具体实施方式

较佳实施例的详细说明

如上文所概述，提供一种用于治疗红斑性狼疮的方法，其是借由向患病个体投与含有S-HCQ及医药学上可接受的赋形剂的医药组合物，其中该医药组合物基本上不含R-HCQ。

含有S-HCQ且基本上不含R-HCQ的医药组合物包括对映异构体过量不少于99％的S-HCQ，其定义为组合物中S-HCQ及R-HCQ的总量中S-HCQ的百分比减去R-HCQ的百分比。举例而言，以组合物中S-HCQ加R-HCQ的总重量计，具有99％的对映异构体过量的S-HCQ的本发明的医药组合物含有99.5重量％的S-HCQ及0.5重量％的R-HCQ。基本上不含R-HCQ为医药组合物的S-HCQ的对映异构体过量可为99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％及100％。

具有上述对映异构体过量的S-HCQ可借由美国临时专利申请案序号63/013,219及美国专利5,314,894中所阐述的方法制备。

医药组合物中的S-HCQ可呈游离硷形式或为医药学上可接受的盐形式。医药学上可接受的盐可为但不限于硫酸盐、磷酸盐及盐酸盐。在医药组合物的特定实施例中，S-HCQ为硫酸盐。

为实施治疗方法，向罹患红斑性狼疮的个体投喂对应于100mg至800mg(例如100、200、300、400、500、600、700及800mg)日剂量的S-HCQ的量的医药组合物。在特定方法中，每天投喂200mg的S-HCQ。

在上述方法中，医药组合物可为颗粒、锭剂、胶囊、丸剂、散剂、溶液、悬浮液或糖浆形式。例示性医药组合物为用于经口投喂的丸剂形式。

颗粒、锭剂、胶囊、丸剂、散剂、溶液、悬浮液及糖浆的制备可借由习知技术，诸如美国专利申请公开案2018/0194719中所描述的彼等技术。

如上文所提及，医药组合物包括医药学上可接受的赋形剂。医药学上可接受的赋形剂可为配药技术中使用的任何生理惰性赋形剂，包括但不限于黏合剂、稀释剂、界面活性剂、崩解剂、润滑剂/助滑剂及着色剂。特定赋形剂可为美国专利申请公开案2008/020634中所述的赋形剂。

上述方法可用于治疗罹患全身红斑性狼疮或皮肤红斑性狼疮的个体。对患有全身红斑性狼疮及并发性狼疮性肾炎的个体的治疗也在本发明的范畴内。

无需进一步详细描述，都相信熟习此项技术者可基于本文中揭露内容最大程度地利用本揭露内容。因此，以下特定实施例应理解为仅为描述性的且无论如何不以任何方式限制本揭露内容的其余部分。本文中所引用的所有出版物及专利文献均以全文引用的方式并入。

实施例1

HCQ、S-HCQ及R-HCQ对佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯/离子霉素刺激的PBMC合成IL-17的影响

在活体外药力学分析中测试羟氯喹(HCQ)及其纯光学异构体S-羟氯喹(S-HCQ；对映异构体过量为99.0％)及R-羟氯喹(R-HCQ；对映异构体过量为98.3％)，以确定其在抑制用佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)及离子霉素刺激人类外周血单核细胞(PBMC)中介白素17(IL-17)产生方面的功效。

人类PBMC系购自(PCS-800-011^TM)且按提供商所建议来解冻。细胞在37℃、5％CO₂下在补充有10％胎牛血清(Gibco,10437-028)、10mM HEPES(Gibco,15630-080)及100U/mL青霉素/链霉素(Gibco,15140-122)的RPMI-1640培养基(Gibco,11875-093)中培养。

PBMC以10⁶个细胞/毫升的密度接种于96孔圆底微量盘(Corning,7007)的各孔中，随后在25μM、50μM或100μM HCQ、S-HCQ或R-HCQ不存在及存在的情况下，用25ng/ml PMA及1μg/ml离子霉素刺激，每一者均溶解于乙醇中。培养基中乙醇的最终浓度为0.75％。用5μM甲基泼尼松龙处理的PBMC充当阳性对照。

在培育48或72小时后，收集细胞培养物上清液，且储存于-80℃下直至分析。使用人类IL-17Quantikine ELISA套组(R&D system,D1700)，根据产品信息分析由PMA/离子霉素刺激的PBMC诱导的IL-17水平。结果展示于表1中。

当在HCQ、S-HCQ及R-HCQ中的每者存在下培育48h或72h时，以剂量依赖型方式抑制由PMA/离子霉素刺激的PBMC产生的IL-17水平。HCQ、S-HCQ或R-HCQ抑制IL-17的绝对IC50在50～100μM之间。HCQ、S-HCQ及R-HCQ对PBMC中由PMA/离子霉素诱导的IL-17产生的抑制率之间不存在重大差异，也即至少20个百分点。

表1对PMA/离子霉素刺激的PBMC中IL-17合成的影响

^aND＝无法侦测

实施例2

药力学

在MRL/lpr小鼠(一种人类皮肤红斑性狼疮模型)中检查HCQ、S-HCQ及R-HCQ的药力学。参见Furukawa等人,1996,J.Invest.Dermatol.107；95-100；Furukawa等人,2009,Autoimmun.Rev.8:495-499；及Shimomatsu等人,2016,Mod.Rheumatol.26:744-748。八周龄MRL/lpr小鼠系购自Jackson Laboratory(ME,USA)，且在恒定的温度及湿度控制下维持12h明暗循环。随意给予动物水及食物。所用S-HCQ及R-HCQ具有上文实施例1中所阐述的对映异构体过量。

具有14～15只小鼠的各组在约15周龄开始用媒剂(含10％EtOH的PBS)、低剂量(20mg/kg)或高剂量(40mg/kg)HCQ、S-HCQ或R-HCQ处理。媒剂组及低剂量组中的小鼠自15周龄至31周龄每日经口处理一次，持续16周。高剂量组中的小鼠自15周龄至29周龄每日经口处理一次，持续14周。给药体积保持一致，为10mL/kg。

经处理的MRL/lpr小鼠的体重

用媒剂或用20mg/kg HCQ、S-HCQ或R-HCQ处理的MRL/lpr小鼠自第0天(初始给药日)至第111天每周称重一次。40mg/kg组中的动物自第0天至第90天每日称重。在媒剂与所有20mg/kg组之间(参见图1A)及在媒剂与所有40mg/kg组之间(参见图1B)未观察到平均体重的明显差异。

经处理的MRL/lpr小鼠的存活率

自15周龄的第一个给药日开始，每日记录活小鼠及死小鼠的数目。在开始给药后观察存活率10～11周(70～80天)。

结果展示于图2A及图2B中。在整个观察期中，在20mg/kg(图2A)及40mg/kg(图2B)给药组中，用S-HCQ处理的小鼠与用媒剂、HCQ及R-HCQ处理的小鼠相比展示较高的分数存活率。

经处理的MRL/lpr小鼠中的皮肤病变

使用前述评分量表，每周自背颈、前额、鼻子及耳朵区域对MRL/lpr小鼠中的炎症及皮肤病变进行二次评分。参见Keil等人,2016,Arthritis Res.Ther.18:243。简言之，无皮肤病变的动物评分为0，具有极少脱发伴有发红及少量分散病变的动物评分为1，且具有发红、结痂及小面积受累脱发的动物评分为2。

绘制在第一次给药后各组皮肤病变的平均评分，对于媒剂及低剂量组自第68天至第111天及对于高剂量组自第68天至第90天，且展示于图3A中。资料显示，与媒剂以及HCQ及R-HCQ处理相比，用20mg/kg及40mg/kg的S-HCQ处理在减少MRL/lpr小鼠的皮肤炎症及病变的发作方面为优越的。

借由比较整个测试期间各处理的平均皮肤病变评分来重新分析资料。将媒剂组及低剂量组初始给药后第68天至第111天的皮肤病变评分取平均值且进行比较，如图3B所示。将媒剂组及高剂量组初始给药后第68天至第90天的皮肤病变评分取平均值且进行比较，如图3C所示。在测试期间，仅S-HCQ在低剂量及高剂量下均显著降低皮肤病变评分。

结果表明，S-HCQ在减少MRL/lpr小鼠自发出现狼疮样皮肤病变方面优于其他测试治疗剂。

血尿素氮及肌酐浓度

由在研究结束时收集的血液样品制备血浆。使用FUJI DRI-CHEM 4000i仪器，按照制造商的指示分析其血尿素氮(BUN)水平及肌酐浓度。BUN及肌酐水平升高表明肾功能受损。结果展示于图4A及图4B中。

与进行任何其他处理的彼等动物相比，用40mg/kg的S-HCQ处理的MRL/lpr小鼠的BUN水平显著降低。参见图4A。

转向肌酐浓度，其在用HCQ(20mg/kg)及R-HCQ(20mg/kg及40mg/kg)处理的小鼠中较低。参见图4B。在用40mg/kg S-HCQ处理的动物中，肌酐浓度的降低最显著。参见图4B。

实施例3

活体外心脏毒性分析

HCQ、S-HCQ及R-HCQ的预测心脏毒性是借由测定此等药物抑制人类ether-a-go-go相关基因(hERG)电压闸控钾通道活性的能力来检查。药物活体内抑制hERG可导致获得性长QT症候群，其通常导致多形性心室心动过速心律不整及猝死。本研究中使用的S-HCQ及R-HCQ的对映异构体过量分别为99.8％及98.3％。

使用习知膜片钳技术确定对hERG的抑制作用。用人类hERG cDNA稳定转染人类胚胎肾细胞(HEK-293)以低密度接种于胶原蛋白涂布的35mm细胞培养皿上1～7天。对于单细胞膜片钳记录，细胞内溶液含有130mM KCl、10mM NaCl、1mM MgCl2、10mM EGTA、5mM MgATP及10mM HEPES(用KOH将pH值调节至7.2)。细胞外溶液含有非细胞溶液(mM)：137mM NaCl、4mM KCl、1.8mM CaCl₂、1mM MgCl₂、10mM D(+)-葡萄糖及10mM HEPES(用NaOH将pH值调节至7.4)。所有量测均在室温下进行。

HCQ、S-HCQ、R-HCQ以0.3μM、1μM、3μM、10μM及30μM的浓度添加至细胞外溶液。也在此等浓度下测试二磷酸氯喹(CQ)，已知其副作用比HCQ更严重。西沙必利(Cisapride)，一种经证实的hERG抑制剂，用作阳性对照。

在细胞捕捉后，实施脉冲方案，其涉及自-80mV保持电位步进至+40mV持续4s以使hERG通道失活。随后将膜电压步进回至-50mV持续4s，以引起尾电流，随后返回至保持电位。以20s的脉冲间间隔重复此顺序。在整个实验中，在化合物添加之前(阴性对照)及在添加测试化合物，也即HCQ、S-HCQ、R-HCQ、CQ或西沙必利(阳性对照)之后开始施加电压方案。在整个实验中连续监测引发的峰值尾电流幅度。各化合物自低浓度至高浓度依次施加至同一细胞五分钟。

借由比较施加化合物前后的尾电流幅度来计算hERG通道的抑制百分比，电流差相对于对照标准化。借由量测步进至-50mV时的尾电流来计算hERG峰值尾电流的幅度。在各化合物添加前后量测电流。将个别细胞结果相对于其各自的媒剂对照标准化，且取结果的平均值。使用抑制百分比值计算各测试化合物的IC50。在此分析中，化合物的IC50值愈高，其作为hERG抑制剂的有效性愈小，且因此其预期的心脏毒性愈低。

结果表明，HCQ、R-HCQ及CQ的IC50分别为4.84μM、4.20μM及0.98μM。CQ为比HCQ及R-HCQ更有效的hERG功能抑制剂，证实活体外心脏毒性分析预测活体内副作用的能力。

出乎意料地，S-HCQ的IC50为10.96μM。具有最高的IC50值，S-HCQ为所测试的最无效的hERG抑制剂。因此，在所测试的化合物中，预期S-HCQ具有最小的活体内心脏毒性。

总结以上实例，活体外药力学研究(实施例1)揭露S-HCQ与R-HCQ之间不存在显著差异。

相比之下，MRL/lpr小鼠中的活体内药力学研究(实施例2)表明，S-HCQ处理使得分数存活率较高及狼疮样皮肤病变发病率较低。此外，在用40mg/kg的S-HCQ处理的动物中，MRL/lpr小鼠血浆中的BUN及肌酐浓度降低最显著，表明此化合物对肾功能更具保护性。此等结果提供S-HCQ治疗狼疮患者，尤其患有并发性狼疮性肾炎的彼等患者优于HCQ及R-HCQ的强有力的基本原理。

最后，S-HCQ为测试药物中心脏毒性最小的(实施例3)，加强上述选择S-HCQ治疗狼疮患者优于HCQ及R-HCQ的基本原理。

以下参考文献，一些上文已引用，可用于更好地理解本申请案的背景：

Chhonker et al.2018,J Chromatogr B Analyt Technol Biomed LifeSci.1072:320-327.

Furukawa et al.1996,J Invest Dermatol.107(1):95-100.

Furukawa et al.2009,Autoimmun Rev.8(6):495-9.

Jiang et al.2007,J Immunol.178(11):7422-31.

Keil et al.2016,Arthritis Res Ther.18(1):243.

Knight et al.2015,Ann Rheum Dis.74(12):2199-206.

Rupanagudi et al.2015,Ann Rheum Dis.74(2):452-63.

Shimomatsu et al.2016,Mod Rheumatol.26(5):744-8.

Vugmeyster et al.2010,MAbs.2(3):335-46.

以上参考文献的内容以全文引用的方式并入本文中。

其他实施例

本说明书中所揭露的所有特征可以任何组合形式组合。本说明书中所揭露的各特征可经服务相同、等效或类似目的的替代性特征置换。除非另外明确说明，否则所揭露的各特征仅为一系列通用等效或类似特征的实施例。

根据以上描述，熟习此项技术者可容易确定本发明的基本特征，且在不背离本发明的精神及范畴的情况下可对本发明作出各种改变及修改以使其适应各种用途及条件。因此，其他实施例也在以下申请专利范围的范畴内。