阅读说明：本技术 一种蝴蝶兰软腐病抗性鉴定方法 (Identification method for resistance of soft rot of phalaenopsis ) 是由 杨祁云 林壁润 沈会芳 张景欣 孙大元 蒲小明 于 2020-06-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了提供一种蝴蝶兰软腐病抗性鉴定方法,剪取蝴蝶兰品种中下部叶片,用酒精将叶片及叶柄伤口擦拭一遍,自然晾干。将病原菌株接种于NA培养液,用无菌水配制成细菌悬浮液。用无菌大头针在叶片中央密集轻刺,在针刺处滴细菌悬浮液,放入磁盘中保湿密封,黑暗培养。当叶片出现水渍状病斑时,观察并记录叶片发病情况。以平均防效进行分级,评价品种的抗感特性。(The invention discloses a method for identifying the soft rot resistance of phalaenopsis, which comprises the steps of shearing the middle and lower leaves of phalaenopsis, wiping the leaves and the petiole wounds with alcohol once, and naturally drying. The pathogenic strains are inoculated in NA culture solution, and bacteria suspension is prepared by using sterile water. Puncturing the leaf with sterile pin, dripping bacterial suspension, placing in magnetic disk, and culturing in dark. When water stain-like spots appear on the leaves, the disease condition of the leaves is observed and recorded. The average control effect is graded to evaluate the anti-influenza characteristics of the variety.)

一种蝴蝶兰软腐病抗性鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种农作物病虫害抗性鉴定方法，具体的说就是一种蝴蝶兰软腐病抗性鉴定方法，属农业植保领域。

背景技术

蝴蝶兰软腐病(phalaenopsis soft rot disease)，由迪克氏细菌Dickeyadieffenbachiae引起，为蝴蝶兰的主要病害之一，分布广泛且全国各蝴蝶兰生产区均有发生。发病后，病原菌分泌果胶酶，溶解细胞壁中的果胶质，使组织软腐，且蔓延迅速，造成严重的经挤损失。抗病品种的选育是控制该病害的主要手段。但是目前国内外尚未有关于蝴蝶兰批准抗性鉴定的方法，因此，发明准确评价品种的抗性的方法显得尤其重要。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明旨在于提供一种蝴蝶兰软腐病抗性鉴定方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种蝴蝶兰软腐病抗性鉴定方法，所述方法包括以下步骤：

S1病原菌分离和准备，获取蝴蝶兰软腐病样品，按常规消毒，再用无菌刀将病健交接处的组织切成薄片移到NA培养基上培养，经分离纯化，并经柯赫氏法则验证确定；于32℃下在NA平板上培养，获病原菌纯培养；将病原菌株接种于NA培养液，在32℃转速150r/min培养36h，用无菌水配制成10⁶-10⁷CFU/mL的细菌悬浮液；

S2将灭菌后的滤纸置于培养皿中，喷无菌水至滤纸湿润后备用；

S3品种准备，选28个蝴蝶兰品种，每品种准备5片叶子，大小直径为50mm-70mm，清洗晾干后用质量浓度75％的酒精消毒，用高感软腐病GD1做对照；将消毒后的蝴蝶兰叶片分别置于保湿好的消毒平板中；

S4接种鉴定，用无菌大头针在叶片中央密集轻刺5下，在针刺处滴0.2mL步骤S1获得的细菌悬浮液，每个处理4次重复，每个重复5片叶；

S5调查评价，放入磁盘中保湿密封，30℃黑暗培养。当叶片出现水渍状病斑时，每24h观察并记录叶片发病情况；

S6按分级标准进行分级并计算病情指数，根据病情指数进行品种的抗感特性评价.

优选的，蝴蝶兰品种软腐病病抗性水平按照以下标准进行确定：

高抗：病情指数≤20；

抗病：20＜病情指数≤40；

中抗：40＜病情指数≤60；

感病：60＜病情指数≤80；

高感：80＜病情指数；

优选的，分级标准是：

0级，针刺处无水渍状病斑；1级，针刺处见水渍状病斑，病斑不扩散到针刺范围外0.2cm距离外；

2级，病斑扩散到针刺范围外0.2cm距离外，同时病斑面积≤25％叶片面积；

3级，25％叶片面积＜病斑面积≤50％叶片面积；

4级，50％叶片面积＜病斑面积≤75％叶片面积；

5级，75％叶片面积＜病斑面积。

优选的，病情指数计算公式为：

需要指出的是，本发明所使用的NA培养基配方为：牛肉浸膏0.3％，酵母浸膏0.1％，蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，琼脂1.8％，水1000ml，pH6.8-7.0；

本发明的有益效果在于，该鉴定方法科学，省时省力，过程简单易于操作，根据病斑分级并计算病情指数进行抗性评价最为有效。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。

本发明为一种蝴蝶兰软腐病抗性鉴定方法，所述方法包括以下步骤：

S1病原菌分离和准备，获取蝴蝶兰软腐病样品，按常规消毒，再用无菌刀将病健交接处的组织切成薄片移到NA培养基上培养，经分离纯化，并经柯赫氏法则验证确定；于32℃下在NA平板上培养，获病原菌纯培养；将病原菌株接种于NA培养液，在32℃转速150r/min培养36h，用无菌水配制成10⁶-10⁷CFU/mL的细菌悬浮液；

S2将灭菌后的滤纸置于培养皿中，喷无菌水至滤纸湿润后备用；

S3品种准备，选28个蝴蝶兰品种，每品种准备5片叶子，大小直径为50mm-70mm，清洗晾干后用质量浓度75％的酒精消毒，用高感软腐病GD1做对照；将消毒后的蝴蝶兰叶片分别置于保湿好的消毒平板中；

S4接种鉴定，用无菌大头针在叶片中央密集轻刺5下，在针刺处滴0.2mL步骤S1获得的细菌悬浮液，每个处理4次重复，每个重复5片叶；

S5调查评价，放入磁盘中保湿密封，30℃黑暗培养。当叶片出现水渍状病斑时，每24h观察并记录叶片发病情况；

S6按分级标准进行分级并计算病情指数，根据病情指数进行品种的抗感特性评价.

优选的，蝴蝶兰品种软腐病病抗性水平按照以下标准进行确定：

高抗：病情指数≤20；

抗病：20＜病情指数≤40；

中抗：40＜病情指数≤60；

感病：60＜病情指数≤80；

高感：80＜病情指数；

优选的，分级标准是：

0级，针刺处无水渍状病斑；1级，针刺处见水渍状病斑，病斑不扩散到针刺范围外0.2cm距离外；

2级，病斑扩散到针刺范围外0.2cm距离外，同时病斑面积≤25％叶片面积；

3级，25％叶片面积＜病斑面积≤50％叶片面积；

4级，50％叶片面积＜病斑面积≤75％叶片面积；

5级，75％叶片面积＜病斑面积。

优选的，病情指数计算公式为：

实施例1

病原菌分离和准备：从广东省农业科学院兰花苗圃取蝴蝶兰软腐病样品，按常规消毒，再用无菌刀将病健交接处的组织切成薄片移到NA培养基上培养，经分离纯化，并经柯赫氏法则验证确定；于32℃下在NA平板上培养，获病原菌纯培养；将病原菌株接种于NA培养液，在32℃转速150r/min培养36h，用无菌水配制成10⁶-10⁷CFU/mL的细菌悬浮液。

平板消毒保湿：将灭菌后的滤纸置于培养皿中，喷无菌水至滤纸湿润后备用；

参试品种准备：选18个蝴蝶兰品种，每品种准备5片叶子，大小直径为50mm-70mm，清洗晾干后用质量浓度75％的酒精消毒，用高感软腐病GD1做对照；将消毒后的蝴蝶兰叶片分别置于保湿好的消毒平板中；

接种鉴定：用无菌大头针在叶片中央密集轻刺5下，在针刺处滴0.2mL细菌悬浮液，每个处理4次重复，每个重复5片叶；

调查评价：放入磁盘中保湿密封，30℃黑暗培养。当叶片出现水渍状病斑时，每24h观察并记录叶片发病情况，按分级标准进行分级并计算病情指数，根据病情指数进行品种的抗感特性评价，蝴蝶兰品种软腐病病抗性水平按照以下标准进行确定：

高抗 病情指数≤20；

抗病20＜病情指数≤40；

中抗40＜病情指数≤60；

感病60＜病情指数≤80；

高感80＜病情指数，

所述的分级标准是：

0级，针刺处无水渍状病斑；1级，针刺处见水渍状病斑，病斑不扩散到针刺范围外0.2cm距离外；

2级，病斑扩散到针刺范围外0.2cm距离外，同时病斑面积≤25％叶片面积；

3级，25％叶片面积＜病斑面积≤50％叶片面积；

4级，50％叶片面积＜病斑面积≤75％叶片面积；

5级，75％叶片面积＜病斑面积。

所述的病情指数计算公式为：

经过抗性鉴定试验，结果见表1

表1蝴蝶兰品种软腐病病抗性鉴定结果

实施例2

病原菌的培养：从广东省顺德区取蝴蝶兰软腐病样品，按常规消毒，再用无菌刀将病健交接处的组织切成薄片移到NA培养基上培养，经分离纯化，并经柯赫氏法则验证确定；于32℃下在NA平板上培养，获病原菌纯培养；取蝴蝶兰细菌性软腐病菌于32℃下在NA平板上培养；将病原菌株接种于NA培养液，在30℃转速150r/min培养40h，用无菌水配制成10⁶CFU/mL的细菌悬浮液。

参试品种准备：选21个蝴蝶兰品种，每品种准备15片叶子，大小直径为50mm-70mm，清洗晾干后用质量浓度75％的酒精消毒，用高感软腐病GD001做对照；将消毒后的蝴蝶兰叶片分别置于保湿好的消毒平板中；

接种鉴定：用无菌大头针在叶片中央密集轻刺5下，在针刺处滴0.2-0.3mL细菌悬浮液，每个处理3次重复，每个重复5片叶；

调查评价：放入磁盘中保湿密封，32℃黑暗培养。当叶片出现水渍状病斑时，每12h观察并记录叶片发病情况，按分级标准进行分级并计算病情指数，根据病情指数进行品种的抗感特性评价，蝴蝶兰品种软腐病病抗性水平按照以下标准进行确定：

高抗病情指数≤20；

抗病20＜病情指数≤40；

中抗40＜病情指数≤60；

感病60＜病情指数≤80；

高感80＜病情指数，

所述的分级标准是：

0级，针刺处无水渍状病斑；1级，针刺处见水渍状病斑，病斑不扩散到针刺范围外0.2cm距离外；

2级，病斑扩散到针刺范围外0.2cm距离外，同时病斑面积≤25％叶片面积；

3级，25％叶片面积＜病斑面积≤50％叶片面积；

4级，50％叶片面积＜病斑面积≤75％叶片面积；

5级，75％叶片面积＜病斑面积。

所述的病情指数计算公式为：

经过抗性鉴定试验，结果表明广东省的蝴蝶兰品种有一些抗病的，但是优质品种。

表2广东省蝴蝶兰品种软腐病病抗性鉴定结果

实施例3

病原菌的培养：从广东省广州市从化区取蝴蝶兰软腐病样品，按常规消毒，再用无菌刀将病健交接处的组织切成薄片移到NA培养基上培养，经分离纯化，并经柯赫氏法则验证确定；于32℃下在NA平板上培养，获病原菌纯培养；取蝴蝶兰细菌性软腐病菌于30℃下在NA平板上培养；将病原菌株接种于NA培养液，在30℃转速130-200rpm/min培养30-36h，用无菌水配制成10⁷CFU/mL的细菌悬浮液。

参试品种准备：来自广东省农业科学院的13个蝴蝶兰品种，每品种准备12片叶子，大小直径为50mm-70mm，清洗晾干后用质量浓度75％的酒精消毒，用高感软腐病GD001做对照；将消毒后的蝴蝶兰叶片分别置于保湿好的消毒平板中；

接种鉴定：用无菌大头针在叶片中央密集轻刺6下，在针刺处滴0.25mL细菌悬浮液，每个处理3次重复，每个重复3片叶；

调查评价：放入磁盘中保湿密封，30℃黑暗培养。当叶片出现水渍状病斑时，每12h观察并记录叶片发病情况，按分级标准进行分级并计算病情指数，根据病情指数进行品种的抗感特性评价，蝴蝶兰品种软腐病病抗性水平按照以下标准进行确定：

高抗病情指数≤20；

抗病20＜病情指数≤40；

中抗40＜病情指数≤60；

感病60＜病情指数≤80；

高感80＜病情指数，

所述的分级标准是：

0级，针刺处无水渍状病斑；1级，针刺处见水渍状病斑，病斑不扩散到针刺范围外0.2cm距离外；

2级，病斑扩散到针刺范围外0.2cm距离外，同时病斑面积≤25％叶片面积；

3级，25％叶片面积＜病斑面积≤50％叶片面积；

4级，50％叶片面积＜病斑面积≤75％叶片面积；

5级，75％叶片面积＜病斑面积。

所述的病情指数计算公式为：

过抗性鉴定试验，结果表明广东省农业科学院蝴蝶兰品种有一些抗病的，但是优质品种。

表3广东省农业科学院蝴蝶兰品种软腐病病抗性鉴定结果

抗病品种被认为是防治植物病害的有效手段，蝴蝶兰细菌性软腐病在抗性品种筛选方面国内外尚未有报道。本发明采用离体叶片法对蝴蝶兰品种进行了抗性筛选试验，从而建立快速准确的抗性鉴定方法，为蝴蝶兰细菌性软腐病抗性品种资源作出合理评价。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。