experimental results based on cell lines to show that Salubrinal administration can effectively relieve OVX related symptoms, stimulate the differentiation of osteoblasts and inhibit the development of osteoclasts. The precise molecular mechanism of Salubrinal described above indicates that Salubrinal can be used in drugs for treating or preventing postmenopausal osteoporosis, disuse osteoporosis, and osteopenic diseases caused by other factors.)

小分子化合物Salubrinal在治疗或预防骨质疏松和骨量减少 性疾病药物中的应用

技术领域

本发明创造属于生物技术领域，具体涉及小分子化合物Salubrinal在治疗或预防骨质疏松和骨量减 少性疾病药物中的应用。

背景技术

内质网(endoplasmic reticulum，ER)是真核细胞内负责蛋白质合成、折叠、组装和修饰，脂质合 成以及细胞膜结构合成的重要细胞器，同时在调节细胞应激和细胞凋亡方面有显著作用，因此在维持细 胞稳态方面，内质网扮演重要角色。多种生理或病理条件例如蛋白质糖基化的抑制、钙离子的流失、蛋 白质不能形成正常的二硫键结合、突变蛋白表达以及氧化还原状态的改变等会引起未折叠蛋白或错误折 叠蛋白在内质网聚集，损伤内质网的正常生理功能，这种生理或病理改变称为内质网应激。IRE1(inositol requiringenzyme 1)、PERK(PKR-like ER kinase)和ATF6(activating transcription factor 6)三种转录因 子在内质网应激中可被激活。PERK导致其下游真核翻译起始因子2α(eukaryotictranslation initiation factor 2α，eIF2α)磷酸化，磷酸化的eIF2α可直接抑制蛋白合成，减少未折叠或错误折叠蛋白的来源， 从而维持细胞内环境的稳态。但是，过强或长时间的内质网应激反应，将会导致细胞内稳态失衡，出现 未折叠蛋白反应(unfolded proteinresponse，UPR)，引起细胞凋亡(apoptosis)。之前研究表明内质 网应激与各种疾病如糖尿病、神经退行性疾病和成骨不全有关，但内质网应激在骨量减少症发病机制中 的作用仍不清楚。

当内质网应激持续发生时，未折叠蛋白反应并不足以维持细胞稳态，细胞自噬被激活。自噬的上调 是细胞去除未折叠或错误折叠蛋白质和细胞器的重要机制。在很多病理状态下，如糖尿病中，内质网应 激的发生可以诱导自噬。在大脑缺血缺氧的病理状态下，自噬活化可以降低UPR激活，表明内质网应 激与自噬之间存在相关性。然而，内质网应激和自噬在骨质疏松和骨量减少性疾病中的重要作用仍需研 究。自噬参与了骨形成和再吸收之间的平衡调节，可由UPR诱导。它是真核细胞中的细胞内降解系统， 可将细胞质成分(包括受损的大分子和细胞器)输送到溶酶体中进行降解和再循环。自噬还能够调节骨 髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)的再生功能并参与骨质疏松和骨量 减少性疾病的发展。之前的研究表明，成骨细胞中的自噬缺乏会降低其矿化能力，并引发成骨细胞和破 骨细胞之间的不平衡，从而导致低骨量表型。然而，绝经后骨质疏松中自噬的确切功能机制仍需阐明。

骨量减少性疾病的临床表现症状为骨痛、骨关节炎、股骨头坏死等，严重可导致骨质疏松。骨质疏 松和骨量减少性疾病会导致骨组织微结构改变、骨强度降低和骨折风险增加。骨重建是一种持续的骨吸 收和骨重建过程，主要由破骨细胞和成骨细胞调控。骨重建期间骨形成减少和/或骨吸收过度均可导致 骨质疏松和骨量减少。发明表明，在一些骨科疾病的小鼠模型中，骨质疏松和骨量减少的发病机制与成 骨细胞中内质网应激可能存在一定的联系。例如，在绝经后骨质疏松以及糖皮质激素诱导的骨质疏松中 观察到成骨细胞的细胞凋亡增加。人体骨质疏松的主要类型包括绝经后骨质疏松、废用性骨质疏松和糖 皮质激素引起的骨质疏松。通常通过鼠尾悬吊或坐骨神经切除术来模拟动物的失重，以定量评估废用性 骨质疏松的发展。然而，内质网应激可能参与骨质疏松发生发展的作用机制尚需阐明。

在目前的发明中，鼠尾悬吊模型被用来发明骨质疏松的发病机制，以及内质网应激和骨质疏松之间 的关系。此外，增强破骨细胞活性和抑制成骨细胞功能的机制仍有待澄清。随着人口老龄化，骨质疏松， 特别是绝经后骨质疏松的医学和社会负担将会增加。绝经后骨质疏松可以通过多种药物治疗，包括抗吸 收剂、合成代谢剂和针对硬化蛋白的新兴单克隆疗法。然而，目前缺乏既刺激骨形成又抑制骨吸收的多 靶点靶向有效治疗药物。

Salubrinal是一种人工合成的小分子化合物(480Da，C₂₁H₁₇Cl₃N₄OS)，对eIF2α去磷酸化的选择性 抑制剂，因此可以激活eIF2α磷酸化，保护细胞免于内质网应激诱导的细胞凋亡。eIF2α的磷酸化水平 升高激活了活化转录因子4(activating transcriptionfactor-4，ATF4)的翻译，这是骨形成的关键转录因 子之一，从而为eIF2α去磷酸化诱导的疾病提供药物治疗的可能性。此外，eIF2α与Rho家族GTP酶相 互作用的机制，例如Rac1，其在骨形成和骨吸收中起重要作用，仍然需进一步阐明。发明表明，Salubrinal 可改善糖尿病、白血病、神经退行性疾病等，而Salubrinal在骨科疾病的发明还需深入研究。因此，Salubrinal对骨质疏松和骨量减少性疾病的治疗效果和机制还需探索。

发明内容

本发明创造的目的在于提供如式(I)所示的小分子化合物Salubrinal在治疗或预防骨质疏松和骨量 减少性疾病药物中的应用。

进一步，所述药物为能够对骨质疏松和骨量减少性疾病的发生、发展产生治疗、缓解、抑制、调节 的有益作用的产品或潜在物质；所述药物为单一制剂或包含有效量制剂成分的组合物，或者间充质干细 胞外泌体搭载Salubrinal的制剂，或者采用Salubrinal纳米药物载体的制剂。

进一步，所述药物的应用方式为静脉注射、皮下注射、肌肉注射、口服、局部应用、透皮吸收中的 一种或多种。

进一步，Salubrinal通过调控NFATc1和Rac1的表达抑制破骨细胞的骨吸收。

进一步，骨质疏松和骨量减少性疾病包括更年期骨质疏松、废用性骨质疏松、老年性骨质疏松、糖 皮质激素骨质疏松、成骨不全、骨质疏松性骨关节炎、股骨头坏死、肿瘤骨转移等相关疾病。

骨在骨质疏松和骨量减少性疾病的发生发展过程中，内质网应激发挥重要作用。轻度内质网应激引 起未折叠蛋白反应，调控细胞稳态，而时间过长或应激过强则引起细胞自噬或凋亡，最终导致疾病的发 生。本发明为了证实Salubrinal通过调控eIF2α信号通路治疗骨质疏松的机制，首先，采用鼠尾悬吊骨 丢失模型检测了内质网应激在骨质疏松发生发展中的重要作用。不同时间点取材，进行组织学和骨髓细 胞实验，检测鼠尾悬吊对成骨细胞分化和破骨细胞发育的作用，并进行了相关性分析。鼠尾悬吊诱导的 废用性骨质疏松介导粗面内质网扩张，并调节Bip、p-eIF2α、ATF4和CHOP的表达，证明了内质网应激 参与了废用性骨质疏松。而Salubrinal作为一个调控内质网应激信号通路的工具，通过调控内质网应激 改善鼠尾悬吊引起的骨丢失。其次，采用卵巢去势的小鼠模型，进行透射电子显微镜、Western blot和 免疫荧光分析，以评估Salubrinal对成骨细胞内质网应激和自噬的改变。采用MC3T3-E1和RAW264.7 细胞系和骨髓原代细胞检测Salubrinal对成骨细胞和破骨细胞的作用机制。通过BMD、μCT和组织学分 析在体内验证Salubrinal对OVX诱导的骨丢失的改善作用。进一步分析Salubrinal治疗骨质疏松的机制。

本发明的有益效果如下：

1、通过发明内质网应激与骨质疏松发生发展的关系，探索eIF2α磷酸化在骨重建的作用机制，从 而阐明eIF2α去磷酸化的靶向药物治疗的理论基础。

2、揭示Salubrinal药物既能促进成骨细胞的分化，又能抑制破骨细胞的发育；Salubrinal在促进骨 形成和抑制骨吸收双重作用的新型有效药物中使用。

3、验证Salubrinal通过调控内质网应激通路中eIF2α的磷酸化水平促进成骨细胞自噬，抑制破骨细 胞NFATc1和Rac1 GTPase的表达，最终调节骨重建治疗骨质疏松和骨量减少性疾病，以建立多靶点靶 向药物治疗新策略。

附图说明

图1(A)体重变化百分比。通过鼠尾悬吊实验，分别在第1、3、7和14天检测小鼠体重变化。(B) 通过H&E染色(Bar＝200μm)测定股骨远端生长板近端的骨小梁的组织学参数。鼠尾悬吊的小鼠表现 出B.Ar/T.Ar的时间依赖性降低趋势。箭头所指为骨小梁。(AC：年龄匹配的对照组，HU：鼠尾悬吊组 (n＝6)。星号(*、**和***)分别表示p<0.05、p<0.01和p<0.001的统计学差异性)。

图2鼠尾悬吊对成骨细胞和破骨细胞数目的影响。(A)MacNeal’s染色用于确定股骨远端干骺端骨小 梁表面成骨细胞的数量。鼠尾悬吊组显示成骨细胞数量随时间减少。股骨远端的代表性照片用于评估 N.Ob/BS/mm(Bar＝50μm)。箭头表示为位于骨小梁表面的成骨细胞。(B)底部为代表性的照片(Bar ＝上部200μm，Bar＝底部50μm)。TRAP染色显示鼠尾悬吊组TRAP阳性细胞数量的比率Oc.S/BS 呈时间依赖性增加。红色箭头指示为TRAP阳性细胞(n＝6)。

图3鼠尾悬吊对破骨细胞发育和功能的影响。(A)鼠尾悬吊促进破骨细胞形成。底部的显微镜照片代 表破骨细胞培养，其中TRAP染色用于比较年龄匹配对照组和鼠尾悬吊组的小鼠破骨细胞表面积(1周； Bar＝200μm)。鼠尾悬吊对破骨细胞迁移(B)和粘附(C)的影响。鼠尾悬吊组显著激活破骨细胞迁 移和粘附能力。底部为代表性的照片(Bar＝200μm)。(D-E)鼠尾悬吊对CFU-M(D)和CFU-GM(E) 的影响。在鼠尾悬吊的小鼠中鼠尾悬吊诱导的CFU-M和CFU-GM显著增加。底部的图像表示2个不同 的组，其中圆圈表示CFU-M和CFU-GM的集落(Bar＝500μm；n＝6)。

图4内质网应激在废用性骨质疏松发病机制中的作用。(A-E)为了研究内质网应激在骨质疏松发病机 理中的作用，通过免疫印迹评估p-eIF2α/eIF2α。与年龄匹配的对照相比，鼠尾悬吊组在短期内显著增加 Bip、p-eIF2α和ATF4的表达，但在长期内以时间依赖性方式降低。CHOP的表达显示出时间依赖性显著 增加(n＝6)。

图5鼠尾悬吊和Salubrinal治疗对体重、μCT、BMD和BMC的影响。(A)Salubrinal抑制鼠尾悬吊引起 的体重减轻。(B-C)Salubrinal的使用部分恢复鼠尾悬吊引起的股骨BMD(B)和BMC(C)的丢失。 (D-G)μCT图，在用Salubrinal(D)治疗2周后在纵向(顶部)和横向(底部)横切面重建股骨，Salubrinal 抑制鼠尾悬吊引起的股骨BV/TV(E)降低、股骨的骨小梁数量(Tb.N)(F)和股骨的骨小梁厚度(Tb.Th) (G)的降低。(H)Salubrinal治疗促进了鼠尾悬吊引起的股骨的骨小梁间距(Tb.Sp)增加的恢复。(I) 通过H&E染色确定股骨远端生长板近端的骨小梁的组织学参数。鼠尾悬吊组表现出较低的B.Ar/T.Ar比 率和Salubrinal治疗增加股骨B.Ar/T.Ar.，右侧为股骨远端的组织学代表性照片(Bar＝500μm)(n＝6)。 箭头指示为骨小梁。

图6成骨细胞内质网形态的电镜分析。(A)透射电子显微镜结果显示，在用Salubrinal处理后，鼠尾 悬吊小鼠成骨细胞中粗面内质网的超微结构变化。粗面内质网用红色箭头指示。N表示细胞核。Tb表 示骨小梁(Bar＝2μm)。(B)成骨细胞细胞质中粗面内质网区的定量分析。测量粗面内质网面积的百 分比(n＝6)。

图7 Salubrinal对成骨细胞分化和骨髓腔细胞凋亡的影响。(A)Salubrinal诱导的鼠尾悬吊小鼠中成骨 细胞数量的显著增加。下方为三组MacNeal’s染色的组织学代表性显微照片(Bar＝50μm)。位于骨小 梁表面的成骨细胞用箭头指示。(B)使用DeadEnd TM荧光TUNEL系统来检测在股骨远端骨髓腔中细 胞的凋亡。在鼠尾悬吊的小鼠中观察到Salubrinal对鼠尾悬吊诱导的骨髓腔细胞凋亡的显著抑制。下方 为三组TUNEL染色的代表性显微照片(Bar＝200μm)(n＝6)。箭头指示凋亡细胞。

图8 Salubrinal对成骨细胞集落形成单位-成纤维细胞集落形成的影响。(A)CFU-Ob的比较。(B)体 外0.5μM salubrinal给药对成骨细胞分化的影响。(C)CFU-F的比较。(D)体外0.5μM Salubrinal给药 对CFU-F的影响。底部为显微镜下细胞学代表性图片(n＝6)。

图9体内使用Salubrinal对破骨细胞发育的影响。通过Salubrinal皮下注射显著抑制鼠尾悬吊组中的破 骨细胞的数量。上方为代表性照片(Bar＝200μm)。股骨远端干骺端的TRAP阳性细胞为红色，用黄色 箭头表示(n＝6)。

图10体内体外使用Salubrinal对破骨细胞形成的影响。(A)体内使用Salubrinal抑制破骨细胞形成(Bar ＝200μm)。(B)体外Salubrinal给药对成熟破骨细胞形成的影响。在从鼠尾悬吊小鼠分离的骨髓来源 的细胞中，Salubrinal以3种剂量(1、2和5μM)给药0-6天或4-6天，结果显示Salubrinal以时间和 剂量依赖性的方式显著减少破骨细胞的表面积比率。

图11体内体外使用Salubrinal对破骨细胞迁移、粘附能力的影响。(A)Salubrinal诱导破骨细胞迁移数 目的减少。(B)体外发明显示，观察到破骨细胞迁移随着Salubrinal药物浓度的增加，以剂量依赖性 的方式(1、2和5μM)显著减少。(C)Salubrinal减少了鼠尾悬吊引起的破骨细胞粘附数目的增加。 (D)体外发明还表明，破骨细胞粘附随着Salubrinal药物浓度的增加，以剂量依赖性方式显著降低。

图12 Salubrinal给药对CFU-M和CFU-GM的影响。(A-B)Salubrinal诱导的鼠尾悬吊小鼠中CFU-M(A) 和CFU-GM(B)数量的减少。图中圆圈表示集落(Bar＝500μm)。(C-D)在鼠尾悬吊小鼠来源的骨 髓细胞中体外分别加入1、2和5μM Salubrinal，观察到CFU-M和CFU-GM以剂量依赖性方式显著降低 (Bar＝500μm)，底部为代表性图片。(n＝6)。

图13免疫组织化学染色和股骨远端NFATc1的定量分析。顶部为代表性图片。红色圆圈中的为NFATc1 阳性细胞(Bar＝100μm)(n＝3)。

图14 Salubrinal体外和体内给药对内质网应激的影响。(A-B)分别对RAW264.7细胞(A)和MC3T3-E1 细胞(B)的细胞活力进行MTT测定。(C)来自不同组的MC3T3-E1细胞的代表性免疫荧光图像(蓝 色：DAPI，绿色：TUNEL⁺细胞，Bar＝100μm)。图片上部为TUNEL⁺细胞的定量分析(S：Salubrinal 和Tm：衣霉素)。

图15 Salubrinal保护成骨细胞抑制内质网应激的蛋白质印迹分析的代表性图像。(A)MC3T3-E1细胞系 的蛋白标本。(B)骨组织蛋白标本。右侧为定量分析。实验重复三次(n＝3)。

图16成骨细胞自噬囊泡和内质网形态的电镜分析。(A)透射电子显微镜结果显示，卵巢去势组中的 自噬囊泡数量明显减少，而Salubrinal处理组中成骨细胞中自噬囊泡的数量明显增加。(B)在用Salubrinal 处理后，OVX成骨细胞中粗面内质网的超微结构变化。粗面内质网用红色箭头表示。N表示细胞核。Tb 表示骨小梁(Bar＝2μm)。下方为成骨细胞细胞质中粗面内质网区的定量分析。测量粗面内质网面积 的百分比(n＝6)。

图17 Salubrinal通过eIF2α调控体内外LC3和p62的表达促进成骨分化。(A-B)在体内实验中，不同实 验组小鼠的股骨标本中Western blot的代表性图像。分别显示了Bip、p-eIF2α、LC3II/I、p62和ALP的表 达水平。(C-D)在体外实验中，分离不同实验组小鼠的骨髓细胞样本，eIF2αsiRNA对eIF2α蛋白水平 的部分沉默，检测了p-eIF2α、ALP、LC3II/I和p62的蛋白质表达。该实验重复三次(n＝3)。

图18 Salubrinal通过eIF2α调控体外Atg7的表达促进成骨细胞的自噬。(A)Atg7siRNA对Atg7蛋白水 平的部分沉默。(B)成骨细胞系转染siRNA Atg7后，不同处理组细胞的代表性免疫荧光图像(Salubrinal 通过eIF2α调控体外Atg7的表达促进成骨细胞的自噬，蓝色：DAPI，红色：LC3)。(C)Bip、Atg7、 LC3II/I、p62不同处理后蛋白质免疫印迹分析代表性图像，实验重复三次(NC＝用非特异性对照siRNA 处理组，S：Salubrinal，Tm：衣霉素，3MA：一种自噬抑制剂，rapa：雷帕霉素，Bar＝50μm)。

图19 Salubrinal促进体外成骨细胞的分化及矿化(A-B)CFU-F和CFU-OB的比较。从3组小鼠(Sham、 OVX和注射Salubrinal的OVX小鼠)中分离骨髓来源的细胞。(C)在成骨细胞诱导培养基中培养后， 测定成骨细胞矿化(茜素红染色)。图为代表性的照片(n＝6)。

图20 MacNeal’s染色。Salubrinal诱导OVX小鼠中成骨细胞数量的增加。下方为代表性照片(Bar＝50μm)。 位于骨小梁表面的成骨细胞用箭头表示(n＝6)。

图21 Salubrinal抑制破骨细胞系NFATc1的表达。(A-D)加入5-20μM的Salubrinal降低RAW264.7细 胞中NFATc1、组织蛋白酶K、DcStamp和Atp6v0d2的mRNA水平。(E)加入5-20μM的Salubrinal， RAW264.7细胞中NFATc1以剂量依赖性的方式降低。(F)通过Salubrinal给药减少基于荧光的破骨细 胞活性。

图22Salubrinal对Rac1 GTP酶活性的影响。(A-B)YFP/CFP发射比在整个细胞上取平均值，并将时间-10 min作为标准(Salubrinal处理前10min)。(bar＝10μm)。(C)eIF2αsiRNA对eIF2α蛋白水平的 部分沉默，加入20μM Salubrinal对Rac1活性的作用。NC＝用非特异性对照siRNA处理组。

图23 Rac1 siRNA对TRAP和组织蛋白酶K表达的作用。(A)Rac1 siRNA对Rac1蛋白水平的部分沉默， 以及NFATc1、TRAP和组织蛋白酶K的蛋白表达。NC＝用非特异性对照siRNA处理。(B)部分沉默Rac1 后的NFATc1、TRAP和组织蛋白酶K的相对mRNA水平。Rac1siRNA降低了TRAP和组织蛋白酶K的表 达，但NFATc1表达保持不变。

图24 Salubrinal对破骨细胞的影响。(A)成熟破骨细胞的覆盖面积。Salubrinal抑制OVX诱导的破骨细 胞区域的增加。(B)破骨细胞的迁移试验。Salubrinal给药减少了OVX诱导的破骨细胞迁移的增加。 (C)破骨细胞的粘附测定。Salubrinal减少了OVX诱导的破骨细胞粘附增加(n＝6)。

图25 Salubrinal体外给药对破骨细胞活性的影响。(A)将Salubrinal以3个剂量(1，2和5μM)加入 从OVX小鼠分离的骨髓来源的细胞，处理0-6天或4-6天。右侧的四对图像显示TRAP染色的代表性破 骨细胞。(Bar＝200μm)。上图：0-6天体外给药Salubrinal的效果，实验重复三次。每孔计数5个视 野。下图：4-6天体外Salubrinal给药的影响。(B)破骨细胞的迁移。(C)破骨细胞的粘附(n＝6)。

图26 Salubrinal体内给药对破骨细胞的影响。(A)TRAP染色。股骨远端生长盘近侧骨小梁的TRAP阳 性细胞为红色，用红色箭头表示。(B)RANKL，组织蛋白酶K和NFATc1的免疫印迹分析代表性图像。 实验重复三次(n＝9)。

图27 Salubrinal改善OVX引起的骨丢失表征。(A)卵巢去势和给药Salubrinal对体重，BMD和BMC的 影响。(A)Salubrinal抑制OVX诱导的体重增加。(B)Salubrinal给药抑制OVX诱导的腰椎、股骨和 胫骨中BMD和BMC的减少。(C)μCT代表性图像。纵向(顶部)和横向(底部)横切面股骨重建图 像。(D-G)在使用Salubrinal治疗4周后，Salubrinal改善OVX诱导的股骨BV/TV减少(D)、股骨小 梁数(Tb.N)(E)和股骨小梁厚度(Tb.Th)的减少(F)，并抑制骨小梁分离度(Tb.Sp)的增加(G)。 (H)股骨远端H&E染色。黑色箭头所指为骨小梁。(I)钙黄绿素标记的皮质骨，MAR为矿物沉积率 (n＝16)。

具体实施方式

下面通过结合具体实施例对本发明创造进行进一步说明。

本说明书、说明书附图和权利要求书中使用的符号说明如下：

1Salubrinal调控内质网应激对骨丢失的改善作用的实施例

1.1实验部分

首先，采用54只C57BL/6(～16周龄，20g)雌性小鼠来评估内质网应激在失重诱导的骨质疏松发 生发展中的作用。将这些小鼠分成9组：年龄匹配对照组(AC)和8个鼠尾悬吊组(HU，按悬吊时间 分组：3h、6h、12h、1d、2d、3d、7d和14d；每组实验动物数均n＝6)。不同时间点取材，进行 组织学和骨髓细胞实验，检测鼠尾悬吊对成骨细胞分化和破骨细胞发育的影响。蛋白质免疫印记分析不 同时间点内质网应激相关蛋白的表达。相关性分析验证内质网应激与成骨细胞分化和破骨细胞发育之间 的相互关系。其次，将81只小鼠随机分成三组(n＝27)：年龄匹配的对照组(AC)、鼠尾悬吊组(HU) 和皮下注射Salubrinal治疗的鼠尾悬吊组(US)，治疗2周。扫描骨矿密度(BMD)和骨显微结构，使 用苏木素-伊红(H&E)染色分析骨量变化。组织学和骨髓细胞实验检测Salubrinal对成骨细胞分化和破 骨细胞发育的影响。使用透射电子显微镜、免疫组化、末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末 端标记法(TUNEL)染色和蛋白质印记分析(Western blot)等方法分析Salubrinal调控内质网应激减少 骨丢失的作用机制。

1.2结果

1.2.1鼠尾悬吊引起小鼠体重和股骨B.Ar/T.Ar的改变

在为期2周的实验中，年龄匹配对照组小鼠体重增加。然而，鼠尾悬吊组的小鼠表现出体重随时间 的减少的趋势。与年龄匹配的对照相比，在这4个鼠尾悬吊的实验组中观察到体重显著降低，有统计学 差异(所有p<0.001；如图1A)。

与体重变化趋势相同的是，来自鼠尾悬吊组小鼠的股骨远端的组织学标本显示出B.Ar/T.Ar的时间 依赖性降低趋势。与年龄匹配的对照相比，在HU 3d(p<0.05)、HU 7d(p<0.001)和HU 14d(p<0.001) 组中观察到体重显著降低，有统计学差异，而在鼠尾悬吊1d的小鼠中没有观察到显著差异(如图1B)。

1.2.2鼠尾悬吊引起股骨成骨细胞和破骨细胞数目的改变

采用MacNeal’s组织学染色分析各组组织内成骨细胞数量的变化，检测部位为股骨远端生长盘近侧。 染色结果显示，与年龄匹配对照组的小鼠相比，鼠尾悬吊组小鼠分别在悬吊1d、3d、7d时，骨小梁表 面成骨细胞数量呈时间依赖性下降，成骨细胞数量显著减少，有统计学差异；同时，与年龄匹配的对照 组小鼠相比，悬吊14d时也显著下降(p<0.001；如图2A)。

采用TRAP组织学染色检测各组组织内阳性破骨细胞的数量，采用该方法评估股骨远端干骺端的骨 吸收。染色结果显示，鼠尾悬吊组小鼠，在HU 3d(p<0.01)、HU 7d(p<0.01)和HU 14d(p<0.001) 时，TRAP阳性细胞与骨小梁表面的比例以时间依赖性的方式显著增加(如图2B)。

1.2.3鼠尾悬吊在体外实验中刺激破骨细胞和CFU-M/CFU-GM的发育

首先，与从年龄匹配对照组小鼠分离的骨髓来源细胞相比，来自鼠尾悬吊组的小鼠的细胞表现出多 核破骨细胞占据的表面积的增加(如图3A)。其次，我们采用迁移和粘附实验检测了不同组来源的破 骨细胞的的功能的变化，从鼠尾悬吊组的小鼠分离的前破骨细胞比来自年龄匹配的对照组细胞更具迁移 性(如图3B)。

在粘附实验测定中，结果显示，从鼠尾悬吊组的小鼠分离的细胞表现出与年龄匹配的对照相比的粘 附能力显著增加，有统计学差异(如图3C)。

此外，为了确定Salubrinal对破骨细胞祖细胞增殖的影响，使用从小鼠髂骨分离的骨髓源细胞，进 行CFU-M和CFU-GM的测定。结果显示，CFU-M(p<0.001；如图3D)和CFU-GM(p<0.001；如图3E) 的数量在鼠尾悬吊组中显著增加。

1.2.4鼠尾悬吊诱导内质网应激的发生

与对照组相比，鼠尾悬吊组股骨组织中Bip蛋白的表达显著增加，在HU 3h(p<0.01)，HU 6h (p<0.05)和HU 12h(p<0.01)的小鼠中，但是在HU 2d，HU 3d，HU 7d(所有p<0.05)和HU 14 d(p<0.01)的悬吊小鼠中均下降。

此外，与年龄匹配的对照相比，鼠尾悬吊显著增加了HU 3h和HU 6h中p-eIF2α的表达(均p< 0.05)，HU 12h组与年龄匹配的对照组蛋白表达一致(p＝0.126)，但在HU 1d，HU3d，HU 7d和 HU 14d中均呈时间依赖性降低(均p<0.05)。鼠尾悬吊组增加了HU 3h和HU 6h中ATF4的表达水平 (均p<0.05)。与年龄匹配的对照组相比，HU 12h(p＝0.176)和HU 1d(p＝0.053)没有显著变化， 而在HU 2d，HU 3d，HU 7d(所有p<0.05)和HU 14d(p<0.01)中它们均以时间依赖性的方式下降。

在HU 12h后，CHOP的表达显示出时间依赖性显著增加(所有p<0.01)(如图4A-E)。

1.2.5 Salubrinal改善鼠尾悬吊引起的骨丢失表型

与年龄匹配的对照相比，鼠尾悬吊小鼠体重显著减轻(p<0.001)，然而，皮下注射2周Salubrinal 后，显著抑制了鼠尾悬吊引起的体重减轻(p<0.001；如图5A)。

采用数字化双能X线骨密度测量仪检测了各组小鼠标本骨密度和骨矿含量变化的百分比。与年龄匹 配的对照组相比，鼠尾悬吊组的小鼠表现出BMD和BMC百分比的显著降低(均p<0.001)。然而，用Salubrinal治疗后的鼠尾悬吊组小鼠，在股骨部位，显示出BMD和BMC显著恢复，有统计学差异(p<0.05； 如图5B和C)。

采用Micro-CT的方法，检测各组小鼠不同标本股骨的三维结构，骨小梁结构参数。股骨远端的扫 描结果(如图5D)表明，股骨骨小梁的体积分数BV/TV从18.7±1.9％(HU)增加到24.1±1.7％(US) (p<0.05；如图5E)。骨小梁数量从5.16±0.4 1/mm(HU)增加20％至6.19±0.42 1/mm(US) (p<0.05；如图5F)，在本实验中使用Salubrinal，股骨小梁厚度增加12％(p<0.01；如图5G)。 然而，随着Salubrinal治疗，股骨的骨小梁间距减少了7％(p<0.05；如图5H)。

此外，与年龄匹配的对照组小鼠相比，鼠尾悬吊小鼠表现出B.Ar/T.Ar的降低(p<0.001)。然而， salubrinal的使用显著恢复了B.Ar/T.Ar(如图5I)。

1.2.6 Salubrinal促进成骨细胞内质网稳态的恢复

将股骨远端标本进行透射电子显微镜分析，检测成骨细胞中内质网的形态。在鼠尾悬吊的动物中 观察到，在成骨细胞内质网膜上显著的粗面内质网的扩张和核糖体数量的减少。与年龄匹配的对照小鼠 (8.6±2.0％)相比，鼠尾悬吊小鼠(20.0±1.4％)显示成骨细胞中粗面内质网面积的百分比显著增 加。

然而，用Salubrinal处理的鼠尾悬吊小鼠表现出粗面内质网的显著恢复，有统计学差异14.2±0.3％ (p<0.05；如图6A-B)。

1.2.7.1 Salubrinal促进的体内成骨细胞增加，抑制骨髓腔细胞凋亡

MacNeal’s染色结果显示，与年龄匹配的对照组相比，鼠尾悬吊2周的小鼠骨小梁表面成骨细胞数 量显著减少(p<0.001)。然而，Salubrinal治疗两周显著增加成骨细胞数量(p<0.001；如图7A)。

TUNEL染色结果显示，与年龄匹配的对照小鼠相比，鼠尾悬吊的小鼠股骨远端上的TUNEL阳性细 胞数量显著增加(p<0.001)，而与鼠尾悬吊小鼠相比，Salubrinal治疗后TUNEL阳性细胞数显著减少 (p<0.001；如图7B)。

1.2.7.2 Salubrinal促进成骨细胞分化和成纤维细胞的发育

ALP阳性集落的百分比在对照组中为30.5±1.7％，在鼠尾悬吊组中为25.6±2.2％(p<0.05)。 使用1mg/kg的Salubrinal将体内成骨细胞分化增加至41.3±1.6％(p<0.001；如图8A)。在体外使 用Salubrinal，浓度0.5μM后，ALP阳性集落的百分比增加5.1％(p<0.05；如图8B)。

与年龄匹配的对照相比，鼠尾悬吊小鼠的CFU-F显著降低(p<0.01)。与从鼠尾悬吊的小鼠分离 的细胞相比，Salubrinal处理的鼠尾悬吊小鼠产生更多的CFU-F集落(p<0.01；如图8C)。此外，与从 模型组小鼠分离的细胞相比，体外0.5μM的Salubrinal的使用增加了CFU-F集落的形成(p<0.01；如 图8D)。

1.2.8 Salubrinal抑制体内和体外破骨细胞的骨吸收

与年龄匹配的对照小鼠相比，远端股骨的TRAP染色显示Oc.S/BS^f在鼠尾悬吊的小鼠中显著增加(p <0.001)。然而，Salubrinal显著抑制鼠尾悬吊组中比值的升高(p<0.001；如图9)。

使用骨髓来源的细胞进行破骨细胞形成实验，来自鼠尾悬吊小鼠的细胞表现出多核破骨细胞占据的 表面积的显著增加(p<0.001)。然而，与未用Salubrinal处理的鼠尾悬吊小鼠相比，Salubrinal处理的 小鼠显著降低了破骨细胞表面积比率(p<0.001；如图10A)。

为了进一步评估Salubrinal对体外成熟破骨细胞形成的影响，将三个剂量的Salubrinal(1、2和5μM) 在细胞培养第1至第6天加入从鼠尾悬吊小鼠分离的骨髓来源的细胞。与鼠尾悬吊小鼠相比，6天培养 后，Salubrinal体外给药导致破骨细胞形成显著减少。

为了检测Salubrinal对破骨细胞晚期发育的影响，在细胞培养第4至第6天于鼠尾悬吊组中加入 Salubrinal，结果发现，Salubrinal以时间和剂量依赖性方式显著降低破骨细胞形成(所有p<0.001；如 图10B)。

通过迁移和粘附实验评估破骨细胞功能。从鼠尾悬吊的小鼠中分离的破骨前细胞比来自年龄匹配的 对照小鼠的迁移能力更强(p<0.001)。此外，与鼠尾悬吊组的小鼠相比，从Salubrinal处理的小鼠分 离的前破骨细胞迁移率显著降低(p<0.001；如图11A)。

在体外给药的实验中，我们观察到随着Salubrinal药物浓度的增加，破骨细胞以剂量依赖性的方式 显著降低了破骨细胞迁移能力(所有p<0.001；如图11B)。

在M-CSF介导的粘附实验中，从鼠尾悬吊的小鼠中分离的细胞比来自年龄匹配的对照的细胞具有 更强的粘附性(p<0.001)。与从鼠尾悬吊小鼠分离的细胞相比，来自Salubrinal处理的小鼠的细胞破 骨细胞粘附性显著降低(p<0.001；如图11C)。

在体外给药的实验中，实验结果显示破骨细胞粘附能力随着Salubrinal药物浓度的增加，以剂量依 赖性的方式显著降低(1、2和5μM，所有p<0.001；如图11D)。

1.2.9 Salubrinal抑制成熟破骨细胞的CFU-M和CFU-GM

我们检测了CFU-M和CFU-GM的数量，表明来自鼠尾悬吊小鼠的破骨细胞祖细胞的数量显著高于 来源于对照组小鼠分离的骨髓细胞(p<0.001)。来源于Salubrinal处理的鼠尾悬吊小鼠的细胞CFU-M 和CFU-GM数量显著降低，有统计学差异(均p<0.001；如图12A和B)。在使用1、2和5μM的Salubrinal 后，观察到CFU-M和CFU-GM以剂量依赖性方式显著降低，有统计学差异(均p<0.001；如图12C和 D)。

1.2.10 Salubrinal降低NFATc1的表达

NFATc1的免疫组织化学染色结果显示，与对照组相比，鼠尾悬吊后破骨细胞NFATc1表达上调，而 Salubrinal处理的小鼠中的NFATc1阳性细胞数量显著降低(均p<0.01；如图13)。

1.2.11 Salubrinal通过抑制内质网应激促进骨形成

衣霉素是一种细胞内质网应激的诱导剂，我们使用细胞系，加入0.2至5μM的Salubrinal，评估它 们的对成骨细胞和破骨细胞的细胞增殖作用。结果表明，Salubrinal以剂量依赖性方式部分抑制衣霉素 诱导的RAW264.7细胞中的内质网应激(在1μM和5μM的Salubrinal下p<0.05；如图14A)。Salubrinal 以剂量依赖性方式恢复衣霉素诱导的MC3T3-E1细胞活力降低(在1μM的Salubrinal浓度下p<0.05组 且在5μM的Salubrinal浓度下p<0.01；如图14B)。在衣霉素存在下，MC3T3-E1细胞系中TUNEL阳 性细胞显著增加，而Salubrinal处理后显著降低TUNEL阳性细胞数(均p<0.001；如图14C)。

1.2.12 Salubrinal调控内质网应激相关蛋白的表达情况

蛋白质印迹分析的结果表明，Salubrinal增加了Bip(p<0.05)、p-eIF2α/eIF2α(p<0.05)和ATF4 (p<0.01)的水平，但降低了MC3T3-E1细胞中CHOP的表达水平(p<0.01；如图15A)。Salubrinal 增加磷酸化eIF2α相对表达的水平，而与鼠尾悬吊小鼠相比，它降低RANKL、组织蛋白酶K和CHOP的 蛋白表达水平(所有p<0.05；如图15B)。

1.3小结

本实施例通过废用骨质疏松模型证明了内质网应激在骨质疏松症发病机制中的关键作用。本实施例 利用小鼠模型和原代骨髓来源细胞的体外分析显示，Salubrinal给药可有效减轻细胞凋亡，以及通过抑 制eIF2α的去磷酸化来刺激成骨细胞生成和抑制破骨细胞发育和功能。目前的实验还提供了Salubrinal 作为治疗药物的可能性，通过抑制与鼠尾悬吊相关的内质网应激来逆转骨质疏松症的骨质流失。

2 Salubrinal通过调控eIF2α信号通路治疗骨质疏松机制的实施例

2.1实验部分

将123只C57BL/6(～16周龄，20g)雌性小鼠随机分为3组：假手术组、卵巢去势(OVX)组和皮 下注射Salubrinal治疗的卵巢去势组(n＝41)。造模4周治疗4周，进行透射电子显微镜、Western blot、 免疫荧光分析，以评估Salubrinal对成骨细胞内质网应激和自噬的改变。采用MC3T3-E1和RAW264.7 细胞系和骨髓原代细胞检测Salubrinal对成骨细胞和破骨细胞的作用机制。分离股骨标本进行骨密度扫 描和骨显微结构及组织学分析，以检测Salubrinal改善OVX诱导的骨丢失的作用。

2.2结果

2.2.1 Salubrinal调控成骨细胞内质网应激和自噬的激活

由于自噬在形态上表现为酸性囊泡(AVs)的积累表征，本发明通过透射电子显微镜检测远端股骨 中成骨细胞的AVs。

实验结果表明，与假手术组相比，卵巢去势组中的自噬囊泡数量明显减少。然而，在Salubrinal处 理的OVX组中成骨细胞中自噬囊泡的数量明显增加(如图16A)。

通过透射电子显微镜分析股骨远端的成骨细胞以观察内质网的形态。在OVX小鼠中观察到粗面内 质网的显著扩张和粗面内质网膜上核糖体的数量的减少。与假手术组小鼠(8.97±1.09％)相比，OVX 小鼠(19.65±2.71％)显示成骨细胞中粗面内质网区域的百分比显著增加(p<0.01)。然而，用Salubrinal 处理的OVX手术组的小鼠粗面内质网显著恢复，有统计学差异(11.40±0.69％，p<0.01；如图16B)。

2.2.2 Salubrinal通过eIF2α调控LC3和p62的表达促进成骨分化

蛋白质印迹分析的结果表明，在不同组小鼠的股骨样品中，Salubrinal增加了Bip、p-eIF2α、ALP和 LC3II/I的水平，而p62的表达减少(如图17A和B)。为了发明eIF2α在Salubrinal对内质网应激和自 噬中的作用，使用eIF2αsiRNA转染骨髓细胞，检测内质网应激和自噬标志物的表达。eIF2αsiRNA的转 染阻断了Salubrinal对骨髓细胞中p-eIF2α、ALP、LC3II/I和p62的蛋白质水平的影响(如图17C和D)。

2.2.3 Salubrinal通过eIF2α调控Atg7的表达促进成骨细胞的自噬

为了进一步证明Salubrinal通过eIF2α调控成骨细胞自噬的机制，我们将MC3T3-E1成骨细胞系用 siRNA Atg7沉默(如图18A)，并对细胞进行了Tm诱导，Salubrinal、3MA以及雷帕霉素的处理。处理 48小时后进行了自噬标志性蛋白LC3的免疫荧光检测以及细胞总蛋白的提取。

结果显示，与空白对照组相比，Tm诱导后LC3表达降低，而Salubrinal处理后红色荧光显著增加， 3MA作为自噬抑制剂可显著降低LC3的表达，雷帕霉素作为阳性对照，显著增加LC3的表达，与Salubrinal 作用一致。与对照组相比，转染siRNA Atg7后，Salubrinal则不能显著改善Tm诱导引起的自噬水平的 降低(如图18B)。

蛋白质印迹分析的结果表明，与对照组相比，转染siRNA Atg7后，Tm长时间的诱导引起未折叠蛋 白的增加，Salubrinal通过eIF2α去磷酸化的抑制，促进Bip蛋白的表达，而部分沉默Atg7后，不能通 过提高自噬相关蛋白Atg7的表达显著促进细胞的自噬。这些实验结果表明，Salubrinal通过eIF2α调控 体外Atg7的表达促进成骨细胞的自噬(如图18C)。

2.2.4 Salubrinal促进成骨细胞的分化及矿化

分离小鼠股骨、髂骨和胫骨骨髓来源细胞，进行成骨细胞诱导分化，结果显示，与假手术组小鼠和 卵巢去势小鼠组相比，注射Salubrinal的OVX小鼠的骨髓细胞产生更多的成纤维细胞集落CFU-F(OVX 对OVX+Sal的p<0.001)和成骨细胞集落CFU-OB(OVX对OVX+Sal的p<0.01)(如图19A和B)。

茜素红染色的结果显示，与假手术组相比，OVX减少了矿化结节的数量，而Salubrinal处理的小鼠 促进了成骨细胞的矿化(如图19C)。

2.2.5 Salubrinal促进成骨细胞的骨形成

MacNeal’s染色结果显示，与假手术对照组相比，OVX手术4周后显示小鼠骨小梁表面成骨细胞数 量显著减少(p<0.001)。然而，Salubrinal药物治疗4周之后显著增加了成骨细胞数量(p<0.001； 如图20)。

2.2.6 Salubrinal抑制破骨细胞系NFATc1的表达

为了深入了解Salubrinal对破骨细胞生成、迁移和粘附作用的分子机制，本发明评估了Salubrinal 对RAW264.7单核细胞/巨噬细胞的影响。向RAW264.7细胞培养基中加入RANKL，结果显示，48小时 内显著增加破骨细胞分化所必需的转录因子mRNA，包括NFATc1和破骨细胞标记物组织蛋白酶K的 mRNA水平。此外，RANKL处理提高了调控破骨细胞细胞融合的DcStamp和Atp6v0d2的mRNA水平(如 图21A-D)。研究结果证实，加入不同浓度5、10和20μM的Salubrinal，Salubrinal以剂量依赖性方式 降低RANKL诱导的这些mRNA水平的升高。此外，蛋白质印迹分析表明，Salubrinal以剂量依赖性方式 降低NFATc1的蛋白质水平(如图21E)。基于荧光的破骨细胞活性测定显示，加入Salubrinal降低了 RANKL促进的破骨细胞活性的增加(20μM与0μM相比，p<0.05；如图21F)。

2.2.7 Salubrinal不同浓度对Rac1 GTP酶活性的作用

使用基于FRET的单细胞成像，检测Salubrinal对Rac1 GTP酶活性水平的影响。不同浓度10和20μM 的Salubrinal处理后，YFP/CFP的比值降低，表明加入Salubrinal降低了Rac1的活性水平(如图22A和B)。 当使用eIF2α特异的siRNA处理RAW264.7细胞时，与非特异性对照siRNA处理的细胞相比，Salubrinal 对Rac1活性下调作用显著减弱(p<0.05；如图22C)。

2.2.8通过Rac1 siRNA抑制TRAP和组织蛋白酶K的水平

使用对Rac1特异的siRNA，处理RAW264.7细胞，检测Rac1部分敲除在NFATc1、TRAP和组织蛋 白酶K的表达中的作用。结果显示，给予Salubrinal后，TRAP和组织蛋白酶K的蛋白水平下调。与Salubrinal 对这些蛋白质水平的影响一致，Rac1的部分沉默抑制RANKL驱动的TRAP mRNA和组织蛋白酶K mRNA 的上调，但不改变NFATc1的mRNA水平，表明在该实验中NFATc1的表达不受Rac1的调控(如图23A-B)。

2.2.9 Salubrinal对破骨细胞形成、迁移和粘附的影响

与假手术组小鼠分离的细胞相比，从OVX小鼠分离的细胞表现出成熟破骨细胞所占表面积增加， 而从注射Salubrinal的OVX小鼠分离的细胞，破骨细胞表面积比率显著减少(均p<0.001；如图24A)。

与假手术组相比，从OVX小鼠分离的破骨细胞迁移能力增加，而从注射Salubrinal的OVX小鼠分离 的破骨细胞迁移减少(均p<0.001；如图24B)。在M-CSF介导的粘附中，与假手术组相比，从OVX 小鼠分离的破骨细胞具有更强的粘附性(p<0.05)，而Salubrinal处理的OVX小鼠的破骨细胞粘附性减 弱(p<0.01；如图24C)。

2.2.10 Salubrinal抑制成熟破骨细胞发育

本实验进一步检测Salubrinal对成熟破骨细胞形成的作用，将三种剂量的Salubrinal(1、2和5μM) 加入从OVX小鼠分离的骨髓来源细胞中。与对照组相比，在6天培养期(第0-6天)体外给药Salubrinal 导致多核破骨细胞的表面积比率显著减少(1μM与0μM相比，2μM与5μM相比，均p<0.001；给 药1μM与2μM相比，p<0.05)。为了检测Salubrinal对破骨细胞晚期发育的影响，仅在第4至6天 加入Salubrinal，证实Salubrinal还能够以剂量依赖性方式使破骨细胞表面积的显著降低(浓度1μM与 0μM相比，p<0.05，浓度5μM与2μM相比，p<0.001；如图25A)。

我们使用从OVX小鼠分离的的骨髓来源细胞进行Salubrinal的处理。首先，在OVX小鼠中，Salubrinal 体外给药降低了破骨细胞的迁移数目(p<0.001；如图25B)。其次，Salubrinal体外给药也显著降低 了破骨细胞的粘附能力(p<0.001；如图25C)。

2.2.11 Salubrinal抑制破骨细胞活性

与假手术组相比，股骨远端的TRAP染色结果显示OVX小鼠中破骨细胞表面积比率(Oc.S/BS^f)显 著增加(p<0.001)。然而，Salubrinal给药显著抑制OVX引起的破骨细胞活性的增加(p<0.001；如图 26A)。

与OVX组小鼠相比，Salubrinal降低RANKL、组织蛋白酶K和NFATc1的蛋白表达水平(如图26B)。 2.2.12Salubrinal改善OVX诱导的骨丢失表型

实验结果显示，与假手术组小鼠相比，OVX小鼠体重增加，而在第5周至第8周皮下注射Salubrinal 显著抑制OVX诱导的体重增加(均p<0.001；如图27A)。

与没有注射Salubrinal的OVX小鼠相比，Salubrinal给药的OVX小鼠BMD和BMC，在腰椎、股骨 和胫骨中的显著增加，有统计学差异。(所有p<0.001；如图27B)。

股骨远端的Micro-CT扫描结果(如图27C)表明OVX小鼠中BV/TV(p<0.001)，Tb.N(p<0.01) 和Tb.Th(p<0.05)的值显著降低，并且与假手术组相比，Tb.Sp的值显著增加(p<0.05)。然而，Salubrinal 治疗后，BV/TV从18.41±1.87％(OVX)增加到24.46±2.57％(OVX+Sal)(p<0.05；如图27D)。 小梁数显著增加27.35％，从4.68±0.49 1/mm(OVX)增加至5.96±0.42 1/mm(OVX+Sal)(p<0.05； 如图27E)，股骨的小梁厚度显著增加了22.19％(p<0.05；如图27F)。然而，随着Salubrinal治疗， 股骨的小梁间距显著减少了23％(p<0.001；如图27G)。

为了评价Salubrinal对骨结构的影响，通过H&E染色测量这三组中股骨远端的骨小梁面积/总面积 (B.Ar/T.Ar)(如图27H)。与假手术组小鼠相比，OVX小鼠B.Ar/T.Ar显著降低(p<0.001)。然而， Salubrinal给药显著恢复了B.Ar/T.Ar(p<0.001)。

在OVX小鼠模型中，我们使用钙黄绿素标记法检测了长骨中的新骨形成参数。与假手术组相比， 在OVX小鼠的皮质骨中观察到矿物沉积率的降低(p<0.001)。然而，与OVX组相比，Salubrinal处理 的小鼠显著增加了矿物沉积率(p<0.001；如图27I)。

2.3小结

该实施例表明，Salubrinal通过调节成骨细胞的内质网应激-自噬轴，并通过调节eIF2α、NFATc1和 Rac1来改变破骨细胞的增殖和分化来减弱骨丢失。目前，很少有药物和化学试剂可用于同时刺激成骨 细胞和抑制破骨细胞。该发明提出了药物治疗预防骨质流失的可能性。本专利利用OVX小鼠模型体内 和原代骨髓来源细胞的体外分析以及基于细胞系的实验结果表明，Salubrinal给药可有效减轻OVX相关 症状，并刺激成骨细胞的分化和抑制破骨细胞的发育。针对Salubrinal的精确分子机制的进一步分析保 证了用于对抗绝经后骨质疏松症的新治疗策略的潜在能力。

上述两个实施例通过对废用性骨丢失模型和绝经后骨质疏松小鼠模型的使用，得出了以下结论：

1)内质网应激在骨质疏松症的发展中发挥重要作用；

2)Salubrinal通过调控骨髓细胞的分化显著改善鼠尾悬吊和卵巢去势引起的骨丢失；

3)Salubrinal通过调控eIF2α介导的内质网应激-自噬轴促进成骨细胞的骨形成；

4)Salubrinal通过调控NFATc1和Rac1的表达抑制破骨细胞的骨吸收；

综上所述，本发明表明Salubrinal通过调控eIF2α信号通路治疗骨质疏松的机制，在鼠尾悬吊引起 的骨丢失模型中，内质网应激发挥重要作用。短时间内形成细胞保护作用，而应激时间过长则导致细胞 凋亡的发生。Salubrinal作为eIF2α去磷酸化的选择性抑制剂，通过调控内质网应激信号通路，恢复细胞 稳态，调节骨髓细胞的分化，从而改善鼠尾悬吊引起的骨丢失。在卵巢去势的绝经后骨质疏松模型中， Salubrinal通过调节成骨细胞的内质网应激-自噬轴并通过调节eIF2α、NFATc1和Rac1来改变破骨细胞的 增殖和分化来减弱骨丢失。本专利利用OVX小鼠模型体内和原代骨髓来源细胞的体外分析以及基于细 胞系的实验结果表明，Salubrinal给药可有效减轻OVX相关症状，并刺激成骨细胞的分化和抑制破骨细 胞的发育。针对Salubrinal的精确分子机制的进一步分析保证了用于对抗绝经后骨质疏松的新治疗策略 的潜在能力。本发明可为Salubrinal临床治疗骨质疏松提供新的理论依据。

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神 和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。