一种乳酸氧化酶生物电极的制备方法
阅读说明：本技术 一种乳酸氧化酶生物电极的制备方法 (Preparation method of lactate oxidase bioelectrode ) 是由 姜岷 马婕妤 周杰 董维亮 储振宇 金万勤 于 2020-06-09 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物工程技术领域,更具体地,本发明提供一种乳酸氧化酶生物电极的制备方法。本发明的第一方面提供一种乳酸氧化酶生物电极的制备方法,包括步骤：Pb电极的电化学氧化处理；利用固定化载体进对酶进行固定。本发明提供了一种乳酸氧化酶生物电极的制备方法,通过对Pb电极的电化学氧化处理以及对特定酶液的固定制备生物电极的方法解决了乳酸氧化酶固定化率低以及固定化材料生物相容性差的问题；实现了乳酸氧化酶生物电极的高效性和可重复性,是一种固定化效率高、生物相容性好的酶固定化技术。(The invention belongs to the technical field of bioengineering, and particularly provides a preparation method of a lactate oxidase bioelectrode. The first aspect of the invention provides a preparation method of a lactate oxidase bioelectrode, which comprises the following steps: electrochemical oxidation treatment of the Pb electrode; the enzyme is immobilized by using an immobilization carrier. The invention provides a preparation method of a lactate oxidase bioelectrode, which solves the problems of low immobilization rate of lactate oxidase and poor biocompatibility of immobilized materials by electrochemical oxidation treatment of a Pb electrode and a method for preparing the bioelectrode by immobilizing specific enzyme solution; realizes the high efficiency and repeatability of the lactate oxidase bioelectrode, and is an enzyme immobilization technology with high immobilization efficiency and good biocompatibility.)
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，更具体地，本发明提供一种乳酸氧化酶生物电极的制备方法。
背景技术
乳酸氧化酶是一种黄素蛋白，以氧作为底物，以FMN和FAD为辅因子,可将乳酸直接转化丙酮酸。FMN和FAD和酶蛋白结合牢固，不需要外源添加辅因子。利用乳酸氧化酶生产丙酮酸是工业上生产丙酮酸的重要手段之一。此外，当人体中出现大量乳酸且无法代谢时，将会出现乳酸酸中毒症状，所以乳酸氧化酶对于乳酸在人体中的检测具有重要的意义。
乳酸氧化酶作为一种常温酶，其稳定性差、易失活、不能重复使用，并且反应后混入产品，纯化困难，使其难以在检测中更为广泛的应用，所以需要一种优化的固定化方式提高其可利用性。
目前乳酸氧化酶常用的固定化方法有交联法、共价结合法微囊法、网格法、物理吸附法、结晶法、离子结合法等，但在生物电极的应用中一定程度上降低了酶反应活力和阻碍了酶电子传递，所以开发一种优化的乳酸氧化酶的固定化方法是十分必要的。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的第一方面提供一种乳酸氧化酶生物电极的制备方法，包括如下步骤：
(1)Pb电极的电化学氧化处理；
(2)利用固定化载体进对酶进行固定。
作为本发明的一种优选技术方案，Pb电极的电化学氧化处理包括步骤：
A1：Pb电极置于硝酸与重铬酸钾的混合溶液中，进行电化学氧化处理；
A2：利用循环伏安法扫描一圈，进行电化学氧化处理。
作为本发明的一种优选技术方案，硝酸的质量浓度为8～12％；重铬酸钾的质量浓度为1.5～3.5％。
作为本发明的一种优选技术方案，固定化载体选自戊二醛、壳聚糖、聚赖氨酸、全氟磺酸(Nafion)中的任一种或多种的组合；优选为壳聚糖。
作为本发明的一种优选技术方案，壳聚糖的体积浓度为0.25～1.50％，并置于3～6℃下保存。
作为本发明的一种优选技术方案，利用固定化载体进对酶进行固定的固定方式为：
C1：取酶液滴加滴定至步骤(1)所得电极表面，并于3～6℃下避光放置至干燥；
C2：将固定化载体滴加覆盖滴定在步骤C1所得电极表面，并于3～6℃下避光放置至干燥。
作为本发明的一种优选技术方案，酶液与固定化载体的体积比为1：(0.8～1.2)。
作为本发明的一种优选技术方案，酶液的制备方法包括：
B1：对解耶氏酵母菌进行全基因提取，设计一对引物对目的基因LOX的PCR扩增获得目的基因序列；
B2：利用同源重组的方法，利用一步克隆试剂盒，37℃水浴30min对步骤(1)所得目的基因与出发载体pET-28a(+)连接构建表达载体；
B3：用宿主菌E.coli BL21构建含有LOX基因的基因工程菌E.coli BL21，将构建好的LOX菌株接入LB摇瓶中，34～39℃培养2.5～4.5h，再加入50mM乳糖溶液，18～22℃培养22～26h，表达出乳酸氧化酶基因；
B4：采用镍离子柱对步骤B3中所得物质纯化，并浓缩获得LOX蛋白酶液。
本发明的第二方面提供一种根据所述乳酸氧化酶生物电极的制备方法制备得到的生物电极。
本发明的第三方面提供一种含有所述生物电极的乳酸氧化酶生物传感器。
有益效果：本发明提供了一种乳酸氧化酶生物电极的制备方法，通过对Pb电极的电化学氧化处理以及对特定酶液的固定制备生物电极的方法解决了乳酸氧化酶固定化率低以及固定化材料生物相容性差的问题；实现了乳酸氧化酶生物电极的高效性和可重复性，是一种固定化效率高、生物相容性好的酶固定化技术。
附图说明
图1:乳酸氧化酶的SDS-PAGE图；
图2:不同固定化载体对固定化乳酸氧化酶酶活影响图；
图3:不同固定化载体的固定化率对比曲线图；
图4:不同固化方式的固定化对比曲线图；
图5：酶在不同温度以及pH下的耐受性对比曲线图；
图6:乳酸氧化酶电极的重复性测试图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明提供技术方案中的技术特征作进一步清楚、完整的描述，并非对其保护范围的限制。
本发明中的词语“优选的”、“更优选的”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。
当本文中公开一个数值范围时，上述范围视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。例如，从“1至10”的指定范围应视为包括最小值1与最大值10之间的任何及所有的子范围。范围1至10的示例性子范围包括但不限于1至6.1、3.5至7.8、5.5至10等。
本发明主要通过提供一种乳酸氧化酶生物电极的制备方法以解决因为乳酸氧化酶稳定性差、易失活、不能重复使用而导致的乳酸氧化酶生物电极固定效率低，灵敏性较差的问题，提高乳酸氧化酶电极的高效性与可重复使用性。
本发明的第一方面提供一种乳酸氧化酶生物电极的制备方法，包括如下步骤：
(1)Pb电极的电化学氧化处理；
(2)利用固定化载体进对酶进行固定。
在一种实施方式中，Pb电极的电化学氧化处理包括步骤：
A1：Pb电极置于硝酸与重铬酸钾的混合溶液中，进行电化学氧化处理；
A2：利用循环伏安法扫描一圈，进行电化学氧化处理。
在一种实施方式中，硝酸的质量浓度为8～12％；重铬酸钾的质量浓度为1.5～3.5％；优选地，硝酸的质量浓度为9～11％；重铬酸钾的质量浓度为2.1～2.8％；更优选地，硝酸的质量浓度为10％；重铬酸钾的质量浓度为2.6％。
在一种实施方式中，硝酸与重铬酸钾的质量比为0.6～1；优选为0.7～0.9；更优选为0.82。
在一种实施方式中，固定化载体选自戊二醛、壳聚糖、聚赖氨酸、全氟磺酸(Nafion)中的任一种或多种的组合；优选为壳聚糖；进一步优选地，壳聚糖的体积浓度为0.25～1.5％；进一步优选地，壳聚糖的体积浓度为0.5～1.25％；进一步优选地，壳聚糖的体积浓度为0.75～1.25％；进一步优选地，壳聚糖的体积浓度为1.0～1.25％；更优选地，壳聚糖置于3～6℃下保存。
在一种实施方式中，利用固定化载体进对酶进行固定的固定方式为：
C1：取酶液滴加至步骤(1)所得电极表面，并于3～6℃下避光放置至干燥；
C2：将固定化载体覆盖滴加在步骤C1所得电极表面，并于3～6℃下避光放置至干燥。
在另一种实施方式中，利用固定化载体进对酶进行固定的固定方式为：取酶液与固定化载体混合，滴加至步骤(1)所得电极表面，并于4℃下避光放置至干燥。
一种实施方式中，酶液与固定化载体的体积比为1：(0.8～1.2)；优选地，酶液与固定化载体的体积比为1：(0.9～1.1)；更优选地，酶液与固定化载体的体积比为1：1。
在一种实施方式中，步骤C1中酶液为0.8～1.2U；优选为0.9～1.1U；更优选为1.0U。
在一种实施方式中，酶液的制备方法包括：
B1：对解耶氏酵母菌进行全基因提取，设计一对引物对目的基因LOX的PCR扩增获得目的基因序列；
B2：利用同源重组的方法，利用一步克隆试剂盒，37℃水浴30min对步骤(1)所得目的基因与出发载体pET-28a(+)连接构建表达载体；
B3：用宿主菌E.coli BL21(记为DE3)构建含有LOX基因的基因工程菌E.coliBL21(记为DE3-pET-LOX)，将构建好的LOX菌株接入LB摇瓶中，34～39℃培养2.5～4.5h，再加入50mM乳糖溶液，18～22℃培养22～26h，表达出乳酸氧化酶基因；
B4：采用镍离子柱对步骤B3中所得物质纯化，并浓缩获得LOX蛋白酶液。
优选地，酶液的制备方法包括：
B1：对解耶氏酵母菌进行全基因提取，设计一对引物对目的基因LOX的PCR扩增获得目的基因序列；
B2：利用同源重组的方法，利用一步克隆试剂盒，37℃水浴30min对步骤(1)所得目的基因与出发载体pET-28a(+)连接构建表达载体；
B3：用宿主菌E.coli BL21(记为DE3)构建含有LOX基因的基因工程菌E.coliBL21(记为DE3-pET-LOX)，将构建好的LOX菌株接入LB摇瓶中，37℃培养3.5h，再加入50mM乳糖溶液25μL，20℃培养24h，表达出乳酸氧化酶基因；
B4：采用镍离子柱对步骤B3中所得物质进行吸附，并通过超滤管浓缩获得LOX蛋白酶液。
本发明的第二方面提供一种根据所述乳酸氧化酶生物电极的制备方法制备得到的生物电极。
本发明的第三方面提供一种含有所述生物电极的乳酸氧化酶生物传感器。
实施例1
本发明的实施例1提供一种乳酸氧化酶，其制备方法如下：
B1：对解耶氏酵母菌进行全基因提取，设计一对引物对目的基因LOX的PCR扩增获得目的基因序列；
B2：利用同源重组的方法，利用一步克隆试剂盒，37℃水浴30min对步骤(1)所得目的基因与出发载体pET-28a(+)连接构建表达载体；
B3：用宿主菌E.coli BL21(DE3)构建含有LOX基因的基因工程菌E.coliBL21(DE3-pET-LOX)，将构建好的LOX菌株接入LB摇瓶中，37℃培养3.5h，再加入50mM乳糖溶液25μL，20℃培养24h，表达出乳酸氧化酶基因。再进行超声破碎，破碎所得上清液为破碎上清,所得沉淀为破碎沉淀；
B4：采用镍离子柱对步骤B3中所得物质进行吸附10Min，吸附后释放得到穿过液，再分别用50、100、200、250mM的咪唑溶液洗脱，得到对应浓度的洗脱液，并通过超滤管浓缩获得LOX蛋白酶液，即获得乳酸氧化酶浓缩液。
实施例2
本发明的实施例2提供了生物电极材料，其制备方法如下：
(1)Pb电极的电化学氧化处理；
A1：Pb电极置于硝酸与重铬酸钾的混合溶液中，进行电化学氧化处理；硝酸的质量浓度为10％；重铬酸钾的质量浓度为2.6％；硝酸与重铬酸钾的质量比为0.82；
A2：利用循环伏安法扫描一圈，进行电化学氧化处理；
(2)利用固定化载体进对酶进行固定，且固定方式为：
取1.0U的酶液与固定化载体混合，滴加至步骤(1)所得电极表面，并于4℃下避光放置至干燥；酶液与固定化载体的体积比为1：1；
所述酶液为实施例1所制备得到的乳酸氧化酶浓缩液；
固定化载体为戊二醛，戊二醛的体积浓度分别为0.25％，0.5％，0.75％，1％，1.25％。
实施例3
本发明的实施例3提供了生物电极材料，其制备方法如下：
(1)Pb电极的电化学氧化处理；
A1：Pb电极置于硝酸与重铬酸钾的混合溶液中，进行电化学氧化处理；硝酸的质量浓度为10％；重铬酸钾的质量浓度为2.6％；硝酸与重铬酸钾的质量比为0.82；
A2：利用循环伏安法扫描一圈，进行电化学氧化处理；
(2)利用固定化载体进对酶进行固定，且固定方式为：
取1.0U的酶液与固定化载体混合，滴加至步骤(1)所得电极表面，并于4℃下避光放置至干燥；酶液与固定化载体的体积比为1：1；
所述酶液为实施例1所制备得到的乳酸氧化酶浓缩液；
固定化载体为壳聚糖，壳聚糖的体积浓度分别为0.25％，0.5％，0.75％，1％，1.25％，其购自上海源叶生物科技有限公司。
实施例4
本发明的实施例4提供了生物电极材料，其制备方法如下：
(1)Pb电极的电化学氧化处理；
A1：Pb电极置于硝酸与重铬酸钾的混合溶液中，进行电化学氧化处理；硝酸的质量浓度为10％；重铬酸钾的质量浓度为2.6％；硝酸与重铬酸钾的质量比为0.82；
A2：利用循环伏安法扫描一圈，进行电化学氧化处理；
(2)利用固定化载体进对酶进行固定，且固定方式为：
取1.0U的酶液与固定化载体混合，滴加至步骤(1)所得电极表面，并于4℃下避光放置至干燥；酶液与固定化载体的体积比为1：1；
所述酶液为实施例1所制备得到的乳酸氧化酶浓缩液；
固定化载体为Nafion，Nafion的体积浓度分别为0.25％，0.5％，0.75％，1％，1.25％，其购自上海源叶生物科技有限公司。
实施例5
本发明的实施例5提供了生物电极材料，其制备方法如下：
(1)Pb电极的电化学氧化处理；
A1：Pb电极置于硝酸与重铬酸钾的混合溶液中，进行电化学氧化处理；硝酸的质量浓度为10％；重铬酸钾的质量浓度为2.6％；硝酸与重铬酸钾的质量比为0.82；
A2：利用循环伏安法扫描一圈，进行电化学氧化处理；
(2)利用固定化载体进对酶进行固定，且固定方式为：
取1.0U的酶液与固定化载体混合，滴加至步骤(1)所得电极表面，并于4℃下避光放置至干燥；酶液与固定化载体的体积比为1：1；
所述酶液为实施例1所制备得到的乳酸氧化酶浓缩液；
固定化载体为聚赖氨酸，聚赖氨酸的体积浓度分别为0.25％，0.5％，0.75％，1％，1.25％，其购自上海源叶生物科技有限公司。
实施例6
本发明的实施例6提供了生物电极材料，其制备方法如下：
(1)Pb电极的电化学氧化处理；
A1：Pb电极置于硝酸与重铬酸钾的混合溶液中，进行电化学氧化处理；硝酸的质量浓度为10％；重铬酸钾的质量浓度为2.6％；硝酸与重铬酸钾的质量比为0.82；
A2：利用循环伏安法扫描一圈，进行电化学氧化处理；
(2)利用固定化载体进对酶进行固定，且固定方式为：
C1：取1.0U的酶液滴加至步骤(1)所得电极表面，并于4℃下避光放置至干燥；
C2：将固定化载体覆盖滴加在步骤C1所得电极表面，并于4℃下避光放置至干燥；酶液与固定化载体的体积比为1：1；
所述酶液为实施例1所制备得到的乳酸氧化酶浓缩液；
固定化载体为壳聚糖，壳聚糖的体积浓度为1.25％，其购自上海源叶生物科技有限公司。
实施例7
本发明的实施例7提供了生物电极材料，其制备方法如下：
(1)Pb电极的电化学氧化处理；
A1：Pb电极置于硝酸与重铬酸钾的混合溶液中，进行电化学氧化处理；硝酸的质量浓度为10％；重铬酸钾的质量浓度为2.6％；硝酸与重铬酸钾的质量比为0.82；
A2：利用循环伏安法扫描一圈，进行电化学氧化处理；
(2)取1.0U的酶液滴加至步骤(1)所得电极表面，并于4℃下避光放置至干燥；所述酶液为实施例1所制备得到的乳酸氧化酶浓缩液。
性能评估
1.乳酸氧化酶的SDS-PAGE检测：对实施例1乳酸氧化酶制备过程中所得不同组分的进行SDS-PAGE检测，检测结果如图1所示，
2.不同固定化载体的生物相容性测试：取实施例2～实施例5的电极材料，然后用蒸馏水洗涤电极表面，测试酶活性；实验结果如图2所示，其中定义实施例1所得乳酸氧化酶浓缩液的活性为100％；1代表聚赖氨酸、2代表戊二醛、3代表壳聚糖、4代表Nafion；由实验结果可以看出壳聚糖和聚赖氨酸对乳酸氧化酶都有良好的固定效果。
3.不同固定化载体的固定化率实验：取实施例7所得电极材料、实施例3中壳聚糖体积浓度为1.25％对应的乳酸氧化酶电极以及实施例5中聚赖氨酸体积浓度为0.25％的乳酸氧化酶电极在PBS缓冲液中浸泡，保持室温25℃，固定间隔时间取出乳酸氧化酶电极进行测活,检测其酶活，按照实施例1所得乳酸氧化酶浓缩液的酶活为100％，剩余酶活比例计算其固定化率，测试结果如图3所示，其中1代表1.25％壳聚糖的测试结果、2代表0.25％聚赖氨酸的测试结果、3代表实施例7的测试结果，由实验结果可知，壳聚糖作为固定化载体对乳酸氧化酶进行固定所得乳酸氧化酶电极的固定率较高。
4.不同固化方式的固定化率实验：取实施例7所得电极材料、实施例3中壳聚糖体积浓度为1.25％对应的乳酸氧化酶电极以及实施例6中所得乳酸氧化酶电极，在PBS缓冲液中浸泡，保持室温25℃,固定间隔时间取出乳酸氧化酶电极进行测活，检测其酶活，按照实施例1所得乳酸氧化酶浓缩液的酶活为100％，剩余酶活比例计算其固定化率，测试结果如图3所示，其中1代表实施例3中1.25％壳聚糖的测试结果、2代表实施例7的测试结果、3代表实施例6的测试结果，由实验结果可知，本发明提供的固定方式对乳酸氧化酶进行固定所得乳酸氧化酶电极的固定率较高。
5.酶在不同温度以及pH下的耐受性测试：
(1)乳酸氧化酶的pH耐受性实验：取实施例6所得乳酸氧化酶电极及实施例1所得乳酸氧化酶浓缩液在37℃、pH值分别为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0的条件下保温2h，后取样于PH 6.5 25℃下测定乳酸氧化酶的残余相对活力，定义未处理的乳酸氧化酶活力为100％，测试结果如图5左图所示，1代表实施例6所得乳酸氧化酶电极、2代表实施例1所得乳酸氧化酶浓缩液；由实验结果可知本发明提供的乳酸氧化酶电极提高了乳酸氧化酶对pH的耐受性；
(2)乳酸氧化酶的温度耐受性实验：取实施例6所得乳酸氧化酶电极及实施例1所得乳酸氧化酶浓缩液置于不同温度(15℃，25℃，35℃，45℃，55℃)的水浴锅中保温2h，后取样于PH 6.5 25℃下测定乳酸氧化酶的残余相对活力，按照实施例1所得乳酸氧化酶浓缩液的酶活为100％，其相对活力如图5右图所示，1代表实施例6所得乳酸氧化酶电极、2代表实施例1所得乳酸氧化酶浓缩液；由实验结果可知本发明提供的乳酸氧化酶电极提高了乳酸氧化酶对温度的耐受性。
6.乳酸氧化酶电极的重复性测试：
(1)取实施例6所得乳酸氧化酶电极接入电化学工作站扫描IT图，待基线平稳后加入0.1mM的乳酸溶液，检测其响应电流；
(2)重复(1)所述实验，记录每次响应电流数值，按照第一次响应电流为100％计算相对电流响应，检测其重复性，实验结果如图6所示，由实验结果可知，本发明提供的乳酸氧化酶电极有效提高了乳酸氧化酶生物传感器电极的固定化率和使用重复次数，对后续生物传感器的开发与应用具有重要的指导意义。
前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。