一种用于治疗新型冠状病毒感染肺炎的药物组合物
阅读说明：本技术 一种用于治疗新型冠状病毒感染肺炎的药物组合物 (Pharmaceutical composition for treating novel coronavirus infection pneumonia ) 是由 陈依军 杨勇 叶俊梅 赵维俊 于 2021-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及医药技术领域,本发明提供了一种联合应用的药物组合物,包括艾地苯醌与氯喹/羟氯喹或其药学上可成的盐。艾地苯醌能显著降低氯喹/羟氯喹引起的心脏毒性,可以大幅提高氯喹/羟氯喹的临床用药剂量。本发明联合用药的新用途将有助于在提高氯喹/羟氯喹用药剂量的同时确保安全性,可用于临床治疗新冠病毒感染肺炎。(The invention relates to the technical field of medicines, and provides a pharmaceutical composition for combined application, which comprises idebenone and chloroquine/hydroxychloroquine or pharmaceutically acceptable salts thereof. Idebenone can remarkably reduce cardiotoxicity caused by chloroquine/hydroxychloroquine, and can greatly improve clinical application dosage of chloroquine/hydroxychloroquine. The new application of the combined medicine is beneficial to improving the dosage of chloroquine/hydroxychloroquine and simultaneously ensuring the safety, and can be used for clinically treating the pneumonia infected by the new coronavirus.)
技术领域
本发明涉及生物医药领域，涉及一种药物组合物及其应用，具体将艾地苯醌联合氯喹/羟氯喹或其药学上可成的盐进行联用，应用于新冠病毒感染的治疗，并减轻氯喹/羟氯喹所导致心脏毒性。
背景技术
目前的三重变异病毒是名为B.1.618的新变异病毒，其特征是除了刺突蛋白中的E484K和D614G突变，还有6个核苷酸(H146del和Y145del)的染色体重排(“德尔塔”变异毒株)。虽然部分确诊病例已经接种了疫苗，但是仍发生B.1.618变异株感染。这种情况属于“突破性感染”，即接种过疫苗的人也会被感染，而且可传染给他人。事实上，完全接种疫苗后依然被感染“德尔塔”变异病毒的情况已经在多个国家出现。尽管接种过疫苗的患者症状普遍较轻，转为重症的可能性也较低，病程相对更短，但不可否认“德尔塔”变异毒株的出现和流行使新冠疫苗建立的免疫屏障被突破，也给新冠肺炎的预防及治疗带来了更为严峻的挑战。随着新冠病毒的不断和加速突变，突破性感染的形势越来越严峻。因此，迫切需要安全有效的治疗药物。
在全球加紧研发疫苗的同时，至今尚无直接针对COVID-19(corona virusdisease-2019) 的有效药物。氯喹在小样本临床试验中已经初步展现了优于洛匹那韦/利托那韦(克力芝)的治疗新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的临床效果(Gautret P et al.IntJ Antimicrob Agents,2020,20:105949；Horby P,et al.,Lancet,2020,396:1345-1352)，已被纳入了国家卫生健康委员会《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第六版)》。广东省科技厅及广东省卫生健康委磷酸氯喹治疗新冠状病毒肺炎多中心协作组又出台了《磷酸氯喹治疗新型冠状病毒肺炎的专家共识》。羟氯喹(hydroxychloroquine，HCQ)是于1946年在氯喹的基础上研究出的4-氨基喹啉类的抗疟药，具有抗疟、免疫调节、抗病毒、抗菌和抗真菌等药理学作用。由于羟氯喹是氯喹的代谢产物，它们具有相似的结构和作用机制，但在治疗疟疾和免疫性疾病的临床实践中安全性比氯喹好(Rainsford,K.D.,et al.,Inflammopharmacology,2015, 23:231-69)。多项体外研究显示硫酸羟氯喹(HCQ)或氯喹(CQ)具有显著抑制新冠病毒复制的作用，而且其免疫抑制作用也可以减少炎症因子风暴的发生。
多项临床试验结果提示，早期大量使用HCQ能够显著降低新冠肺炎患者的病毒载量、促进肺炎吸收、降低病死率、改善预后(Gao,J.et al.,Biosci Trends,2020,14:72-73；Oscanoa,T.J., et al.,Int J Antimicrob Agents,2020,56:106078.)。值得注意的是，硫酸硫酸羟氯喹片的临床口服剂量一般不超过400mg/天(Fiehn,C.,et al.,Z Rheumatol,2021,80(Suppl 1):1-9)。但是，临床数据表明，这种低剂量(或安全剂量)硫酸羟氯喹在体内并不能达到有效抑制新冠病毒的血清浓度，因而需要通过增加HCQ或CQ的口服剂量，达到较高的组织或血药浓度，才能实现抑制病毒复制的目的。体外研究亦显示，硫酸羟氯喹的血清药物浓度越高，对新冠病毒的清除效果越好(Watson,J.A.,et al.,Elife,2020,9:e58631)。据文献报道，临床能够有效治疗新冠肺炎使用HCQ的剂量在800-1200mg/d的范围(Oscanoa,T.J.,et al.,Int J Antimicrob Agents,2020, 56:106078.)。不幸的是，临床使用大剂量硫酸羟氯喹或磷酸氯喹导致患者严重心脏毒性，包括心动周期的Q-T间期延长、QRS波增宽、尖端扭转型室性心动过速等心律失常，严重时导致患者心衰而猝死(Burrell,Z.L.,Jr.et al.,New Engl J Med,1958,258:798-800；Tonnesmann,E. et al.,Immunopharmacol Immunotoxicol,2013,35:434-42)。同时，临床数据显示，超过1/3的新冠肺炎患者存在不同程度的心肌损伤，如果使用HCQ或CQ进行治疗，可能进一步增加患者心血管病变的风险(Naksuk,N.et al.,Eur Heart J Acute Cardiovasc Care,2020,9:215-221.)。
发明内容
本发明旨在解决上述背景技术中所提出的问题，本发明的内容在于提供一种能够减轻或逆转氯喹/羟氯喹心脏毒性的药物联用组合。经过大量实验，尝试将不同抗氧化应激药物，包括维生素E、维生素C、叶酸、辅酶Q10及艾地苯醌，分别与磷酸氯喹/硫酸羟氯喹联合使用，以期降低或消除氯磷酸喹/硫酸羟氯喹的心脏毒性。最终发现，艾地苯醌与磷酸氯喹/硫酸羟氯喹联合用药能够极大降低磷酸氯喹/硫酸羟氯喹引起的心脏毒性作用，从而能够大幅提高磷酸氯喹/硫酸羟氯喹的安全用药剂量。本发明有望在临床为新冠病毒感染患者提供新的治疗途径。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种药物组合物，包括艾地苯醌与氯喹/羟氯喹或其药学上可成的盐。
在本发明的技术方案中，所述联合用药组合物中，有效成分艾地苯醌能够减轻磷酸氯喹/硫酸羟氯喹的心脏毒性作用。本发明发现，艾地苯醌可显著降低磷酸氯喹/羟氯喹引起的心脏毒性，并在一定范围内呈剂量依赖性：心肌细胞中，艾地苯醌与磷酸氯喹/硫酸羟氯喹摩尔比在 (0.05～0.2)：1时，优选(0.1～0.2)：1，可明显逆转磷酸氯喹/硫酸羟氯喹引起的心肌细胞代谢率下降，并使心肌细胞维持正常的代谢率。
所述药物组合物优选为口服制剂或注射制剂。
本发明所述氯喹/羟氯喹药学上可成的盐为氯喹/羟氯喹与有机酸或无机酸形成的盐，例如硫酸盐、盐酸盐、磷酸盐、硝酸盐、草酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、磺酸盐、苯磺酸盐、苯甲基磺酸盐等。
本发明一个具体的示例，选择艾地苯醌与磷酸氯喹/硫酸羟氯喹的药物组合。
本发明另一目的在于提供本发明所述药物组合物在制备治疗新型冠状病毒感染肺炎的药物中的应用。
当用于治疗新型冠状病毒感染肺炎时，本发明所述药物组合物中氯喹/羟氯喹或其药学上可成的盐的剂量为每人每日12-24mg/kg(临床单独使用硫酸羟氯喹安全剂量的2～4倍)。
在本发明的技术方案中，所述的用药组合为临床应用于新型冠状病毒感染肺炎的治疗提供依据。
本发明中，硫酸羟氯喹简称为HCQ，磷酸氯喹简称为CQ，艾地苯醌简称为IDE，维生素C简称为VitC，维生素E简称为VitE，叶酸简称为FA，辅酶Q10简称为CoQ10。
本发明的优势在于：
本发明研究发现硫酸羟氯喹对心肌钾、钠、钙离子通道均没有直接抑制作用，通过增强心肌细胞线粒体氧化应激导致心肌细胞的损伤。本发明进一步将不同抗氧化应激药物，包括维生素E、维生素C、叶酸、辅酶Q10及艾地苯醌，分别与硫酸羟氯喹联合使用，以期降低或消除硫酸羟氯喹的心脏毒性。结果显示，维生素E、维生素C、叶酸、辅酶Q10无显著逆转硫酸羟氯喹所致细胞代谢率下降的效果，不能抑制硫酸羟氯喹所致氧化应激。艾地苯醌联合磷酸氯喹/硫酸羟氯喹可明显降低磷酸氯喹/硫酸羟氯喹引起的心肌细胞氧化应激水平增高，艾地苯醌与磷酸氯喹/硫酸羟氯喹联合用药能够极大降低磷酸氯喹/硫酸羟氯喹引起的心脏毒性作用，从而能够大幅提高磷酸氯喹/硫酸羟氯喹的安全用药剂量。有望在临床为新冠病毒感染患者提供新的治疗选择。
附图说明
图1为本发明实施例1中硫酸羟氯喹对大鼠心脏功能的影响。(A)不同剂量HCQ尾静脉注射前和注射后5min大鼠Q-T间期；(B)低剂量HCQ注射前和注射后5min大鼠Q-T间期比较；(C)中剂量HCQ注射前和注射后5min大鼠Q-T间期比较；(D)高剂量HCQ注射前和注射后5min大鼠Q-T间期比较。ns,无显著性差异；*,p<0.05；***,p<0.001。
图2为本发明实施例2中硫酸羟氯喹对心肌细胞功能的影响。(A-C)HCQ对hERG通道的作用；(D-E)HCQ对Cav1.2离子通道的作用；(F-G)HCQ对Nav1.5离子通道的作用。
图3为本发明实施例3中磷酸氯喹/硫酸羟氯喹对心肌细胞线粒体氧化应激的影响。(A) 不同浓度HCQ或CQ处理心肌细胞6h后Rho123染色；(B)100μM HCQ或CQ处理心肌细胞6h后流式细胞仪检测Mito SOX；(C)100μM HCQ或CQ处理心肌细胞6h后流式细胞仪检测DHE；(D)100μM HCQ或CQ处理心肌细胞6h后流式细胞仪检测JC-1；(E)100μM HCQ 或CQ处理心肌细胞6h后细胞检测ATP含量。**,p<0.01；***,p<0.001。
图4为本发明实施例4中不同抗氧化应激药物与硫酸羟氯喹联合用药对大鼠心肌细胞代谢率的影响。NRCMs给予100μM HCQ的同时分别加不同浓度抗氧化应激药物VitC(A)、VitE(B)、FA(C)、CoQ10(D)、IDE(E)处理6h后，CCK8检测细胞活性。ns,无显著性差异；***,p<0.001。
图5为本发明实施例5中不同抗氧化应激药物与磷酸氯喹/硫酸羟氯喹联合用药对心肌细胞线粒体氧化应激的影响。(A)心肌细胞给予100μM HCQ、100μM HCQ+25μM VitC、100μM HCQ+24mM VitE、100μM HCQ+20μM FA、100μM HCQ+40μM CoQ10、100μM HCQ+20μM IDE处理6h后，流式细胞仪检测Mito SOX；(B)心肌细胞给予100μM HCQ、100μM HCQ+25μM VitC、100μM HCQ+24mM VitE、100μM HCQ+20μM FA、100μM HCQ+40μM CoQ10、100μM HCQ+20μM IDE处理6h后，流式细胞仪检测Rho123；(C)心肌细胞给予 100μM CQ、100μM CQ+20μM IDE处理6h后，流式细胞仪检测Mito SOX；(D)心肌细胞给予100μM CQ、100μM CQ+20μM IDE处理6h后，流式细胞仪检测Rho123。***,p<0.001。
图6为本发明实施例6中艾地苯醌与致死剂量硫酸羟氯喹联合用药对小鼠死亡率的影响。小鼠尾静脉注射致死剂量的HCQ(2mg/只)，或同时尾静脉注射HCQ(2mg/只)+IDE(0.018mg/只)，10只/组，给药后统计小鼠死亡率。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明内。以下通过具体实施例结合附图对本发明中的艾地苯醌和磷酸氯喹/硫酸羟氯喹联合用药及其应用作进一步说明，实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或按照产品说明书进行。
实施例1：硫酸羟氯喹对大鼠心脏功能的影响
给予SD大鼠不同剂量HCQ，分别为：低剂量12.5mg/kg(相当于人体剂量2mg/kg，120mg/ 人)，中剂量25mg/kg(相当于人体剂量4mg/kg，240mg/人)，高剂量37.5mg/kg(相当于人体剂量6mg/kg，360mg/人)。
为排除不同HCQ口服制剂因生物利用度差异带来的影响，选择尾静脉注射，即保证每只动物对药物的吸收率均为100％。
在注射前和注射后5分钟对大鼠进行心电图检测，比较不同剂量的HCQ对大鼠Q-T间期的影响。
结果表明，与对照组(vehicle)相比，三个剂量HCQ给药组均有大鼠出现不同程度的 Q-T间期延长(图1A)。对每组数据进行分析发现，12.5mg/kg组大鼠Q-T间期在给药前后无统计学差异(68.27ms vs.73.09ms，p＝0.3364)(图1B)；25mg/kg组给药后Q-T间期显著延长(61.79ms vs.72.42ms，p＝0.0155)(图1C)；37.5mg/kg组在三个剂量中对Q-T间期影响最大(59.97ms VS.81.85ms，p<0.001)(图1D)。这些结果表明，HCQ给药后导致大鼠Q-T间期延长，与临床新冠肺炎患者用药现象一致。
实施例2：硫酸羟氯喹对心肌细胞功能的影响
1.HCQ对心肌钾离子通道作用检测
(1)使用HEK-293细胞过表达hERG钾离子通道后，采用HEKA EPC-10膜片钳放大器和PATCHMASTER采集系统记录膜电流(HEKA Instruments Inc.，D-67466Lambrecht，Pfalz，Germany)。
(2)先将膜电压钳制在-80mV，给予细胞持续2s、+20mV电压刺激，激活hERG钾通道，再复极化至-50mV、持续5s，产生外向尾电流，刺激频率每15s一次。电流值为尾电流的峰值。Quinidine(奎尼丁)为阳性对照。
结果表明，不同浓度的HCQ(H)对hERG钾离子通道均无显著抑制作用(图2A-C)。
2.HCQ对心肌钙离子通道作用检测
(1)使用Langendorff灌流装置分离豚鼠心室肌细胞，将急性分离的原代豚鼠心肌细胞转移至电生理实验系统中倒置显微镜平台的细胞浴槽中，采用全细胞记录模式记录Cav1.2通道电流。
(2)细胞灌流含不同浓度HCQ的细胞外液并持续记录直到药物对Cav1.2电流的抑制作用到达稳定状态，此时内向电流峰值即为加药后电流值，30μM的Verapamil(维拉帕米)作为阳性。
结果表明，不同浓度的HCQ对Cav1.2通道均无显著抑制作用(图2D-E)。
3.HCQ对心肌钠离子通道作用检测
(1)在HEK293细胞中过表达人类Nav1.5钠离子通道，将附有HEK293 hNav1.5细胞的圆形玻片转移至电生理实验系统中倒置显微镜平台的细胞浴槽中。
(2)灌流含不同浓度HCQ的细胞外液并持续记录直到药物对Nav1.5电流的抑制作用到达稳定状态，此时内向电流峰值即为加药后电流值。稳定状态的标准以最近的连续3个电流记录线是否重合来判断。10μM的Amitriptyline(阿米替林)作为阳性对照。
(3)本实验通过测量对照组与HCQ处理组的电流最大值，计算HCQ处理组最大电流值 (绝对值)所占对照组最大电流值(绝对值)的比率(Mean±SE)，评估HCQ在不同浓度时对hNav1.5钠离子通道电流的作用效果。
结果表明，虽然HCQ对Nav1.5离子通道具有微弱的抑制作用(IC50＝36.42μM)(图2F-G)，但根据FDA指南，当IC50大于20μM时对该离子通道的影响无临床意义。
实施例3：硫酸羟氯喹和磷酸氯喹对心肌细胞线粒体氧化应激的影响
1.原代乳大鼠心肌细胞荧光染色检测
(1)接种：将原代乳大鼠心肌细胞接种于24孔板中，每孔密度为6×104个细胞，将其放置于含有5％的二氧化碳和95％的空气的37℃的细胞培养箱内培养12h；
(2)用25μM、50μM、100μM浓度HCQ或25μM、50μM、100μM浓度CQ处理细胞，给药处理6h后进行Rho123及Hoechst染色，具体方法按照Rhodamine 123(碧云天，C2007) 和Hoechst33342(碧云天，C1022)说明书操作，拍照记录。正常情况下，线粒体内外膜保持一定的电势差，当线粒体受损时，线粒体内外膜的电势差被破坏，因此膜电位下降。膜电位下降时，Rho123会进入线粒体并发出荧光。因此Rho123的荧光强度可作为线粒体膜电位受损程度的间接指征。
实验结果表明，随着HCQ和CQ的浓度增加，线粒体膜电位降低更显著(图3A)，提示线粒体氧化应激损伤。
2.原代乳大鼠心肌细胞Mito SOX及DHE流式细胞术检测
(1)接种：将原代乳大鼠心肌细胞接种于12孔板中，每孔密度为4×105个细胞，将其放置于含有5％的二氧化碳和95％的空气的37℃的细胞培养箱内培养12h；
(2)用100μM浓度HCQ或CQ处理细胞，给药处理6h后分别进行Mito SOX及DHE 染色；
(3)移去细胞培养基，用无EDTA的胰酶将细胞消化下来，于2000rpm离心5min；
(4)每个样品用500μl PBS重悬，于2000rpm离心5min；
(5)分别用500μl Mito SOX和DHE染料工作液将细胞重悬，于37℃避光孵育30min后于2000rpm离心5min；
(6)用500μl PBS重悬细胞，于2000rpm离心5min；
(7)用500μl PBS重悬细胞，经200目细胞筛网过滤后立即于流式细胞仪进样检测。当细胞内氧化应激水平增高时，活性氧簇(ROS)含量增加，MitoSOX与线粒体内的ROS结合后即可发出荧光，因此可以MitoSOX荧光强度的相对值判断细胞线粒体氧化应激水平。DHE 则能够与细胞核内产生的ROS结合并发出荧光，因此可以MitoSOX荧光强度的相对值判断细胞线粒体氧化应激水平；以DHE荧光强度的相对值判断细胞线粒体氧化应激水平。
结果表明，HCQ或CQ处理后的心肌细胞中Mito SOX和DHE荧光强度明显增加(图3B-C)，提示HCQ和CQ均可引起心肌细胞的氧化应激水平显著增高。
3.原代乳大鼠心肌细胞JC-1流式检测
(1)接种：将原代乳大鼠心肌细胞接种于12孔板中，每孔密度为4×105个细胞，将其放置于含有5％的二氧化碳和95％的空气的37℃的细胞培养箱内培养12h；
(2)用100μM浓度HCQ或CQ处理细胞，给药处理6h后按照线粒体膜电位检测试剂盒(碧云天，C2006)操作方法进行JC-1染色，流式细胞仪检测绿色荧光强度(低线粒体膜电位的细胞，原理同Rho123)。
结果表明，低线粒体膜电位的心肌细胞比例较对照组明显增高(图3D)，证实HCQ和CQ可引起心肌细胞线粒体膜电位下降，提示线粒体损伤。
4.原代乳大鼠心肌细胞ATP含量检测
(1)接种：将原代乳大鼠心肌细胞接种于60mm培养皿中，每孔密度为3×106个细胞，将其放置于含有5％的二氧化碳和95％的空气的37℃的细胞培养箱内培养12h；
(2)用100μM浓度HCQ或CQ处理细胞，给药处理6h后按照增强型ATP检测试剂盒 (碧云天，S0027)操作方法进行ATP含量检测。
实验结果表明，HCQ及CQ均导致心肌细胞ATP含量减少(图3E)，提示HCQ和CQ 均引起心肌细胞线粒体功能受损。
实施例4：不同抗氧化应激药物与硫酸羟氯喹联合用药对大鼠心肌细胞代谢率的影响
(1)接种：将原代乳大鼠心肌细胞接种于96孔板中，每孔密度为1×104个细胞，将其放置于含有5％的二氧化碳和95％的空气的37℃的细胞培养箱内培养12h；
(2)待提取的原代乳大鼠细胞跳动后，给予100μM HCQ、100μM HCQ+VitC(不同浓度)、100μM HCQ+VitE(不同浓度)、100μM HCQ+FA(不同浓度)、100μM HCQ+CoQ10 (不同浓度)、100μM HCQ+IDE(不同浓度)，各组细胞均在加药后继续培养6h；
(3)药物处理6h后，向每孔中加入10μL CCK8检测细胞代谢率；
(4)将培养板放入孵育箱孵育4小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
结果表明，HCQ导致心肌细胞代谢率下降近50％，而100μM HCQ分别与12.5μM、25μM及50μM VitC同时作于于心肌细胞6h后，细胞代谢率未见明显变化，各组细胞代谢率接近HCQ单一给药组细胞(图4A)；100μM HCQ分别与6mM、12mM及24mM VitE同时作于于心肌细胞6h后，细胞代谢率未见明显变化，各组细胞代谢率接近HCQ单一给药组细胞(图 4B)；100μMHCQ分别与10μM、20μM及40μM FA同时作于于心肌细胞6h后，细胞代谢率未见明显变化，各组细胞代谢率接近HCQ单一给药组细胞(图4C)；100μM HCQ分别与 20μM、40μM及80μM CoQ10同时作于于心肌细胞6h后，细胞代谢率未见明显变化，各组细胞代谢率接近HCQ单一给药组细胞(图4D)；100μM HCQ分别与5μM、10μM及20μM IDE 同时作于于心肌细胞6h后，细胞代谢率逐渐增加，与IDE呈剂量依赖性，且10μM及20μM IDE可显著逆转HCQ引起的心肌细胞代谢率下降(图4E)。
实施例5：不同抗氧化应激药物与硫酸羟氯喹或磷酸氯喹联合用药对心肌细胞线粒体氧化应激的影响
1.原代乳大鼠心肌细胞Mito SOX流式细胞术检测
(1)接种：将原代乳大鼠心肌细胞接种于12孔板中，每孔密度为4×105个细胞，放置于含有5％的二氧化碳和95％的空气的37℃的细胞培养箱内培养12h；
(2)给予心肌细胞100μM HCQ单一给药或联合不同抗氧化应激药物处理，分别为：100μM HCQ、100μM HCQ+25μM VitC、100μM HCQ+24mM VitE100μM HCQ+20μM FA、 100μM HCQ+40μM CoQ10、100μM HCQ+20μM IDE，以及CQ单一给药或CQ联合IDE(100μM CQ+20μM IDE)，各组给药处理6h后分别进行Mito SOX染色；
(3)移去细胞培养基，用无EDTA的胰酶将细胞消化下来，于2000rpm离心5min；
(4)每个样品用500μl PBS重悬，于2000rpm离心5min；
(5)用500μl Mito SOX染料工作液将细胞重悬，于37℃避光孵育30min后于2000rpm 离心5min；
(6)用500μl PBS重悬细胞，于2000rpm离心5min；
(7)用500μl PBS重悬细胞，经200目细胞筛网过滤后立即于流式细胞仪进样检测。
实验结果表明，HCQ和CQ均引起线粒体氧化应激水平明显增高及线粒体膜电位下降(图 5A,C)，100μM HCQ+25μM VitC、100μM HCQ+24mM VitE100μM HCQ+20μM FA、100μMHCQ+40μM CoQ10处理后的心肌细胞线粒体氧化应激水平较HCQ单一给药组有所降低，但差别并无显著性(图5A)，但HCQ+IDE组心肌细胞内氧化应激降低至接近正常水平(图5A)。由此可见，IDE降低HCQ所致心肌细胞氧化应激损伤的效果较VitC、VitE、FA、CoQ10有明显的优越性。CQ+IDE心肌细胞内氧化应激水平与对照组相近(图5C)，表明IDE可有效降低CQ所致心肌细胞氧化应激损伤。
2.原代乳大鼠心肌细胞Rho123流式细胞术检测：细胞处理过程同1中(1)～(7)。
实验结实验结果表明，HCQ和CQ均引起线粒体膜电位受损(图5B,D)，100μM HCQ+25μM VitC、100μM HCQ+24mM VitE、100μM HCQ+20μM FA、100μM HCQ+40μM CoQ10处理后的心肌细胞线粒体膜电位损伤较HCQ单一给药组有所缓解，但与HCQ单一给药组相比差别并无显著性(图5B)。而HCQ+IDE组心肌细胞线粒体膜电位则接近正常水平 (图5B)。由此可见IDE降低HCQ所致心肌细胞线粒体膜电位损伤的效果明显优于VitC、 VitE、FA及CoQ10。CQ+IDE心肌细胞线粒体膜电位也接近对照组(图5D)，表明IDE能有效降低CQ所致心肌细胞线粒体膜电位损伤。
实施例6：艾地苯醌与致死剂量硫酸羟氯喹联合用药对小鼠死亡率的影响
(1)艾地苯醌临床口服日用剂量为90mg，小鼠(C57BL/6)等效剂量为0.0234mg，按照口服生物利用度70％计算，小鼠静脉给药剂量为0.018mg。
(2)按照以上剂量，给予小鼠尾静脉注射致死剂量的HCQ(2mg/只，相当于人体(60kg 体重)剂量686mg/人)，或同时尾静脉注射HCQ(2mg/只)+IDE(0.018mg/只)，每组10只小鼠，给药后观察死亡率。
实验结果表明，HCQ单独给药时，小鼠死亡率为90％，HCQ+IDE组小鼠死亡率为40％(图6)，较HCQ组死亡率显著下降，提示IDE与HCQ联合用药时，IDE可显著降低HCQ 引起的小鼠死亡率。
综上所述，艾地苯醌能够显著减轻磷酸氯喹或硫酸羟氯喹导致的心脏毒性，且作用较其他抗氧化应激药物包括维生素C、维生素E、叶酸、辅酶Q10有明显的优越性。艾地苯醌主要通过降低磷酸氯喹或硫酸羟氯喹引起的心肌细胞氧化应激水平增高，维持线粒体膜电位，从而使心肌细胞代谢及功能保持在正常水平。
尽管上述部分已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进，这些改进也落入本发明权利的保护范围。