阅读说明：本技术 萘醌二聚体在制备抗肿瘤转移药物中的应用 (Application of naphthoquinone dimer in preparation of anti-tumor metastasis drugs ) 是由 汪哲 谭宁华 李玲 王佳 于 2020-07-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了茜草属Rubia植物来源的萘醌二聚体及以其为活性成分的药物组合物在制备抗肿瘤转移药物中的应用。由于本发明所述的萘醌二聚体为天然化合物,其剂型和用药方式多样化,具有广泛的临床应用前景。(The invention discloses a naphthaquinone dimer derived from Rubia plants and application of a pharmaceutical composition taking the naphthaquinone dimer as an active ingredient in preparation of anti-tumor metastasis medicaments. The naphthoquinone dimer is a natural compound, so that the preparation form and the administration mode of the naphthoquinone dimer are diversified, and the naphthoquinone dimer has a wide clinical application prospect.)

萘醌二聚体在制备抗肿瘤转移药物中的应用

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体涉及萘醌二聚体在制备抗肿瘤转移药物中的应用。

背景技术

肿瘤是机体细胞在不同致癌因素的长期作用下，发生过度增生及分化异常而形成的新生物，一般可分为良性和恶性两大类。无论是良性或者恶性肿瘤的生长都是不受机体正常生理控制的，并且在刺激停止后仍继续自主性生长。恶性肿瘤侵袭能力强，易复发和转移到远端器官，绝大多数肿瘤患者最终死亡都是由恶性肿瘤转移引起的。因此，抗肿瘤转移药物的研究已成为本世纪新药研发的重要方向。

肿瘤转移是涉及多器官、多步骤、多阶段的复杂过程。“肿瘤转移”最初于1829年提出，是恶性肿瘤的标志。原发性肿瘤细胞获得转移潜力成为浸润性癌细胞，单个或成簇侵入周围正常组织或肿瘤新建脉管系统中，这些循环肿瘤细胞随着血液循环进入远端器官的毛细血管中，外渗穿过血管壁进入基质，最终产生转移性集落形成明显定殖。肿瘤转移主要有四种方式，1)直接从原发部位弥散，侵入和破坏周围组织，形成新的肿瘤病灶；2)侵入***，在各级***之中转移扩散，形成转移瘤；3)进入人体血管，随血液流动，被运送到身体各个部位，在其它器官中形成继发性肿瘤；4)侵入体腔或空腔脏器内形成种植性转移癌。大多数癌症患者死于转移性癌症而并非原发性癌症。据统计，恶性肿瘤患者初次诊断时转移率达60％，临床90％肿瘤患者的死亡是由于肿瘤转移引起的。目前，虽有一些抗肿瘤转移药物在临床上应用，如阿瓦斯汀、恩度等，但毒副作用大、易产生耐药等问题而导致治疗效率较低。因此，开发毒副作用更小、疗效更优的抗肿瘤转移药物具有极为重要的现实意义。

萘醌二聚体Rubioncolin C是从柄花茜草(Rubia podantha)和钩毛茜草(Rubiaoncotricha)等茜草属植物的根及根茎中分离获得。研究发现，Rubioncolin C对多种肿瘤细胞生长具有抑制作用，IC₅₀值在1.14-9.93μM之间，并能诱导结肠癌细胞HCT116和肝癌细胞HepG2发生凋亡和自噬性死亡，同时通过抑制Akt/mTOR/P70S6K和NF-κB信号通路发挥体内外抗肿瘤作用。

现有技术中未见有萘醌二聚体Rubioncolin C抗肿瘤转移活性的报道。

发明内容

发明目的：针对上述现有技术，本发明提供了萘醌二聚体在制备抗肿瘤转移药物中的新应用。

技术方案：本发明所述的萘醌二聚体Rubioncolin C，其结构式如下所示：

本发明公开了萘醌二聚体Rubioncolin C或其药理学上容许的盐在制备抗肿瘤转移药物中的应用。

本发明还公开了一种抗肿瘤转移的药物组合物，其中含有治疗有效量的如上述结构式所示的萘醌二聚体Rubioncolin C或其药理学上容许的盐和药学上可接受的载体。

进一步的，所述药物组合物中，优选含有重量比为0.1％～99.5％的上述萘醌二聚体或其药理学上容许的盐，最优选含有重量比为0.5％～95％的活性成分述萘醌二聚体或其药理学上容许的盐。

本申请所述的药理学上容许的盐，包括与无机酸盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸，或者有机酸马来酸、富马酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对苯甲磺酸、己二酸、棕榈酸、单宁酸，或者碱金属锂、钠、钾，或者碱土金属钙、镁，或者碱性氨基酸赖氨酸形成的盐。

本申请所述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，稀释剂、赋形剂水，填充剂淀粉或蔗糖；黏合剂纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂甘油；崩解剂琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物；表面活性剂十六烷醇；吸附载体高岭土或皂黏土；润滑剂滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁或聚乙二醇；进一步加入其它辅剂香味剂或甜味剂。

本发明所述药物的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化，其日剂量可以是0.01～40mg/kg体重，优选0.1～20mg/kg体重，可以一次或多次施用。本发明的药物组合物剂型可以为片剂、胶囊、口服液、针剂、注射用冻干剂或粉针剂等。由于上述萘醌二聚体可从柄花茜草、钩毛茜草等茜草属植物中提取分离，而片剂、胶囊、口服液、针剂、注射用冻干剂或粉针剂等药物剂型的制备也是本领域的常规知识。因此，由上述萘醌二聚体与相应载体制备的各种药物剂型也能够由本领域技术人员实现。

本发明化合物可以以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其他液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

有益效果：本发明利用人源乳腺癌细胞MDA-MB-231评价Rubioncolin C体外抗肿瘤转移活性，以及利用鼠源乳腺癌细胞株4T1-Luc评价Rubioncolin C体内抗肿瘤转移活性。结果发现，Rubioncolin C能在体内外明显的肿瘤转移抑制活性，可用于制备抗肿瘤转移药物。本发明首次说明了萘醌二聚体Rubioncolin C是一种肿瘤转移抑制剂，能够有效发挥体内外抗肿瘤转移活性，因此，Rubioncolin C可用于制备抗肿瘤转移药物。由于本发明所述的萘醌二聚体为天然化合物，其剂型和用药方式多样化，具有广泛的临床应用前景。

附图说明

图1为本发明的萘醌二聚体体外抗肿瘤转移活性实验；

图2为本发明的萘醌二聚体体内抗肿瘤转移活性试验。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作出详细说明。

本实施例中使用的设备、材料、试剂除有特殊说明以外，均可以通过市场购买获取。

本发明中所述的萘醌二聚体Rubioncolin C的制备方法可参照Wang,Z.,etal.Rubipodanones A-D,naphthohydroquinone dimers from the roots and rhizomesof Rubia podantha.Phytochemistry,2018,145,153-160.

实施例1：

本发明的萘醌二聚体Rubioncolin C在乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞上用SRB比色法检测其细胞毒活性；用细胞划痕实验和Transwell细胞侵袭实验检测其对细胞迁移和侵袭的抑制活性。实验原理、方法和结果如下：

(1)SRB比色法

实验原理：磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B，SRB)是一种粉红色阴离子染料，在水中易溶解，细胞内组成蛋白质的碱性氨基酸在酸性条件下可以特异性的与该离子结合，并在540nm波长下产生吸收峰，其吸光度值与活细胞数量成线性正相关，可以用于定量检测活细胞数量。

实验方法：以含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基将MDA-MB-231细胞制成细胞悬液，按1×10⁵个/mL细胞接种于96孔板中，每孔100μL，继续培养12h后，分别加入不同浓度萘醌二聚体Rubioncolin C，使其终浓度分别为40μM、20μM、10μM、5μM、2μM和1μM，每个浓度设置4个复孔。Rubioncolin C作用24h或48h后，每孔加入50％醋酸溶液50μL，室温固定1h，再清洗晾干。每孔加入0.4％SRB染色液100μL，在室温放置染色30min。之后，弃去染液并用1％醋酸溶液清洗3遍，烘干，每孔加入100μL的10mM Tris溶解，于540nm处测定其吸光值，计算抑制率及IC₅₀值。

(2)细胞划痕实验

实验原理：当细胞在培养皿底部呈单层生长时，在单层细胞上制造出一个空白区域，即“划痕”。划痕边缘的细胞会向着空白的区域逐渐移动并生长，通过划痕闭合的速度判断出细胞迁移能力的变化。

实验方法：以含10％胎牛血清的RMPI 1640培养基将MDA-MB-231细胞制成细胞悬液，按2×10⁵个/mL细胞，接种于6孔板中，待细胞融合度达90％时，用无血清RMPI 1640培养基饥饿细胞24h，除去旧培养基，并用PBS清洗，用灭菌枪头在孔底划出“井”字，并用PBS清洗除掉落的细胞，再分别加入含有不同浓度萘醌二聚体Rubioncolin C(0μM、1μM、2μM、5μM)培养基，继续培养，并在显微镜下于同一位置拍照记录0h、6h、12h和24h细胞情况。

(3)Transwell细胞迁移侵袭实验

实验原理：Transwell小室是一种带有孔径为8μm的微孔的聚碳酸酯膜的滤膜器，将培养孔分隔为上室和下室。聚碳酸酯膜具有一定的通透性，在下室加入趋化因子后，上室细胞可以穿过聚碳酸酯膜上的小孔进入下室，计数进入下室的细胞数目来评价细胞迁移能力。Transwell侵袭实验与迁移实验类似，区别在于侵袭实验需要在Transwell小室聚碳酸酯膜上加入Matrigel基质胶，基质胶成分与细胞外基质相似，细胞欲进入下室，需要分泌MMPs降解基质胶，最后通过计数进入下室的细胞数目来评价细胞侵袭能力。

实验方法：以含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基培养细胞至一定融合度，在含1％胎牛血清的RPMI 1640培养基中饥饿24小时，并在无血清RPMI 1640培养基中重悬细胞，调整细胞浓度为5×10⁶个/mL。取出Transwell小室，在下室加入含10％胎牛血清的完全培养基600μL，上室分别加入含有不同浓度萘醌二聚体Rubioncolin C(0μM、1μM、2μM、5μM)培养基100μL，继续培养。12h后，弃去上层液体，PBS冲洗两次，4％多聚甲醛固定15min，用棉签小心擦去上层细胞，结晶紫染色15min，置于显微镜下观察并拍照，计数穿过小室的细胞数量。Transwell侵袭实验需将Matrigel胶提前在2-8℃过夜融化，在冰上用预冷的枪头吸取Matrigel胶于预冷的无血清RPMI 1640培养基中，后续步骤同Transwell细胞迁移实验。

实验结果如图1，其中1a为Rubioncolin C对MDA-MB-231细胞分别作用24h和48h的细胞生存曲线；1b为Rubioncolin C对MDA-MB-231细胞的细胞迁移的影响；1c为Rubioncolin C对MDA-MB-231细胞的Transwell细胞迁移侵袭的影响。结果显示，Rubioncolin C对MDA-MB-231细胞具有明显的细胞毒活性，IC₅₀为4.21μM(24h)和1.98μM(48h)，并且能明显抑制细胞迁移和侵袭，发挥体外抗肿瘤转移活性。

实施例2:

本发明的萘醌二聚体Rubioncolin C在尾静脉注射萤火虫荧光素酶标记的鼠源乳腺癌细胞株4T1-Luc乳腺癌肺转移模型中对肿瘤转移过程的影响。实验原理、方法和结果如下：

实验原理：将萤火虫荧光素酶标记的鼠源乳腺癌细胞株(4T1-Luc)尾静脉注射入雌性BALB/c小鼠体内建立乳腺癌肺转移动物模型，通过活体成像技术检测Rubioncolin C对肿瘤转移过程的影响。4T1-Luc尾静脉注射进入小鼠体内后成模率高，可作为研究肿瘤转移的理想动物体内模型。

实验方法：收集生长良好的4T1-Luc细胞，调整细胞浓度为1×10⁶个/mL，尾静脉注射入BALB/c雌性小鼠，每只100μL，建立乳腺癌肺转移模型。接种后5天，利用小动物活体成像仪检查肿瘤细胞在小鼠肺部的转移定殖情况，将成功在肺部出现转移灶的小鼠随机分组，分别腹腔注射空白制剂、Rubioncolin C(20mg/kg)，隔日一次，环磷酰胺(30mg/kg)作为阳性对照。开始给药为第0天，分别于给药第0天、第5天和第10天，利用小动物活体成像检查不同时间点的肺转移情况和转移瘤对应的吸收光子数。

实验结果见图2。图中表明尾静脉注射鼠源乳腺癌细胞4T1-Luc后，其在小鼠肺部形成明显的转移灶，而经Rubioncolin C治疗后，与空白组相比，肺部相对吸收光子数明显减少，抑制了小鼠肺肿瘤转移灶的形成，说明Rubioncolin C为一类新型的肿瘤转移天然抑制剂。

实施例3：

在萘醌二聚体Rubioncolin C中加入4％的硫酸乙醇溶液，pH＝4，过滤，干燥，制成硫酸盐Rubioncolin C。

实施例4：

在萘醌二聚体Rubioncolin C中加入4％的盐酸溶液，pH＝4，过滤，干燥，制成盐酸盐Rubioncolin C。

实施例5：

在萘醌二聚体Rubioncolin C中加入4％的酒石酸溶液，pH＝4，过滤，干燥，制成酒石酸盐Rubioncolin C。

实施例6：

在萘醌二聚体Rubioncolin C中加入4％的柠檬酸溶液，pH＝4，过滤，干燥，制成柠檬酸盐Rubioncolin C。

实施例7：

片剂：萘醌二聚体Rubioncolin C或实施例3-6所得的盐10mg，乳糖180mg，淀粉55mg，硬脂酸镁5mg。

制备方法：将化合物或其盐、乳糖和淀粉混和，用水均匀湿润、把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，化合物含量为10mg。

实施例8：

安瓿剂：萘醌二聚体Rubioncolin C或实施例3-6所得的盐2mg，氯化钠10mg。

制备方法：将化合物或其盐和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。

实施例9：

注射用冻干剂：萘醌二聚体Rubioncolin C或实施例3-6所得的盐10mg，碳酸氢钠2mg，甘露醇252mg。

制备方法：将碳酸氢钠、甘露醇，加注射用水溶解，加活性碳吸附30min除热原，过滤除去活性碳，在滤液中加入化合物或其盐，超声处理使溶解，用1N盐酸调节pH为5.0-7.0，微孔滤膜滤过，加注射用水，分装，冷冻干燥，上塞，轧盖，即得。

实施例10：

胶囊剂：萘醌二聚体Rubioncolin C或实施例3-6所得的盐10mg，乳糖187mg，硬脂酸镁3mg。

制备方法：将化合物或其盐与助溶剂混和，过筛，均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量为10mg。