阅读说明：本技术 益母草碱及其晶体在制备抗高同型半胱氨酸血症药物中的用途 (Application of leonurine and crystal thereof in preparation of medicines for resisting hyperhomocysteinemia ) 是由 朱依纯 朱依谆 宁可 慕雪盼 陈莹 于 2019-02-21 设计创作，主要内容包括：本发明属中药现代化制药领域,涉及中草药益母草提取物及其在制药中的应用,具体涉及一种中草药益母草提取物益母草碱的药用晶型在制备药物中的应用,所述益母草碱化学名称：3,5-二甲氧基-4-羟基-苯甲酸(4-胍基)-1-丁酯；本发明中将益母草碱制成1种水合物晶型,实验证实其具有降低同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)的作用；本发明所述的益母草碱及其晶型可用于制备抗高Hcy导致的各种疾病的药物,包括心脑血管疾病、老年痴呆症、脑卒中、静脉栓塞、新生儿缺陷和习惯性流产,特别适用于早期干预上述疾病的发生,具有减低早期心血管危险因素和其他相关疾病发生率的作用,以及在特定的其他危险因子如甘油三脂、胆固醇和低密度脂蛋白等不增高但易发生心脑血管疾病的疾病状态。(The invention belongs to the field of modern pharmacy of traditional Chinese medicines, relates to a Chinese herbal medicine motherwort extract and application thereof in pharmacy, and particularly relates to application of a medicinal crystal form of leonurine of the Chinese herbal medicine motherwort extract in preparation of a medicine, wherein the leonurine has the chemical name: 3, 5-dimethoxy-4-hydroxy-benzoic acid (4-guanidino) -1-butyl ester; in the invention, leonurine is prepared into 1 hydrate crystal form, and experiments prove that leonurine has the function of reducing Homocysteine (Hcy); the leonurine and the crystal form thereof can be used for preparing medicines for resisting various diseases caused by high Hcy, including cardiovascular and cerebrovascular diseases, senile dementia, cerebral apoplexy, venous embolism, neonatal defect and habitual abortion, are particularly suitable for early intervention of the diseases, have the function of reducing the incidence of early cardiovascular risk factors and other related diseases, and have the disease states that specific other risk factors such as triglyceride, cholesterol, low-density lipoprotein and the like are not increased but the cardiovascular and cerebrovascular diseases are easy to occur.)

益母草碱及其晶体在制备抗高同型半胱氨酸血症药物中的 用途

技术领域

本发明属中药现代化制药领域，涉及一种中草药益母草提取物益母草碱的晶体在制药中的新用途，尤其是在制备抗高同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)血症药物中的用途。本发明所述的抗高Hcy血症药物适用于防治Hcy导致的疾病，包括心脑血管疾病、老年痴呆症、脑卒中、静脉栓塞、新生儿缺陷和习惯性流产。

背景技术

现有技术公开了高同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)是一种含硫氨基酸，为蛋氨酸代谢过程中产生的重要中间产物，是蛋氨酸去甲基而生成的。正常情况下，血Hcy在体内的浓度维持在较低水平，但遗传因素和继发性原因会影响血Hcy代谢导致血Hcy浓度异常升高，形成高Hcy血症，从而大幅增加冠心病、外周血管疾病及脑血管疾病的发病风险。因此，业内认为过高的血Hcy是一个重要的疾病危险因子；此外，蛋氨酸负荷会诱发高Hcy血症；有研究发现空腹高Hcy血症和蛋氨酸负荷高Hcy血症均是诱发心血管病的危险因子。

显而易见的是心血管疾病等重大疾病的早期干预是临床实践中更明智的治疗策略。鉴于高Hcy血症等致病危险因子需要较长时间的持续作用才导致相关疾病的发生，因此，在诊断高Hcy血症后仍有足够的时间窗可开展干预治疗；但是，目前尚未有专门针对高Hcy血症该一适应症的特效药物问世；现有的干预治疗方法仅限于补充叶酸、维生素B₆、B₁₂等食物成分，对于膳食中并不缺乏上述维生素的高Hcy血症患者疗效不佳；因此，研发新的针对疾病状态的抗高Hcy血症药物具有重要临床价值。

中草药益母草(唇形科植物,Herba Leonuri,Chinese Motherwort)最早收载于《神农本草经》、《本草纲目》等古籍中，有活血调经、利尿消肿的功效；中华人民共和国药典(2000年版)中用于月经不调、痛经、经闭、恶露不尽、水肿尿少、急性肾炎水肿等治疗。本研究团队的前期研究发现益母草具有除上述已知功能以外的一系列用途，包括心血管保护作用等，并进一步分离、合成了其单体有效成分益母草碱，确定了益母草碱作为候选药物的若干用途。

有研究表明高Hcy血症已成为多种其他疾病的危险因子，包括糖尿病、老年痴呆症、妊姃高血压、新生儿缺陷和习惯性流产；目前尚无专门治疗高同型半胱氨酸血症的药物。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供益母草碱及其晶体在制备抗高Hcy血症药物中新的用途，所述的抗高Hcy血症药物尤其适用在严重病变发生前早期干预血液中过高的Hcy水平这一疾病危险因子，使Hcy降低至正常水平，从而早期干预Hcy过高所导致的疾病。

发明内容

本发明的目的是基于现有技术的现状与基础，提供中药益母草的活性成分益母草碱及其药用晶型在制备治疗高Hcy血症中的新的药用用途，尤其是制备在Hcy导致血管及重要脏器损伤前早期干预的药物，防止高Hcy血症导致的各种疾病的发生或减轻其程度。鉴于高Hcy血症是目前医学界公认的独立的重大疾病危险因子，是一种需要及时治疗的重要早期疾病；如未及时治疗，则继而造成人体各重要脏器的损害、导致一系列的严重继发性疾病。

研究表明，高Hcy血症是一种独立而重要的心血管危险因子，可直接对人体细胞产生损害，尤其是损伤血管内皮细胞，导致各种心脑血管疾病和外周血管疾病；冠状动脉粥样硬化可导致心肌缺血、心绞痛和心肌梗死；而脑血管疾病则会导致脑卒中等严重疾病；本发明提供的抗高Hcy血症药物适用于防治Hcy导致的疾病，包括心脑血管疾病、外周血管疾病、脑卒中、糖尿病、老年痴呆症等神经退行性疾病、新生儿缺陷、习惯性流产、妊娠高血压等；特别适用于早期干预上述疾病的发生，具有减低早期心血管危险因素和其他相关疾病发生率的作用。

本发明的进一步目的是将上述活性成分作为药物制剂的原料，制成抗高Hcy血症的药物。

本发明所述的益母草碱是从益母草中分离得到的有效成分，并经过人工合成加以大量制备，其化学结构式为：

所述益母草碱英文名称为：Leonurine；化学名称：3，5-二甲氧基-4-羟基-苯甲酸(4-胍基)-1-丁酯。

本申请进一步解析益母草碱的晶体结构，获得最佳药用晶型，并研究发现所述的益母草碱及其晶型具有抗高Hcy血症的作用。

本发明通过特定的方法，将益母草碱制备成6种不同晶型的晶体，具体为益母草碱硫酸盐的6种不同结构的晶体，其中2种为水合物，2种为无水晶型，一种为甲醇合物，一种为乙醇合物。

为了便于描述，本发明所述的6种上述益母草碱晶体分别命名为晶型A、晶型B、晶型C、晶型D、晶型E和晶型F。

本发明所述的具有上述抗高Hcy血症的益母草碱晶体优选晶型A，其具有如下特征：

所述的晶型A益母草碱半硫酸盐一水合物晶体，其分子结构如图1所示；

晶型A所代表的益母草碱半硫酸盐一水合物晶体，为无色片状晶体，属三斜晶系，其空间群为P-1，不对称单元中包含2个益母草碱分子，1个硫酸根离子以及2个水分子；其中两个益母草碱分子的胍基与硫酸根的负离子形成离子键三聚体，该三聚体与三聚体之间通过胍基和硫酸根的氢键作用形成二维结构，形成如下多聚体分子平面层(如图2所示)；

本申请中，晶型A所代表的益母草碱半硫酸盐一水合物晶体的多层多聚体分子平面以平行的方式叠加排列，其二维结构分子平面通过水分子的氢键作用形成益母草碱半硫酸盐一水合物晶体的如下三维层叠网状结构，其胍基和硫酸根形成的亲水层与益母草碱疏水基团交替排列(如图3所示)。

本申请中，晶型A所代表的益母草碱半硫酸盐一水合物晶体其单晶分子中所有原子的空间位置符合如下表1所示功能原子坐标和等方性或相当等方性位移参数。

表1、益母草碱半硫酸盐一水合物晶体其单晶分子中所有原子的坐标和等方性或相当等方性位移参数

为了进一步鉴定上述6种益母草碱晶型的特征，本发明分别进行X-射线粉末衍射(XRPD)分析，获得到如下表2所示的XRPD数据：

表2、六种益母草碱晶体的XRPD数据：

更具体的，本发明所述的6种益母草碱晶型特指具有上述XRPD特征的晶体。

进一步，本发明所述的益母草碱及其晶体可用于制备治疗高Hcy血症的药物。

本发明提供了一种新的抗高Hcy血症药物，用于防治Hcy导致的各种疾病，包括心脑血管疾病、外周血管疾病、脑卒中、糖尿病、老年痴呆症等神经退行性疾病、新生儿缺陷、习惯性流产、妊娠高血压等。特别适用于早期干预上述疾病的发生，具有减低早期心血管危险因素和其他相关疾病发生率的作用。

本发明所述的益母草碱及其晶体还适用于精准医学实践中应用于氨基酸代谢紊乱中的特定类型患者，即高Hcy血症患者；针对此，本发明提供了一种在临床病变发生前加以早期阻断的预防性药物；该药物可对因治疗由高Hcy所继发的疾病，防止高Hcy所导致的下列人体重要脏器的损害，包括但不限于：心脏、冠状动脉、脑动脉、颈动脉、股动脉、肾脏、脑、肝脏等重要人体血管的损伤和病变，尤其是各重要脏器内血管内皮的损伤。

本发明的益母草碱晶体可作为药物原料，直接或与药学上通常用于制剂的固体或液体辅料混合制成适宜制剂，包括胶囊、片剂、散剂、混悬剂以及复方制剂。

本发明进行了大量的药理学研究，结果显示，所述的益母草碱及其A型晶体具有减低高脂饮食动物Hcy水平的作用。

本发明实验以ApoE基因敲除(ApoE^-/-)小鼠为高脂动物模型，且给予高脂饲料喂养；在其遗传缺陷的基础上，再使其处于高脂饮食所造成的代谢紊乱状态，导致脂代谢和氨基酸代谢的障碍，用于验证益母草碱及其A型晶体对血液Hcy水平的调节作用；

实验结果显示，所述的益母草碱及其A型晶体降低了高脂喂养ApoE^-/-小鼠血液中的Hcy水平。

本申请提供了益母草碱晶体在制备抗高Hcy血症药物中的用途，所述的抗高Hcy血症药物尤其适用特别适用于早期干预上述疾病的发生，具有减低早期心血管危险因素和其他相关疾病发生率的作用。鉴于目前尚无特异性的治疗高Hcy血症药物，本发明提供了治疗高Hcy血症的新方法和新药物。

附图说明

图1是益母草碱晶型A的分子结构。

图2是益母草碱晶型A分子的二维结构。

图3是益母草碱晶型A分子的三维结构。

图4是益母草碱A型晶体降低脂代谢紊乱模型小鼠Hcy水平的实验数据统计图，益母草碱A型晶体可以有效降低模型小鼠的Hcy水平；其中，

从左至右共分为5组，分别是：对照组(ApoE^-/-小鼠正常饲料喂养，每日对照溶剂灌胃)；ApoE^-/-小鼠高脂饲料喂养，每日对照溶剂灌胃；ApoE^-/-小鼠高脂饲料喂养，每日益母草碱A型晶体溶液灌胃(10毫克/公斤/天)；ApoE^-/-小鼠高脂饲料喂养，每日益母草碱A型晶体溶液灌胃(20毫克/公斤/天)；ApoE^-/-小鼠高脂饲料喂养，每日益母草碱A型晶体溶液灌胃(40毫克/公斤/天)。上述5组的样本数分别为：14，16，8,8,8。数据为平均值±标准误；P<0.05代表统计学显著差异。

具体实施方式

实施例1在ApoE^-/-小鼠合并高脂饲料喂养的代谢紊乱动物模型中验证益母草碱及其A型晶体对血Hcy水平的影响

实验方法包括：ApoE^-/-小鼠于SPF级动物房以正常饲料喂养至6周龄，然后按以下分组方案随机分为5组予以喂养及给药：

1)对照组(ApoE^-/-小鼠，正常饲料喂养，n＝14)，每天一次三蒸水灌胃(1毫升/公斤体重)；

2)模型溶剂对照组(ApoE^-/-小鼠，高脂饲料，n＝16)，每天一次三蒸水灌胃(1毫升/公斤体重)；

3)益母草碱A型晶体低剂量组(ApoE^-/-小鼠，高脂饲料，n＝8)，每天一次益母草碱A型晶体溶液灌胃(药物剂量为10毫克/公斤/天，药物浓度为10毫克/毫升)；

4)益母草碱A型晶体中剂量组(ApoE^-/-小鼠，高脂饲料，n＝8)，每天一次益母草碱A型晶体溶液灌胃(药物剂量为20毫克/公斤/天，药物浓度为20毫克/毫升)；

5)益母草碱A型晶体高剂量组(ApoE^-/-小鼠，高脂饲料，n＝8)，每天一次益母草碱A型晶体溶液灌胃(药物剂量为40毫克/公斤/天，药物浓度为40毫克/毫升)；

上述第2-5组至第6周龄未开始转换为高脂饲料喂养，并按上述分组方案同时开始每天给予母草碱A型晶体溶液灌胃或溶剂灌胃；第1组继续普通饲料喂养并每天给予溶剂灌胃；持续5周后各组同时采血测定Hcy水平；

5周给药期结束后，小鼠按体重用戊巴比妥钠麻醉，按以下步骤眼球取血：

将小鼠于前一天晚上禁食不禁水(为避免垫料中混合食物碎渣，故禁食的时候换新的笼具)12-14h。取洁净的1.5mL EDTA抗凝EP管，编号。左手抓取小鼠，将一侧眼球突出，右手持已备好的约3-5cm长、直径0.3mm的毛细玻璃管(注意使用平口，不要用锐口端以防毛细管折断在小鼠眼中造成持续损伤)，沿45°角插入小鼠内眼睑(感觉有落空感)，后捻转毛细管，血液延管壁流入EP管内，约200-300μL,小心快速平稳拔出毛细管，并用棉球按压止血。将完成采血的EP管置于冰上，待所有小鼠全部采血完成，于4℃，3000rpm，离心15分钟。仔细小心吸取上层淡黄色液体(血浆)至新的EP管中(不吸取沉淀)，用于后续实验。

实施例2采用酶联免疫吸附法检测小鼠血浆Hcy水平

实验原理：试剂盒采用竞争法检测样本中Hcy的含量；向预先包被了抗体的酶标孔中加入样本，再加入生物素标记的识别抗原，在37℃下孵育30min，两者与固相抗体竞争结合形成免疫复合物，经PBST洗涤除去未结合的生物素抗原，然后加入亲和素-HRP，在37℃下孵育30min，亲和素-HRP与生物素抗原结合，洗涤后结合的HRP催化TMB(四甲基联苯胺)成蓝色，随后在酸的作用下转化成黄色，在450nm波长下有吸收峰，吸光值与样本中抗原的浓度成负相关；

操作步骤：使用前请先将试剂盒在室温下平衡半小时；

空白孔：不加样，只加显色剂A，B和终止液用于调零；

标准品孔：每孔加入稀释好的标准品50μl，零孔：加入标准品/样品稀释液50μl，然后加入生物素抗原工作液50μl；

样品孔：加入样品50μl，然后加入生物素抗原工作液50μl；

轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30min；

将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水25倍稀释后备用；

第一次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；

加入50μl亲和素-HRP到标准品孔和样品孔中，轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30min；

第二次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍；

显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟；

终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)；

测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后10分钟以内进行；

计算：根据浓度和OD值算出标准曲线的回归方程，建议用专用计算软件进行计算，推荐使用ELISAcalc进行计算，拟合模型选用logistic曲线(四参数)；

统计方法：采用统计学软件SPSS19.0进行数据分析。以mean±SEM表示计量资料；组间均数比较运用单因素方差分析one way-ANOVA,以P＜0.05表示有统计学差异；

实验结果：如图4所示，在高脂饲料喂养的APOE基因敲除小鼠中，益母草碱A型晶体在20毫克/公斤/天的剂量条件下，可显著减低小鼠血Hcy水平，与给予对照溶剂的模型组相比(第4组与第2组相比)，P＝0.001,其差异具有统计学显著性；益母草碱A型晶体在40毫克/公斤/天的剂量条件下，可显著减低小鼠血Hcy水平，与给予对照溶剂的模型组相比(第5组与第2组相比)，P＝0.002,其差异也具有统计学显著性；益母草碱A型晶体在10毫克/公斤/天的剂量条件下，尽管未能显著性地减低小鼠血Hcy水平，但在其剂量增加至20和40毫克/公斤/天时，即显示出显著减低小鼠血Hcy水平的作用；因此，其减低血Hcy水平的作用具有剂量依赖性；

实验结果显示，益母草碱及其A型晶体降低了高脂喂养ApoE^-/-小鼠中的Hcy水平，所述的益母草碱及其晶体可用于制备治疗高Hcy血症的药物，进一步制备防止高Hcy血症所导致的疾病发生的预防性药物，可早期阻断Hcy所造成的机体的损害和病变。