阅读说明：本技术 化合物Aspergillusidone G在制备神经保护药物中的应用 (Application of compound Aspergillus G in preparation of neuroprotective drugs ) 是由 张翼 杨文聪 聂影影 杨志友 刘亚月 宋采 洪鹏志 于 2019-08-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了化合物Aspergillusidone G在制备神经保护药物中的应用。本发明证实了缩酚酸环醚类化合物Aspergillusidone G可以显著提高大脑皮层神经细胞的存活率,对MPP<Sup>+</Sup>诱导的大脑皮层神经细胞损伤具有极显著的逆转作用；另外,化合物Aspergillusidone G对患者无毒副作用。因此,化合物Aspergillusidone G在制备神经保护药物、制备减轻/逆转MPP+诱导的神经细胞损伤的药物和制备预防/治疗神经退行性疾病的药物中具有重要意义和广泛的推广应用价值。(The invention discloses application of a compound Aspergillus nidone G in preparation of a neuroprotective drug. The invention proves that the depside cycloether compound Aspergillus G can obviously improve the survival rate of cerebral cortex nerve cells and is used for MPP + The induced damage to the nerve cells of the cerebral cortex has extremely obvious reversal effect; in addition, compound aspergillus nidone G has no toxic side effects to patients. Therefore, the compound Aspergillus G has important significance and wide popularization and application values in preparing neuroprotective drugs, drugs for relieving/reversing MPP + induced nerve cell injury and drugs for preventing/treating neurodegenerative diseases.)

化合物Aspergillusidone G在制备神经保护药物中的应用

技术领域

本发明属于生化医药技术领域。更具体地，涉及化合物Aspergillusidone G在制备神经保护药物中的应用。

背景技术

帕金森综合症(Parkinson’s disease,PD)属于神经退行性疾病，是指由于大脑和脊髓的神经元丧失而造成记忆、行动能力与意识障碍的一类慢性、进行性的神经系统疾病。随着人口老龄化、环境恶化，神经退行性疾病对人类的威胁越来越严重；其中，影响最大的是阿尔茨海默氏症(Alzheimer’s disease,AD)和PD。

PD严重威胁老年人身心健康，目前的研究结果表明，其主要病理特征是黑质致密部多巴胺能神经元的变性和胞浆内路易体的产生。PD患者的蓝斑、基底核、下丘脑、大脑皮层、颅神经运动核以及自主神经系统的中枢和外周部分也可发现神经退行性变和路易体。1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenyl pyridinium,MPP⁺)具有神经毒性作用，可诱导PD的产生。

目前，治疗PD的传统药物，主要是基于增加脑内多巴胺递质，包括复方左旋多巴、多巴胺受体激动剂、单胺氧化酶B抑制剂、儿茶酚氧位甲基转移酶抑制剂。左旋多巴几乎对所有PD患者都有益，但是经过5～10年的治疗，大多数患者出现运动障碍(不自主运动)和运动反应波动等不良事件。可以看出，传统药物治疗PD的作用有限，只能改善PD症状并不能阻止病情的进展，而且还会引起诸多不良反应。因此，筛选毒性低、活性好、产量高的天然来源的神经保护剂，对于神经退行性疾病的预防和治疗具有重要的现实意义。

缩酚酸环醚类化合物是真菌产生的一类天然小分子化合物，现有专利CN108640841A公开了缩酚酸环醚类化合物在制备抗真菌剂、抗细菌剂中的应用。而目前未有任何有关缩酚酸环醚类化合物在神经保护方面的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有现有治疗神经退行性疾病的药物毒副作用大、价格昂贵的缺陷和不足，提供化合物Aspergillusidone G在制备神经保护药物中的应用。

本发明的第一个目的是提供化合物Aspergillusidone G在制备神经保护药物中的应用。

本发明第二个目的是提供化合物Aspergillusidone G在制备减轻/逆转MPP⁺诱导的神经细胞损伤的药物中的应用。

本发明第三个目的是提供化合物Aspergillusidone G在制备预防/治疗神经退行性疾病的药物中的应用。

本发明第四个目的是提供一种减轻/逆转MPP⁺诱导的神经细胞损伤的药物。

本发明第五个目的是提供一种神经保护药物。

本发明第六个目的是提供一种预防/治疗神经退行性疾病的药物。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

化合物Aspergillusidone G在制备神经保护药物中的应用。

化合物Aspergillusidone G在制备减轻/逆转MPP⁺诱导的神经细胞损伤的药物中的应用。

化合物Aspergillusidone G在制备预防/治疗神经退行性疾病的药物中的应用。

优选地，所述神经退行性疾病为帕金森综合症。

所述化合物Aspergillusidone G为6-(1-甲基-反-丙烯基)-4-(2,4-二羟基-6-甲基苯甲酰氧基)-2-羟基-3甲基苯甲酸，其结构式如式(I)所示：

另外，本发明还提供了一种减轻/逆转MPP+诱导的神经细胞损伤的药物，包含有效量的化合物Aspergillusidone G。

本发明还提供了一种神经保护药物，包含有效量的化合物Aspergillusidone G。

本发明还提供了一种预防/治疗神经退行性疾病的药物，包含有效量的化合物Aspergillusidone G。

本发明的化合物Aspergillusidone G是由海洋真菌爪曲霉诱变株Aspergillusunguis 6-20-6经过发酵、粗提和分离纯化制备而得到。

优选地，所述化合物Aspergillusidone G的制备方法，包括以下步骤：

S1.发酵：将海洋真菌爪曲霉诱变株Aspergillus unguis 6-20-6接种于真菌液体培养基中静置发酵后，分别收集菌丝体和发酵液；

S2.粗提：将步骤S1得到的发酵液经乙酸乙酯萃取后浓缩，菌丝体经有机溶剂超声提取后浓缩，将所得浓缩物合并，得到粗提物；

S3.分离纯化：将步骤S2得到的粗提物进行凝胶柱层析，经硅胶薄层层析检测，将含有目标物质的洗脱组分进行反相制备液相色谱和薄层制备分离纯化，即可得到所述化合物Aspergillusidone G。

其中，所述海洋真菌爪曲霉诱变株Aspergillus unguis 6-20-6已于2018年03月20日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC 60337；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。

优选地，步骤S1所述真菌液体培养基的配方为：新鲜土豆汁400～600mL，海盐15～25g，蔗糖15～25g，蛋白胨3～8g，蒸馏水400～600mL，pH 6～8。

更优选地，步骤S1所述真菌液体培养基的配方为：新鲜土豆汁500mL，海盐20g，蔗糖20g，蛋白胨5.5g，蒸馏水500mL，pH 7。

优选地，步骤S1所述发酵的时间为18～25d。

更优选地，步骤S1所述发酵的时间为21d。

优选地，步骤S2所述萃取的次数为2～4次。

更优选地，步骤S2所述萃取的次数为3次。

优选地，步骤S2所述有机溶剂为氯仿、丙酮、乙酸乙酯、乙醇或甲醇中的任意一种或几种。

更优选地，步骤S2所述有机溶剂为丙酮和甲醇的混合溶剂。

优选地，步骤S2所述超声的次数为2～4次。

更优选地，步骤S2所述超声的次数为3次。

优选地，步骤S3所述凝胶柱层析的条件为：凝胶柱层析的流动相为甲醇，流速0.5～1mL/min，10～15min收集一管。

优选地，步骤S3所述反相制备液相色谱纯化的条件为：流动相为体积比1：3～3：2的甲醇-水，在柱套填充10～15g反相硅胶，流速为4～8mL/min，收集保留时间为15～25min的主峰，即可得到所述缩酚酸环醚类化合物Aspergillusidone G。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了化合物Aspergillusidone G在制备神经保护药物中的应用。本发明证实了缩酚酸环醚类化合物Aspergillusidone G可以显著提高大脑皮层神经细胞的存活率，对MPP⁺诱导的大脑皮层神经细胞损伤具有极显著的逆转作用；另外，所述化合物Aspergillusidone G对患者无毒副作用。因此，化合物Aspergillusidone G在制备神经保护药物、制备减轻/逆转MPP+诱导的神经细胞损伤的药物和制备预防/治疗神经退行性疾病的药物中具有重要意义和广泛的推广应用价值。

附图说明

图1是缩酚酸环醚类化合物Aspergillusidone G的核磁共振氢谱图。

图2是缩酚酸环醚类化合物Aspergillusidone G的核磁共振碳谱图。

图3是缩酚酸环醚类化合物Aspergillusidone G的神经保护活性的测定结果图；其中，“1”代表加入浓度为1μM的缩酚酸环醚类化合物Aspergillusidone G；“10”代表加入浓度为10μM的缩酚酸环醚类化合物Aspergillusidone G。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1缩酚酸环醚类化合物Aspergillusidone G的制备

缩酚酸环醚类化合物Aspergillusidone G的制备方法，包括以下步骤：

S1.发酵：将海洋真菌爪曲霉诱变株Aspergillus unguis 6-20-6接种于真菌液体培养基中静置发酵21d，过滤，分别收集菌丝体和发酵液；

其中，步骤S1所述真菌液体培养基的配方为：新鲜土豆汁500mL，海盐20g，蔗糖20g，蛋白胨5.5g，蒸馏水500mL，pH 7。

S2.粗提：将步骤S1得到的发酵液经乙酸乙酯超声萃取3次并浓缩，将步骤S1得到的菌丝体用丙酮-甲醇混合溶剂超声提取3次并减压浓缩，将上述所得浓缩物合并，即为粗提物；

S3.分离纯化：

将步骤S2得到的粗提物经凝胶柱层析，用甲醇进行等度洗脱，流速0.5～1mL/min，10～15min收集一管；将收集的洗脱组分进行反相制备液相色谱纯化的条件为：流动相为体积比1：3～3：2的甲醇-水，在硅胶柱填充10～15g反相硅胶，流速为4～8mL/min；

收集保留时间为15～25min的主峰，得到收集物；收集得到的目标物质还符合下述特征：硫酸-茴香醛显色为橙色，该化合物易溶于甲醇，在氯仿：甲醇＝5：1的60F₂₅₄TLC上的R_f值为0.36；

S4.鉴定：将上述得到的收集物进行波谱分析，结构鉴定，结果显示：收集物为纯化合物，该收集物为6-(1-甲基-反-丙烯基)-4-(2,4-二羟基-6-甲基苯甲酰氧基)-2-羟基-3甲基苯甲酸，命名为Aspergillusidone G，其结构式为：

另外，缩酚酸环醚类化合物Aspergillusidone G具有以下理化性质和波谱特性：

Aspergillusidone G为黄色非晶型固体；缩酚酸环醚类化合物AspergillusidoneG的核磁共振氢谱图如图1所示，(¹H NMR，MeOD,500MHz)δ6.28(dd,2.0,0.5),6.26(s),6.19(d,2.4),5.34(dq,6.8,1.3),2.59(s),2.02(s)，1.92(s),1.70(dd,6.8,0.8)。缩酚酸环醚类化合物Aspergillusidone G的核磁共振碳谱图如图2所示，(¹³C NMR，MeOD,125MHz)δ175.2,171.3,166.9,165.9,161.8,151.3,148.7,144.7,141.1,120.6,116.9,116.7,114.3,113.5,104.5,102.2,24.6,18.8,14.0,9.6。

实施例2缩酚酸环醚类化合物Aspergillusidone G的神经保护活性的测定

1、实验方法

将胚胎14天(E14)的孕鼠(ICR)麻醉后，取出胚胎，分离大脑皮层，除去外层硬膜，剪碎组织，经胰酶消化等过程分离得到大脑皮层神经细胞，混悬于含12％马血清、0.6％D-葡萄糖和2mM L-谷氨酰胺的神经基础培养基中(Gibco BRL)，将神经细胞接种于5μg/mLpoly-D-lysine(Sigma)预处理过的96孔板中，37℃、5％CO₂的条件下培养，细胞密度为20000细胞每孔，3～12小时后将培养液替换为含2％的B-27神经基础培养基(Gibco BRL)。

然后，将神经细胞在B-27培养基中培养4天后，加入不同浓度(1μM、10μM)的实施例1制备得到的缩酚酸环醚类化合物Aspergillusidone G(1组、10组)或空白试剂(0.1％DMSO，Veh组)，12小时后，加入1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP⁺,50μM)或空白溶液(ddH₂O，Cont组)，继续培养36小时，取CCK8试剂加入96孔板中，5μL每孔，培养箱中反应2小时后，用酶标仪于450nm波长下测定吸光度值。

神经细胞存活率的计算公式为：神经细胞存活率(％)＝A₄₅₀(MPP⁺组)/A₄₅₀(Cont组)×100％。

以不同化合物浓度为横坐标，以细胞存活率为纵坐标，用Graphpad Prism 5.0作图，采用One-way ANOVA和Dunnett’s post hoc检验评价MPP⁺组与对照组存活率的差异。

2、实验结果

缩酚酸环醚类化合物Aspergillusidone G的神经保护活性的测定结果如图3所示，可以看出，MPP⁺能够显著降低大脑皮层神经细胞的存活率至81％，而当本发明的缩酚酸环醚类化合物Aspergillusidone G的浓度为1μM时，能够极显著的提高大脑皮层神经细胞的存活率，对MPP⁺诱导的大脑皮层细胞损伤具有极显著的逆转作用；当缩酚酸环醚类化合物Aspergillusidone G的浓度为10μM时，对MPP⁺诱导的大脑皮层细胞损伤具有显著的逆转作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。