检测GP1BA基因rs6065位点多态性的人工模拟核酸分子信标与试剂盒
阅读说明：本技术 检测GP1BA基因rs6065位点多态性的人工模拟核酸分子信标与试剂盒 (Artificial simulated nucleic acid molecular beacon and kit for detecting GP1BA gene rs6065 site polymorphism ) 是由 葛猛 潘世让 杜柏均 余倩 王宏伟 于 2019-02-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种GP1BA基因rs6065位点多态性的分型检测方法与试剂盒。本发明采用GP1BA基因特异性的引物SEQ1和SEQ2扩增GP1BA基因片段,同时在GP1BA基因特异性的引物界定的扩增区域内设计GP1BA基因特异性人工模拟核酸分子信标SEQ3-FAM和SEQ4-VIC。本发明提供的基于基因特异性PCR结合人工模拟核酸分子信标判断GP1BA基因rs6065位点多态性的方法不仅准确率高,而且还具有检测速度快、操作简单、结果判读客观、闭管反应污染少等优点,非常适合于在临床中大规模开展。(The invention discloses a typing detection method and a kit for GP1BA gene rs6065 site polymorphism. The GP1BA gene specific primers SEQ1 and SEQ2 are adopted to amplify GP1BA gene segments, and GP1BA gene specific artificial simulated nucleic acid molecular beacons SEQ3-FAM and SEQ4-VIC are designed in an amplification region defined by the GP1BA gene specific primer. The method for judging the rs6065 locus polymorphism of the GP1BA gene based on the gene specificity PCR combined with the artificial simulation nucleic acid molecular beacon, provided by the invention, has the advantages of high accuracy, high detection speed, simplicity in operation, objective result interpretation, less closed-tube reaction pollution and the like, and is very suitable for large-scale clinical development.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及GP1BA基因rs6065位点多态性的分型检测方法与试剂盒。
背景技术
高血压是一种以动脉血压持续升高为表象的长期医学病症。高血压通常不会引起症状，然而长期的高血压则是导致冠状动脉疾病、中风、心力衰竭、心房颤动、外周血管疾病、视力丧失、慢性肾病和痴呆的主要风险因素。高血压被分为原发性高血压和继发性高血压，约90~95%的病例是原发性的，是由于不良生活方式和遗传因素导致的。饮食过咸、肥胖、吸烟和饮酒是生活因素中导致血压升高的原因。其余5~10%的病例被归类为继发性高血压，是由于可辨认的原因导致的，例如慢性肾病、肾动脉狭窄、内分泌紊乱或使用避孕药。高血压影响着全球16~37%的人口，仅在美国就约有30%的人群患病。
目前，通过改变生活方式或服用降压药物可以有效降低血压，从而减少并发症的风险。生活方式的改变包括减肥、减少食盐摄入、加强运动锻炼和健康饮食。如果生活方式的改变不足以使血压下降，那就要通过降压药物来控制血压。目前约有70%的高血压患者通过服用降压药物控制血压，然而这需要对每位患者进行多次临床随访和多种药物治疗，从而使得高血压的控制成为一个困难而漫长的过程。
近年来的药物基因组学研究显示，遗传因素在高血压的药物治疗中起着重要的作用。赖诺普利是一种血管紧张素转换酶抑制剂类药物，可以单用或与其它药物合用治疗各种程度的高血压及肾性高血压病。若使用赖诺普利治疗高血压，患者GP1BA基因中的rs6065（C/T）多态性位点将会影响治疗效果。TT型纯合子在治疗后受到心血管疾病、冠心病影响的风险较高。因此，对于那些将药物遗传学研究用于临床以指导抗高血压治疗策略的人来说，确定相关的SNP分型是有重要意义的。
目前，基因多态性检测的方法主要有PCR-Sanger测序法、芯片杂交法、高分辨率溶解曲线法等。这些方法虽然都可以在一定程度上检测基因多态性，但都有不可忽视的局限性。Sanger测序法步骤较多，需要PCR后处理，不仅操作繁琐，还易产生污染，并不能满足临床的需求。芯片杂交法操作繁琐，其检测还依赖于昂贵的设备仪器，导致成本较高。高分辨率溶解曲线法对仪器要求高，需要具有安装高分辨率软件、温度比较敏感的机器才能使用，临床推广存在困难。基于Taqman水解探针的荧光定量PCR，利用Taq酶的外切酶活性，切断探针产生荧光信号，由于Taqman探针荧光基团与淬灭基团并不紧密靠近，导致荧光淬灭不彻底，存在背景荧光信号。此外，Taqman探针对于单碱基错配识别能力较差，极易生成非特异荧光信号，干扰结果判读，进而影响检测的准确性。因此，临床上迫切需要一种简便易行、灵敏度高、准确可靠的检测基因多态性的方法。
分子信标（Molecular Beacon）在空间结构上呈发夹型，由环状区和茎干区组成，环状区与靶DNA序列互补，长约15-35个核苷酸，茎杆区长约5-7个核苷酸，由GC含量较高的与靶序列无关的互补序列构成，分子信标的5′端标记荧光基团（F），3′端标记淬灭基团（Q）。对于分子信标来说，自由状态时，荧光基团与淬灭基团靠近（约为7-10nm）。此时发生荧光共振能量转移，使荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被淬灭，荧光本底极低。当分子信标的环状区与序列完全互补的靶DNA杂交形成双链杂交体时，分子信标茎杆区被拉开，荧光基团和淬灭基团距离增大。根据Foerster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比，因此，杂交后分子信标的荧光几乎100%恢复，且所检测到的荧光强度与溶液中靶DNA的量成正比（图1）。因此，理想的分子信标比Taqman水解探针更为高效。然而，由于分子信标中与靶序列无关的茎杆区的引入导致分子信标与模板序列之间常会产生一些非特异性相互作用，从而导致背景信号增强，进而影响检测效率。而要消除这种背景信号，就会对分子信标的设计尤其是茎杆区的序列设计产生很高的要求。此外，研究显示分子信标在环状区序列较短时，用于检测基因突变（包括单碱基的错配、缺失或插入突变）效果较好，但实际上，很多时候，由于特定靶序列区的GC含量较低，往往会导致环状区序列过长，从而影响检测效率。因此，得到一个理想的分子信标往往比较困难。
针对碱基的修饰改造也就是人工模拟的非天然核苷酸对的研究发展至今已有近40年的历史，这其中异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸（isoC-isoG）及其衍生物5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸（isoMeC-isoG）中的人工核苷酸对堪称经典。有关isoC-isoG中的核苷酸对的研究工作最早是由美国著名合成生物学家Benner SA开展的，其团队实现了异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸（isoC-isoG）的人工扩展核酸在体外的复制、转录乃至翻译的整个中心法则。如图2所示，isoC和isoG分别是天然核苷酸C和G的异构体，它们自身可以完美配对，但无法与天然核苷酸之间形成配对。
除了以上人工对碱基结构的改造，还有一大类基于对碱基糖环的改造的非天然核酸，如锁核酸（LNA）。LNA泛指含有一个或多个LNA单体（锁核苷酸）的寡核苷酸序列，是一类近年来迅速发展起来的并且已经在分子诊断、基因治疗等领域得到广泛应用的人工模拟核酸。如图3所示，LNA单体的戊糖环的2’-O和4’-C之间形成了一个亚甲基桥。LNA不改变天然核酸的碱基配对，但相对于天然核酸有着更强的亲和力以及更强的错配识别能力。