阅读说明：本技术 一种利用培养法检测解脲脲原体和微小脲原体的试剂盒及其制备方法 (Kit for detecting ureaplasma urealyticum and ureaplasma parvum by using culture method and preparation method thereof ) 是由 周丽霞 王则宇 王利英 李晓霞 张利红 刘亚峰 秦军领 崔晓 于 2020-06-05 设计创作，主要内容包括：本发明涉及临床诊断技术领域,公开了一种利用培养法检测解脲脲原体和微小脲原体的试剂盒及其制备方法。本发明所述试剂盒包括载有微小脲原体鉴定孔和解脲脲原体鉴定孔的检测板；其中,所述解脲脲原体鉴定孔中含有脲酶抑制剂和抗菌药物。本发明提供了一种新型用培养法鉴别区分解脲脲原体(UU)和微小脲原体(UP)试剂盒,将脲酶抑制剂和抗菌药物联合使用,对解脲脲原体(UU)鉴定孔的特异性有明显的提高,从而将脲原体属中的解脲脲原体(UU)和微小脲原体(UP)彻底分开,同时某些抗菌药物组合可以提高其检测灵敏度。本发明试剂盒操作简单方便,适于临床的大面积普及应用。(The invention relates to the technical field of clinical diagnosis, and discloses a kit for detecting ureaplasma urealyticum and ureaplasma parvum by using a culture method and a preparation method thereof. The kit comprises a detection plate carrying a small ureaplasma urealyticum identification hole and a ureaplasma urealyticum identification hole; wherein, the ureaplasma urealyticum identification hole contains urease inhibitor and antibacterial drug. The invention provides a novel kit for identifying and distinguishing Ureaplasma Urealyticum (UU) and ureaplasma micans (UP) by using a culture method, wherein a urease inhibitor and an antibacterial agent are combined for use, the specificity of a Ureaplasma Urealyticum (UU) identification hole is obviously improved, so that the Ureaplasma Urealyticum (UU) and the ureaplasma micum micans (UP) in ureaplasma are thoroughly separated, and meanwhile, the detection sensitivity of some antibacterial agent combinations can be improved. The kit is simple and convenient to operate and is suitable for large-area popularization and application in clinic.)

一种利用培养法检测解脲脲原体和微小脲原体的试剂盒及其 制备方法

技术领域

本发明涉及临床诊断领域，具体的说是涉及一种利用培养法检测解脲脲原体和微小脲原体的试剂盒及其制备方法。

背景技术

1999年，Kong等依据系统进化分析法将脲原体属(Ureaplasma)的两个生物型分为两个新种，生物Ⅰ群作为一个独立的物种，命名为微小脲原体(Ureaplasma parvum，UP)；生物Ⅱ群仍保留原命名为解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum，UU)。直至2007年国际细菌学分类学会才正式将脲原体中生物Ⅰ群作为一个新物种，命名为微小脲原体(Ureaplasmaparvum，UP)。长期以来人们对解脲脲原体(UU)与各种疾病相关性研究一直都是基于包含了微小脲原体(UP)和解脲脲原体(UU)上进行的，以至于临床上呈现超高的阳性率但其与疾病相关性不强，从而导致解脲脲原体(UU)临床检测价值和意义受到诸多质疑。

目前比较一致的意见是解脲脲原体(UU)与非淋菌性尿道炎(non-gonorrhealurethritis，NGU)高度相关，微小脲原体(UP)更为常见且无症状携带。正是由于微小脲原体(UP)与非淋菌性尿道炎NGU相关性较低，且携带率远高于解脲脲原体(UU)，因此准确检测并鉴别出解脲脲原体(UU)就显得尤为必要。

市场上关于解脲脲原体检测试剂种类很多，包括培养法、免疫学法和分子生物学法，但大多是既检测解脲脲原体(UU)又检测微小脲原体(UP)，并不能对二者进行单独区分检测。目前真正能够做到对解脲脲原体(UU)和微小脲原体(UP)单独区分检测的只有分子生物学法，常见的有荧光PCR联合凝胶电泳以及全基因测序，但这些试剂往往操作过于复杂，价格非常昂贵，不太适宜临床的普及应用，而且也无法同步进行抗药物测定。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用培养法检测解脲脲原体和微小脲原体的试剂盒及其制备方法，使得所述试剂盒能够提高检测解脲脲原体的灵敏度和特异性。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种利用培养法检测解脲脲原体和微小脲原体的试剂盒，包括载有微小脲原体鉴定孔和解脲脲原体鉴定孔的检测板；其中，所述解脲脲原体鉴定孔中含有脲酶抑制剂和抗菌药物。

本发明将脲酶抑制剂和抗菌药物联合使用，对解脲脲原体(UU)鉴定孔的特异性有明显的提高，且满足性能需求。从而将脲原体属中的解脲脲原体(UU)和微小脲原体(UP)彻底分开。将脲酶抑制剂和某些抗菌药物联合使用的原理为：(1)脲酶抑制剂的选择依据为微小脲原体(UP)脲酶在分解尿素时，需金属伴侣蛋白将脲酶催化成熟，选择一种脲酶金属伴侣蛋白阻断剂(即脲酶抑制剂)，功能性扰动破坏脲酶的成熟过程，从而使得微小脲原体(UP)的脲酶失去分解尿素能力，从而使得微小脲原体(UP)和解脲脲原体(UU)区分；(2)抗菌药物的选择依据为解脲脲原体(UU)的最低抑菌浓度(MIC)值高于微小脲原体(UP)。同时，本发明还发现，在提高特异性的基础上，选择特定的抗菌药物组合能够提高对解脲脲原体的检测灵敏度。

作为优选，所述脲酶抑制剂选自异羟肟酸类和磷酸氨酯类。进一步地，所述脲酶抑制剂优选自乙酰氧肟酸、正丁基硫代磷酸三胺、丁基磷酰三胺中的一种或两种以上。

作为优选，所述抗菌药物选自左氧氟沙星、莫西沙星、庆大霉素、原始霉素、阿米卡星中的一种或两种以上。更优选地，所述抗菌药物为原始霉素+莫西沙星组合、莫西沙星+庆大霉素组合或左氧氟沙星+庆大霉素组合，最优选地为原始霉素+莫西沙星组合。

作为优选，所述脲酶抑制剂的含量为2mg/L-200mg/L。在本发明

具体实施方式

中，所述脲酶抑制剂为正丁基硫代磷酸三胺5.7mg/L或乙酰氧肟酸47-53mg/L。

作为优选，所述抗菌药物的含量为1mg/L-50mg/L。在本发明具体实施方式中，所述抗菌药物为莫西沙星不高于2mg/L、原始霉素不高于20mg/L、左氧氟沙星不高于2mg/L、庆大霉素不高于42mg/L或它们的组合。

作为优选，所述微小脲原体鉴定孔含有165mg/L-550mg/L(因锰盐有多种，比如氯化锰，四水合氯化锰，硫酸锰，乙酸锰等分子量都不同，所以此处体现的是锰盐中锰的含量；20μL/孔)的锰离子，在该用量下锰离子可以对UU进行抑制而未达到抑制UP的用量。所述锰离子可以是任何能够提供游离锰离子的溶液，在本发明具体实施方式中由硫酸锰、氯化锰、硝酸锰或乙酸锰溶液提供，锰离子浓度可具体选择为191mg/L、267mg/L、178mg/L、394mg/L。

同时，本发明还提供了所述试剂盒的制备方法，将脲酶抑制剂和抗菌药物按要求浓度以20μL/孔加入到解脲脲原体鉴定孔中，将锰离子溶液按要求的浓度以20μL/孔加入到微小脲原体鉴定孔，然后对两孔干燥，使脲酶抑制剂和抗菌药物附着在解脲脲原体鉴定孔内壁上，使锰离子附着在微小脲原体鉴定孔内壁上，获得所述试剂盒。

由以上技术方案可知，本发明提供了一种新型用培养法鉴别区分解脲脲原体(UU)和微小脲原体(UP)试剂盒，将脲酶抑制剂和抗菌药物联合使用，对解脲脲原体(UU)鉴定孔的特异性有明显的提高，从而将脲原体属中的解脲脲原体(UU)和微小脲原体(UP)彻底分开，同时某些抗菌药物组合可以提高其检测灵敏度。本发明试剂盒操作简单方便，适于临床的大面积普及应用。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种利用培养法检测解脲脲原体和微小脲原体的试剂盒及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明所述试剂盒及其制备方法已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述试剂盒及其制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明试剂盒使用时，把菌株或可疑样本加入到脲原体培养基中，混合均匀后分别加入到解脲脲原体(UU)鉴定孔和微小脲原体(UP)鉴定孔中，37℃培养24-48小时，根据解脲脲原体(UU)鉴定孔和微小脲原体(UP)鉴定孔中培养基是否发生变色，来判定样本中是否存在解脲脲原体(UU)和微小脲原体(UP)。

判读方法：(1)解脲脲原体(UU)鉴定孔和微小脲原体(UP)鉴定孔均变色，说明样本中同时存在解脲脲原体和微小脲原体；

(2)解脲脲原体(UU)鉴定孔变色，微小脲原体(UP)鉴定孔不变色，说明样本中仅存在解脲脲原体；

(3)解脲脲原体(UU)鉴定孔不变色，微小脲原体(UP)鉴定孔变色，说明样本中仅存在微小脲原体；

(4)解脲脲原体(UU)鉴定孔和微小脲原体(UP)鉴定孔均不变色，说明样本中既无解脲脲原体，也无微小脲原体。

本发明UU和UP的MIC值源于文献和近百株的解脲脲原体和微小脲原体临床菌株试验，所选抗菌药物对UU和UP的MIC值见下表1：

表1

抗菌药物	UU(MIC值)	UP(MIC值)
			左氧氟沙星	2mg/L	1mg/L
莫西沙星	2mg/L	0.5mg/L
			庆大霉素	42mg/L	10mg/L
原始霉素	20mg/L	2mg/L
			阿米卡星	5mg/L	10mg/L

以下就本发明所提供的一种利用培养法检测解脲脲原体和微小脲原体的试剂盒及其制备方法做进一步说明。

实施例1：解脲脲原体(UU)鉴定孔的特异性和灵敏度

1、分组

解脲脲原体(UU)鉴定孔1(加样量为20μL/孔)：乙酰氧肟酸53mg/L；

解脲脲原体(UU)鉴定孔2(加样量为20μL/孔)：正丁基硫代磷酸三胺5.7mg/L，莫西沙星2mg/L；

解脲脲原体(UU)鉴定孔3(加样量为20μL/孔)：正丁基硫代磷酸三胺5.7mg/L，葡萄糖5g/L；

解脲脲原体(UU)鉴定孔4(加样量为20μL/孔)：乙酰氧肟酸47mg/L，左氧氟沙星2mg/L，庆大霉素42mg/L；

解脲脲原体(UU)鉴定孔5(加样量为20μL/孔)：乙酰氧肟酸53mg/L，原始霉素20mg/L，莫西沙星2mg/L；

解脲脲原体(UU)鉴定孔6(加样量为20μL/孔)：乙酰氧肟酸53mg/L，莫西沙星2mg/L，庆大霉素42mg/L；

2、检测

采用不同浓度的UU菌、UP菌和其他干扰菌株进行灵敏度和特异性的检测的，结果见表2和表3。

表2灵敏度结果

表3特异性结果

实施例2：微小脲原体(UP)鉴定孔的特异性和灵敏度

1、分组

微小脲原体(UP)鉴定孔1(加样量为20μL/孔)：氯化锰563mg/L(锰离子浓度为191mg/L)；

微小脲原体(UP)鉴定孔2(加样量为20μL/孔)：硫酸锰723mg/L(锰离子浓度为267mg/L)；

微小脲原体(UP)鉴定孔3(加样量为20μL/孔)：氯化锰405mg/L(锰离子浓度为178mg/L)；

微小脲原体(UP)鉴定孔4(加样量为20μL/孔)：乙酸锰602mg/L(锰离子浓度为178mg/L)、硫酸镁0.06mg/L；

微小脲原体(UP)鉴定孔5(加样量为20μL/孔)：乙酸锰602mg/L(锰离子浓度为178mg/L)；

微小脲原体(UP)鉴定孔6(加样量为20μL/孔)：乙酸锰9mg/L(锰离子浓度为1.84mg/L)；

2、检测

采用不同浓度的UU菌、UP菌和其他干扰菌株进行灵敏度和特异性的检测的，结果见表4和表5。

表4灵敏度结果

表5特异性结果

由表3和表4可知，锰离子浓度低于本发明所限定的范围时(孔6)，其无法准确区分UU和UP，特异性不符合要求；同时，添加镁离子与否并不影响检测结果(孔4和孔5)。

以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。