阅读说明：本技术 一种羟氯喹的新用途 (New application of hydroxychloroquine ) 是由 张思功 李玉民 于 2020-05-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种羟氯喹的新用途,所述用途为羟氯喹用于制备治疗肝脏缺血再灌注损伤药物中的应用。本发明羟氯喹的新用途,通过对中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的产生进行抑制,能够对肝脏缺血在灌注损伤起到良好的治疗作用,减小肝脏的损伤面积。(The invention discloses a new application of hydroxychloroquine, which is an application of hydroxychloroquine in preparing a medicament for treating liver ischemia-reperfusion injury. The new application of the hydroxychloroquine can play a good role in treating perfusion injury of liver ischemia and reduce the injury area of the liver by inhibiting the generation of neutrophil extracellular trapping NETs (NETs).)

一种羟氯喹的新用途

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种羟氯喹的新用途。

背景技术

羟氯喹(Hydroxychloroquine)为4-氨基喹啉衍生物类抗疟药，适用于疟疾、过敏性及自身免疫性疾病。近年来，随着休克治疗的进步以及动脉搭桥术、溶栓疗法、经皮腔内冠脉血管成形术、心脏外科体外循环、心肺脑复苏，断肢再植和器官移植等方法的建立和推广应用，使许多组织器官缺血后重新得到血液再灌注。多数情况下，缺血后再灌注可使组织器官功能得到恢复，损伤的结构得到修复，患者病情好转康复；但有时缺血后再灌注，不仅不能使组织、器官功能恢复，反而加重组织、器官的功能障碍和结构损伤。这种在缺血基础上恢复血流后组织损伤反而加重，甚至发生不可逆性损伤的现象称为缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury)。目前，并没有羟氯喹用于治疗肝脏缺血再灌注损伤的相关研究。

发明内容

本发明解决现有技术中的缺陷和技术不足，提供一种羟氯喹在治疗肝脏缺血再灌注损伤中的新用途。

本发明通过下述技术方案实现：

一种羟氯喹的新用途，所述用途为羟氯喹用于制备治疗肝脏缺血再灌注损伤药物中的应用。

将羟氯喹制备成药物制剂，其制剂形式为片剂、胶囊或缓释剂。

所述药物允许羟氯喹的施用剂量为80μg/g/天。

一种羟氯喹的新用途，所述羟氯喹在制备抑制中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)产生的药物中的应用。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

本发明为一种羟氯喹的新用途，通过对中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的产生进行抑制，能够显著保护小鼠肝脏免受缺血再灌注损伤，具有良好的治疗作用，可以大大的减小肝脏受到损伤的面积。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为羟氯喹治疗显著减轻了小鼠肝脏缺血再灌注损伤；

图2为羟氯喹通过抑制小鼠体内NETs形成而起到肝脏保护作用；

图3为羟氯喹体外抑制小鼠中性粒细胞形成NETs；

图4为TLR9激动剂阻断了羟氯喹体外抑制NETs形成的作用；

图5为羟氯喹通过阻断TLR9而起到抑制NETs形成的关键蛋白PAD4的Rac2的作用。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例

选取约8-10周龄18只SCID小鼠和15只c57BL/6小鼠，分别随机分为假手术组(Sham组)、羟氯喹治疗组(HCQ组)和缺血再灌注组(I/R组)三组。HCQ组给予羟氯喹(HCQ 组)(根据小鼠重量每日给予羟氯喹80μg/g)灌胃，Sham组和I/R组给予生理盐水灌胃，持续三天后对I/R组和HCQ组小鼠制作缺血再灌注损伤小鼠模型，而Sham组只进行开腹手术而不进行肝脏缺血干预。完成后对小鼠的血清中肝功能指标ALT和AST水平进行检测，血清中NETs形成相关指标NETs和cfDNA进行测定，并取肝脏组织行HE染色和免疫组化染色，观察肝脏的损伤程度。

从图1(c)中可以看出，缺血再灌注组(I/R组)肝脏损伤面积达60％，而羟氯喹治疗组(HCQ组)肝脏损伤面积只有7％左右；同时图1(a)和(b)显示，小鼠血清中ALT和 AST的含量在缺血再灌注组(I/R组)中较Sham组分别升高了约120倍和90倍，而在HCQ 组中，ALT和AST的含量相比I/R组显著下降。I/R组肝脏HE染色展示了典型的肝脏缺血再灌注损伤，而HCQ治疗后缺血再灌注损伤显著减轻。

进一步研究显示羟氯喹的治疗作用与抑制了缺血再灌注时NETs大量形成相关。图2(a 和b)显示I/R组中小鼠血清中NETs和cfDNA显著增高，而羟氯喹显著抑制了NETs形成。图2(c-f)中相关性分析提示NETs标记物(NETs和cfDNA)显著和肝酶(ALT和AST)正相关。PCR研究发现I/R组中NETs形成的关键酶(PAD-4)显著上调，而羟氯喹抑制了PAD-4 的表达(图2g)；免疫印迹法测定肝组织中NETs标记物(cit-H3蛋白)在I/R组显著增高，而羟氯喹干预使组织中cit-H3蛋白显著降低(图2h)。肝组织免疫组化发现I/R组肝组织中有大量NETs形成，而羟氯喹干预使肝组织中cit-H3表达显著降低(图2)。

密度梯度离心法分离小鼠中性粒细胞，细胞培养箱37℃体外培养。用不同浓度羟氯喹 (10ng/ml、100ng/ml、10ug/ml、100ug/ml)预处理，培养半小时后用PMA(100nM)刺激，4小时后加入核酸染料Sytox green(终浓度0.4μM)，荧光显微镜观察NETs形成情况，拍照并定量统计NETs形成水平(绿色平均荧光强度的大小)。图3为不同浓度羟氯喹处理后 NETs形成的结果，可以看出相比blank组，PMA组的NETs形成和荧光强度都显著增加；羟氯喹组随浓度增加NETs形成逐渐减弱，并且羟氯喹在10ug/ml和100ug/ml浓度显著抑制了NETs 形成。

TLR-9激动剂对羟氯喹抑制NETs形成效果的影响。分离的中性粒细胞分为4组：PMA(100nM)、PMA+羟氯喹(50uM)、PMA+羟氯喹+Control-ODN、PMA+羟氯喹+CpG-ODN(TLR9激动剂；10μg/ml)，培养4小时后加入核酸染料Sytox green(终浓度0.4μM)，荧光显微镜观察NETs形成情况，拍照并定量统计NETs形成水平。免疫印迹法检测细胞中TLR-9，以及NETs形成关键蛋白PAD4和Rac2的表达。从图4可知，加入TLR-9激动剂(CpG-ODN)后，羟氯喹抑制NETs形成的作用被阻断；从图5可知，加入羟氯喹后，NETs形成关键蛋白(PAD4 和Rac2)的表达显著降低；而加入CpG-ODN后TLR-9的表达显著升高，PAD4和Rac2蛋白的表达也显著增加，羟氯喹抑制NETs形成关键蛋白的作用被阻断。由此可以明确羟氯喹通过阻断TLR9而起到抑制NETs形成的作用。

其中：

图1.羟氯喹减轻肝脏I/R损伤。SCID和C57两种模型鼠给予羟氯喹灌胃三天后诱发肝脏I/R，测定血清ALT，AST，HE染色定量肝损伤。统计分析采用非配对t检验，***P<0.001；统计分析采用非配对t检验。Sham：假手术组；I/R：缺血再灌注组；HCQ：羟氯喹治疗组；SCID：重症免疫缺陷鼠；C57：c57BL/6小鼠。

图2.HCQ通过抑制NETs形成减轻肝脏I/R损伤。血清NETs，cfDNA在HCQ治疗组显著低于I/R组(图a,b)；血清NETs、cfDNA和血清中ALT，AST的相关性分析(c-f)；肝组织中PAD4mRNA的测定采用RT-PCR(图g)。Western blot测定肝组织中cit-H3(图h)；肝组织免疫组化染色cit-H3(NETs标记物)。统计分析采用非配对t检验和Pearson相关分析.**P<0.01；***P<0.001；g放大倍数×200；Sham组：假手术组；I/R组：缺血再灌注组；HCQ：羟氯喹治疗组。

图3.羟氯喹在体外抑制小鼠中性粒细胞形成NETs。在图a中，羟氯喹浓度为 10ng/ml,100ng/ml,10ug/ml和100ug/ml；放大倍数×100；图b中，NETs形成水平采用 ImageJ软件定量，以荧光强度表示；图c中，NETs形成水平采用人工计数法，以百分比表示。#：与Blank组比较P<0.05；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001：与PMA组比较。

图4.TLR9激动剂(CpG-ODN)逆转了HCQ体外抑制NETs形成的作用。中性粒细胞按分为4组，给予CpG-ODN(TLR9激动剂；10μg/ml)和HCQ预处理30分钟后,再给予PMA刺激形成NETs，免疫荧光检测TLR9激动剂对NETs形成的影响。**，PMA组VS.PMA+HCQ组，P<0.01；&&&，PMA+HCQ+CpG-ODN组VS.PMA+HCQ组，P<0.001。

图5.羟氯喹显著抑制了NETs形成关键蛋白(PAD4和Rac2)的表达。中性粒细胞按分为4组，给予CpG-ODN(TLR9激动剂；10μg/ml)和HCQ预处理30分钟后,再给予PMA刺激形成NETs，Western blot检测细胞中TLR-9，以及NETs相关蛋白PAD4、Rac2的表达。*， P<0.05，PMA+HCQ组vs.PMA组；#P<0.05，PMA+HCQ+CpG-ODN组vs.PMA+HCQ组。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。