用于采用电化学生物传感器进行分析物检测的方法和设备
阅读说明：本技术 用于采用电化学生物传感器进行分析物检测的方法和设备 (Method and apparatus for analyte detection using an electrochemical biosensor ) 是由 S·M·奥贾 B·费尔德曼 于 2018-06-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种用于利用具有工作电极的传感器感测分析物的方法,该方法包括向工作电极提供分析物特异性酶和氧化还原介体,向所述分析物提供所述工作电极,使源自与所述分析物特异性酶和所述氧化还原介体反应的所述分析物的电荷累积达设定的时间段,在所述设定的时间段之后将所述工作电极连接至电路,和测量来自所累积的电荷的信号。(The invention relates to a method for sensing an analyte with a sensor having a working electrode, the method comprising providing an analyte-specific enzyme and a redox mediator to the working electrode, providing the working electrode to the analyte, accumulating charge derived from the analyte reacting with the analyte-specific enzyme and the redox mediator for a set period of time, connecting the working electrode to an electrical circuit after the set period of time, and measuring a signal from the accumulated charge.)
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2018年6月29日提交的美国专利申请系列No.16/024,353；2017年6月30日提交的美国临时专利申请系列No.62/527,981；2017年8月11日提交的美国临时专利申请系列No.62/544,692；和2017年8月14日提交的美国临时专利申请系列No.62/545,252的权益，通过引用明确地将所有申请的全部内容并入本文。
关于联邦政府资助研究或开发的声明
本发明是在由国防威胁降低局(Defense Threat Reduction Agency)授予的No.HDTRA-1-16-C-0048合同下由政府支持完成的。政府拥有本发明的一定权利。
技术领域
本发明的实施方案涉及采用电化学酶生物传感器的分析物感测。例如，本发明的实施方案涉及一种方法和一种酶生物传感器，其通过允许分析物在生物传感器上累积以允许检测低浓度的分析物。
背景技术
已经开发并使用了酶生物传感器，此类酶生物传感器利用与转换器相关的酶作为用于目标分析物的生物识别元件。尽管已使用了许多不同的信号转换方法，但最常用的是电化学方法。电化学生物传感器允许将生物事件(例如，分析物检测)直接转换为电信号，从而消除了对复杂仪器的需求，由此在尺寸、成本和便携性方面使电化学生物传感器具有所期望的特征。在用于信号转换的电化学技术中，经常使用安培法(amperometry)。在安培测量中，传感器的工作电极在测量流经传感器的电流时保持在恒定电位(电压)下。将该类传感器设计为使得电流取决于分析物浓度。
利用安培法的酶生物传感器的实例是连续葡萄糖传感器，其是一种设计为向用户提供频繁的血糖浓度测量的可穿戴的体内装置。这些装置将固定在工作电极上的葡萄糖氧化还原酶(例如葡萄糖氧化酶(GOx))用作葡萄糖感测元件。电子首先经由酶氧化从葡萄糖传递到酶，然后通过氧化还原介体(例如氧气(O2)或含锇(Os)的氧化还原聚合物)传递到工作电极。尽管已证明安培法可用于测量分析物，比如以相对较高生理浓度(等于或高于5毫摩尔(mM))存在的葡萄糖，但它可能不适用于测量以较低浓度存在的分析物。
发明内容
本发明的实施方案的方面旨在通过允许分析物在酶生物传感器上累积以进行低浓度(如等于或低于5mM、1纳摩尔(nM)至5mM或4.7nM至5mM)分析物的检测。
在本发明的一些实施方案中，一种用于利用具有工作电极的传感器感测分析物的方法，其中所述方法包括：向所述工作电极提供分析物特异性酶和氧化还原介体，向所述分析物提供所述工作电极，使源自与所述分析物特异性酶和所述氧化还原介体反应的所述分析物的电荷累积达设定的时间段，在所述设定的时间段之后将所述工作电极连接至电路，和测量来自所累积的电荷的信号。
在本发明的一些实施方案中，在向分析物提供所述工作电极之前，所述方法包括将所述工作电极连接至所述电路，和在向所述分析物提供所述工作电极之前，所述方法包括将所述工作电极与所述电路断开。
在本发明的一些实施方案中，在向所述分析物提供所述工作电极之前将所述工作电极连接至所述电路，和所述方法包括在向所述分析物提供所述工作电极之前将所述工作电极与所述电路断开。
在本发明的一些实施方案中，所述传感器是酶电化学生物传感器。
在本发明的一些实施方案中，所述氧化还原介体是固定的氧化还原聚合物。
在本发明的一些实施方案中，所述固定的氧化还原聚合物包括氧化还原物质(redox species)和聚合物，所述氧化还原物质选自含锇(Os)、钌(Ru)、铁(Fe)或钴(Co)的聚合物，和所述聚合物选自聚(乙烯基吡啶)、聚(噻吩)、聚(苯胺)、聚(吡咯)或聚(乙炔)。
在本发明的一些实施方案中，所述固定的氧化还原聚合物为含Os的聚(乙烯基吡啶)。
在本发明的一些实施方案中，所述分析物选自皮质醇、葡萄糖、乳酸、3-羟基丁酸酯、醇、丙酮酸、谷氨酸、茶碱或肌酸酐。
在本发明的一些实施方案中，所述分析物特异性酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖性脱氢酶、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖性氧化酶和/或黄素单核苷酸(FMN)依赖性氧化酶。
在本发明的一些实施方案中，分析物特异性酶选自11β-羟基类固醇脱氢酶2型(11β-HSD-2)、葡萄糖氧化酶、NAD-葡萄糖脱氢酶、FAD-葡萄糖脱氢酶、乳酸氧化酶、NAD-乳酸脱氢酶、NAD-醇脱氢酶、丙酮酸氧化酶、NAD-谷氨酸脱氢酶或黄嘌呤氧化酶。
在本发明的一些实施方案中，所述累积电荷包括累积电子。
在本发明的一些实施方案中，将所述传感器皮下地放置在受试者体内。
在本发明的一些实施方案中，所述分析物的浓度低至4.7纳摩尔(nM)。
在本发明的一些实施方案中，所述设定的时间段的范围为60秒至30分钟。在一些实施方案中，所述设定的时间段的范围为120秒至30分钟。在一些实施方案中，所述设定的时间段的范围为120秒至10分钟。
在本发明的一些实施方案中，所述传感器包括外膜。在一些实施方案中，所述外膜为通量限制膜。在一些实施方案中，所述外膜为分析物可渗透膜。
在本发明的一些实施方案中，所述测量来自所累积的电荷的信号包括测量所述信号的峰高和/或测量所述信号的峰面积。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括校准所测得的峰高以提供所述分析物的浓度。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括校准所测得的峰面积以提供所述分析物的浓度。
在一些实施方案中，所述测量来自所累积的电荷的信号包括以0.1至0.5赫兹(Hz)的采样率记录所述信号和/或以0.032到3.2赫兹(Hz)的频率过滤所述信号。
在本发明的一些实施方案中，所述工作电极包括含有所述分析物特异性酶和所述氧化还原介体的感测元件。在一些实施方案中，所述感测元件还包括碳纳米管。
在一些实施方案中，一种用于利用传感器感测分析物的方法，所述传感器包括含有分析物特异性酶和氧化还原介体的工作电极，所述方法包括：向所述分析物提供所述工作电极；使源自与所述分析物特异性酶和所述氧化还原介体反应的所述分析物的电荷累积；和测量来自所累积的电荷的信号，其通过测量所述信号的峰高和/或测量所述信号的峰面积进行。
在本发明的一些实施方案中，一种用于感测分析物的系统，所述系统包括：工作电极；布置在所述工作电极上的感测元件，所述感测元件包括分析物特异性酶和氧化还原介体，所述感测元件被配置为使源自与所述分析物特异性酶反应的所述分析物的电荷累积达设定的时间段；和电路，所述电路被其配置为在所述设定的时间段之后与所述工作电极连接并测量来自所累积的电荷的信号。在一些实施方案中，该系统的所述感测元件包括碳纳米管。在一些实施方案中，该系统还包括至少覆盖所述感测元件的外膜。在一些实施方案中，该系统的所述分析物特异性酶选自烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖性脱氢酶、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖性氧化酶或黄素单核苷酸(FMN)依赖性氧化酶。例如，在一些实施方案中，该系统的所述分析物特异性酶选自11β-羟基类固醇脱氢酶2型(11β-HSD-2)、葡萄糖氧化酶、NAD-葡萄糖脱氢酶、FAD-葡萄糖脱氢酶、乳酸氧化酶、NAD-乳酸脱氢酶、NAD-醇脱氢酶、丙酮酸氧化酶、NAD-谷氨酸脱氢酶和黄嘌呤氧化酶。
附图说明
图1为描述根据本发明的实施方案的用于累积模式感测的方法的流程图，该方法包括如图所示的动作10、15、20、25和30。
图2示出了根据本发明的实施方案的用于累积模式感测的电极设置的示意图，其中当如左侧小图中所示电路连接时，工作电极处于足以驱动稳态条件下分析物的氧化还原反应的电位(电压)，和当如右侧小图所示电路断开时，工作电极与电路电断开，以使源自分析物的电子能够存储在氧化还原聚合物中直至工作电极与电路重新连接并可以测量存储的电荷。
图3A示出了根据本发明的实施方案的所预期的电流相对于(versus,vs.)时间信号和累积模式感测的若干定量参数(如图所示的分别为电路断开时的累积时间、峰面积和峰高)。
图3B示出了根据本发明的实施方案，采用与锇氧化还原聚合物(Os3+)共固定的氧化酶(AOx)在可氧化分析物(分析物A)的累积模式感测期间(如图所示当电路按照“断开电路”的描述断开时)发生的氧化还原反应的示意图。
图3C示出了根据本发明的实施方案，采用示例性葡萄糖传感器(处于+40mV，如阴影线所示)对2μM葡萄糖进行累积模式感测(如白色所示)获得的电流相对于(vs.)时间的轨迹，并测量了5个不同的累积时间。
图3D示出了根据本发明的实施方案，安培法和通过如图3C所示的累积时间的峰高或峰面积测量的累积模式信号的校准曲线。
图4A示出了根据本发明的实施方案，校准实验的代表性电流相对于(vs.)时间的轨迹，该校准实验采用累积模式感测和示例性葡萄糖传感器(处于+40mV，如阴影线所示，和60秒累积时间(如白色所示当电路断开时))进行每次检测。
图4B示出了根据本发明的实施方案，由安培法和通过如图4A所示的感测实验测量的累积模式信号得到的校准曲线的比较。
图5示出了根据本发明的实施方案，在0、50、100、200和500μM的血糖浓度下在如图所示的1(菱形)、2(三角形)、5(正方形)和10(圆形)分钟累积时间时的安培和累积模式感测(峰高和峰面积)的校准曲线，其中每条校准曲线代表四个传感器的平均响应。
图6A示出了根据本发明的实施方案，采用开路电位法感测如图所示的各种纳摩尔(nM)浓度的葡萄糖所获得的模式葡萄糖传感器的电位相对于时间信号的关系图。
图6B示出了根据本发明的实施方案，图6A的图形数据的校准曲线(斜率相对于葡萄糖浓度(nM))。
图6C示出了根据本发明的实施方案，采用开路电位法感测如图所示的各种nM浓度的葡萄糖获得的模式葡萄糖传感器的电位相对于时间信号的图。
图6D示出了根据本发明的实施方案，图6C的图形数据的校准曲线(斜率相对于葡萄糖浓度(nM))。
图6E示出了根据本发明的实施方案，采用开路电位法在体外感测葡萄糖的模式葡萄糖传感器(实心圆数据点，n＝8)和对照传感器(空心圆数据点，n＝4)的复合校准曲线。
图6F示出了根据本发明的实施方案，图6E中0至200nM葡萄糖的校准曲线的放大图。
图6G示出了根据本发明的实施方案，采用具有模式葡萄糖传感器作为工作电极和对照传感器(具有氧化还原聚合物但不具有葡萄糖氧化酶)作为参考电极的开路电位法获得的模式葡萄糖传感器的电位相对于时间信号的图，所述模式葡萄糖传感器用于感测如图所示的各种nM浓度的葡萄糖。
图6H示出了根据本发明的实施方案，图6G的图形数据的校准曲线(斜率相对于葡萄糖浓度(nM))。
图7示出了根据本发明的实施方案，在不同过滤频率下的累积模式信号形状的比较，其中实线示出的为3.2Hz，虚线示出的为0.032Hz。
图8A示出了根据本发明的实施方案，两个沉积的具有(右侧小图)和不具有(左侧小图)碳纳米管CNT的葡萄糖感测试剂的显微照片。
图8B示出了根据本发明的实施方案，采用不同的过滤频率(0.032Hz以圆形示出，3.2Hz以三角形示出)和具有和不具有CNT的感测试剂的安培和累积模式检测(峰高和峰面积)的校准曲线。
图9A示出了根据本发明的实施方案，在使用0至200nM的葡萄糖浓度的校准实验期间由代表性葡萄糖传感器获得的累积模式信号，每次检测采用30分钟的累积时间，信号以3.2Hz过滤，并且将CNT添加到感测试剂中。
图9B示出了根据本发明的实施方案，由针对图8A所示的感测实验测量的安培法和累积模式信号得到的具有相应线性拟合的校准曲线，每个信号是8个传感器的扣除背景的平均值，误差线代表标准偏差，和图的底部是示出0至50nM的葡萄糖浓度的放大图。
图10A示出了根据本发明的实施方案，在大气开放(粗线)和氧气清除(细线)缓冲溶液的背景条件([葡萄糖]＝0)下，代表性葡萄糖传感器的累积模式信号。
图10B示出了根据本发明的实施方案，来自图10A所示的实验的背景安培法和累积模式信号的概述，其中信号为4个传感器的平均值(平均数)，和氧气清除数据以实心圆示出和大气数据以空心圆示出。
图11示出了根据本发明的实施方案，在采用0至200μM的葡萄糖浓度的感测实验期间针对安培法和累积模式感测(峰高和峰面积)获得的校准曲线，其中线性线条以线性最佳拟合线示出，所述线性最佳拟合线从0到200nM浓度获得并预测从较高浓度获得，每个信号均是8个传感器的平均值。
图12示出了根据本发明的实施方案的分析物传感器的示意图。
图13为描绘与本发明的一个或多个实施方案相容的分析物传感器的一部分的截面图。
图14A示出了与本发明的一个或多个实施方案相容的可植入分析物传感器的平面图。
图14B为描绘与本发明的一个或多个实施方案相容的任何具有膜的分析物传感器的一部分的截面图。
图14C示出了根据本发明的实施方案，具有覆盖的外膜的感测层、工作电极和基板的特写视图。
图14D为根据本发明的实施方案，描绘工作电极上分析物与分析物特异性酶和氧化还原介体的氧化还原反应的示意图。
图15为根据本发明的实施方案的分析物监测系统的实施方案的框图。
图16为根据本发明的实施方案，图15的分析物监测系统的读取器装置的实施方案的框图。
图17为根据本发明的实施方案，图15的分析物监测系统的传感器控制装置的实施方案的框图。
具体实施方式
本发明的实施方案提供一种采用电化学传感器测量体外和体内低纳摩尔浓度的分析物的电化学测量方法。本发明的实施方案包括电化学传感器，比如经改进用于测量低纳摩尔浓度的分析物的酶生物传感器。
在提供了数值范围的情况下，应当理解，所述范围的上限和下限之间的每个中间值(至该下限的单位的十分之一，除非上下文另外明确指示)也被明确公开。任何所述值或所述范围内的中间值与任何其他的所述值或所述范围内的中间值之间的每个更小范围都包括在本发明中。这些更小范围的上限和下限可被独立地包括在范围中或被排除在所述范围外，且其中任一限值、无一限值或两个限值都包括在更小范围中的每个范围也包括在本发明中，这取决于所述范围中任何明确排除的限值。在所述范围包括一个或两个限值的情况下，排除这些所包括的限值中的任一个或两个的范围也包括在本发明中。
如本文所用，术语“基本上”、“约”以及相似术语是用作近似的术语而不作为程度的术语，并意图说明会被本领域普通技术人员所认可的测量值或计算值的固有的偏差。
在本文所公开的描述中，也应理解，除非含蓄或明确地理解或以其它方式陈述，否则以单数形式出现的词语包括它的复数对应物，而以复数形式出现的词语也包括它的单数对应物。仅举例说明，除非含蓄或明确地理解或以其它方式陈述，否则提及“一个”或“该”“分析物”包括单一分析物以及两个或更多个不同分析物的组合和/或混合物，提及“一个”或“该”“浓度值”包括单一浓度值以及两个或更多个浓度值，等等。另外，也应理解，除非含蓄或明确地理解或以其它方式陈述，否则对于本文所述的任何给定组件，任何列出的所述组件的可能候选或替代物可通常个别地使用或互相组合使用。另外，也应理解，除非含蓄或明确地理解或以其它方式陈述，否则这些候选或替代物的任何清单都只是说明性而不是限制性的。
如本文所用，术语“测量(measure/measuring/measured)”可涵盖术语“测定(determine/determining/determined)”和“计算(calculate/calculating/calculated)”中相应的一个的含义。
如本文所用，“电化学传感器”是一种被配置成通过在传感器上的电化学氧化和还原反应来检测样本中的分析物的存在和/或测量其水平的装置。这些反应被转换成可与样本中的分析物的量、浓度或水平相关的电信号。
如本文所用，“工作电极”是这样一种电极，在具有或没有电子转移剂作用下在该电极处分析物(或第二化合物，其水平依赖于分析物的水平)被电氧化或电还原。
如本文所用，“对电极”指的是与工作电极成对的电极，通过“对电极”的电流与通过工作电极的电流幅值相等但符号相反。在本发明的实施方案的上下文中，除非另有明确指示，术语“对电极”包括a)对电极和b)也用作参考电极的对电极(即，对/参考电极)。
如本文所用，除非另有明确指示，术语“参考电极”包括a)参考电极和b)也用作对电极的参考电极(即，对/参考电极)。
如本文所用，“电解”是指直接在电极处或者经由一个或多个电子转移剂发生的化合物的电氧化或电还原。
如本文所用，例如，当组分被捕获在或共价地、离子地或协调地结合到传感器的组成成分上和/或捕获在聚合物或溶胶-凝胶基质或不能移动的膜上时，该组分被“固定”在传感器内。
如本文所用，“电子转移剂”是直接地或与其他电子转移剂配合地在分析物和工作电极之间携带电子的化合物。电子转移剂的一个实例是氧化还原介体。
如本文所用，“氧化还原介体”是用于直接地或经由一种或多种另外的电子转移剂在分析物、还原分析物或氧化分析物的酶与电极之间携带电子的电子转移剂。包括聚合的主链的氧化还原介体还可以被称为“氧化还原聚合物”。
如本文所用，术语“前体聚合物”是指在连接各种改性基团以形成改性聚合物之前的起始聚合物。
如本文所用，“感测层”是传感器的部件，其包括促进分析物电解的组成成分。感测层可包括的组成成分诸如电子转移剂(如氧化还原介体或氧化还原聚合物)、催化分析物反应以在工作电极处产生响应的催化剂(如分析物特异性酶)，或同时包括电子转移剂和催化剂。在本发明的一些实施方案中，传感器包括不可浸出地布置在工作电极附近或其上的感测层。
如本文所用，“感测元件”是与感测层一起布置的分析物特异性酶的应用或区域。由此，感测元件能够与分析物相互作用。感测层可具有一个以上的感测元件，这些感测元件构成布置在工作电极上的分析物检测区域。在一些实施方案中，感测元件包括分析物特异性酶和电子转移剂(例如，氧化还原介体)。在一些实施方案中，感测元件包括分析物特异性酶、电子转移剂和交联剂。
如本文所用，“不可浸出的”或“不可释放的”化合物或“不可浸出地布置的”化合物意指，定义一种化合物，该化合物附着在传感器上使得其在传感器使用期间(例如，在传感器植入病人体内或测量样本期间)基本上不从工作电极的感测层弥散开来。
如本文所用，“交联剂”为包含至少两个反应性基团的分子，所述反应性基团能够将至少两个分子连接在一起或将同一分子的至少两个部分连接在一起。至少两个分子的连接称为分子间交联，而同一分子的至少两个部分的连接称为分子内交联。具有两个以上反应性基团的交联剂可能够同时进行分子间和分子内交联。
“膜溶液”为含有用于交联和形成膜的所有必需组分的溶液，所述溶液包括含有杂环氮基的改性聚合物、交联剂和缓冲剂或醇-缓冲剂混合溶剂。
如本文所用，“生物流体(biological fluid/biofluid)”为可以测量其中的分析物的任何体液或体液衍生物，例如血液、间质液、血浆、皮液、汗液和泪液。
如本文所用，“累积模式感测”是指由分析物的氧化产生的电子的累积，该氧化发生在未连接至电路的工作电极的感测元件处或其上，由此产生电子累积。
累积模式感测
参考图1的方法流程图，本发明的一些实施方案包括一种用于采用传感器从分析物获得信号的方法，所述传感器包括工作电极和另一电极(如对和/或参考电极)，其中所述工作电极配有催化剂(比如分析物特异性酶)和电子转移剂(如氧化还原介体)或被其修饰(10)。工作电极的被分析物特异性酶和氧化还原介体修饰的区域可称为感测元件或工作电极的感测层。如图1所示，向已经提供了分析物特异性酶(如被分析物特异性酶修饰)的工作电极提供(15)分析物。在分析物存在下，被修饰的工作电极氧化分析物并将氧化量测量为从该反应产生的电荷量。只要工作电极未与另一电极连接，则来自氧化还原反应的电荷将在工作电极上持续累积(20)。对于体内低浓度的分析物(如皮质醇)，将电荷(电子)累积达设定的时间段允许低浓度分析物产生相比于其他已知方法而言易于测量和量化的信号输出。在设定时间段(如高达120秒、高达3分钟、高达5分钟、高达10分钟、高达15分钟、高达20分钟、高达25分钟或高达30分钟)的电荷累积之后，将所述工作电极与至少一个另一电极(比如对电极和/或参考电极)连接(25)以形成电路。一旦电路形成，所述工作电极上累积的电子释放为电信号，对该电信号的幅值进行测量(30)，并将其与工作电极处存在的分析物的量关联。由此，按照图1的动作10、15、20、25和30所描绘的根据本发明的实施方案的方法，可以容易地检测并测量低浓度(如低至4.7nM的纳摩尔量)的分析物。
参考图2，示出了根据本发明的实施方案用于累积模式感测的具有工作电极40、参考电极50和对电极60的三个电极设置的实例，其中当电路70如左侧小图所示连接时，所述工作电极处于足以驱动稳态条件下分析物的氧化还原反应的电位(电压)。例如，对于本文所用的示例性葡萄糖传感器，所述足以驱动所述氧化还原反应的电位(电压)为+40mVvs.Ag/AgCl。当电路70如右侧小图所示未连接时，所述工作电极40与电路70电断开，从而使来自分析物的电荷(如电子)能够存储在氧化还原聚合物中直至工作电极40与电路70重新连接并测量存储的电荷。
参考图3A和3B，在累积模式的概念概述中描绘了电化学酶生物传感器的一个实例。在该实例中，分析物(A)的感测依赖于氧化还原酶(AOx)通过氧化还原聚合物电“连接”至传感器的工作电极。在常规的安培感测中，电极所处的电位(电压)使得分析物以恒定速率反应，该速率与分析物浓度成比例。如图3B所示，对于分析物氧化反应(A至A+)，电子将以恒定速率从分析物(A)至分析物特异性酶(AOx)至氧化还原聚合物(如Os3+)至所述工作电极流动，产生如图3A所示的稳态电流。如果工作电极与电路断开，则电子从氧化还原聚合物至所述工作电极的流动将停止，导致无电流流经电路。然而，分析物仍将经历酶氧化，进而导致氧化还原聚合物的还原(Os3+至Os2+)。这导致由于来自分析物的电子(e-)存储在氧化还原聚合物中，还原形式的氧化还原聚合物(Os2+)随着时间流逝而积聚(以Os2+的“云”表示)。当所述工作电极重新连接至电路以使得其处于其初始电位(电压)时，所积聚的还原形式的氧化还原聚合物将被氧化，从而导致如图3A所示的大的电流尖峰(spike)。随后，当氧化还原系统再次达到稳态时，电流将衰减回初始的安培电流。此两步过程构成了累积模式感测的基础：其中一个是传感器的工作电极与电路断开或未连接至电路达设定的时间段(也称为累积时间)，从而使来自分析物的电荷能够在氧化还原聚合物中“累积”，和第二个是在所述累积时间之后将传感器的工作电极连接至电路，从而使累积的电荷放电并测量为尖峰。
参考图3C和3D，采用由沉积在丝网印刷碳电极上的葡萄糖特异性感测试剂组成的已开发的葡萄糖传感器展示了累积模式感测的实例。葡萄糖感测试剂由与Os-氧化还原聚合物交联的葡萄糖氧化酶组成。已证明该试剂可用于葡萄糖生物燃料电池以及自供电和恒电位仪供电的连续葡萄糖传感器。参见如Mao等，J.Am.Chem.Soc.2003,125:4951-4957；Mano等，J.Am.Chem.Soc.2003,125:6588-6594；Liu等，Anal.Chem.2012,84:3403-3409；Feldman等，Diabetes Technol.Ther.2003,5:769-779；Hoss等，J.DiabetesSci.Technol.2013,7:1210-1219；和Hoss等，J.Diabetes Sci.Technol.2014,8:89-94，所有上述文献中的全部内容均通过引用并入本文。在本发明的一些实施方案中，可将累积模式感测的方法用于增加电化学测量的灵敏度。对于图3C和图3D所示的实验，将葡萄糖传感器放置在2μM葡萄糖和100mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)的溶液中，然后在监测传感器电流的同时进行了几种累积模式的测量。对于每次测量，首先将传感器置于+40mV电压下以驱动稳态葡萄糖氧化，然后使工作电极处于电断开达设定的时间段(累积时间)以允许电荷累积，然后将工作电极重新连接以测量累积的电荷。如图所示，氧化电流尖峰的大小随着累积时间的增加而增加。因此，通过简单地使累积时间增加(如，长达30秒、60秒或长达120秒)，采用该葡萄糖传感器和葡萄糖浓度的测量的灵敏度增加。在图3D中，将测量为稳态传感器电流的安培信号以及在图3C中测量的电流尖峰的峰高和峰面积相对于累积时间作图。如图所示，安培电流不依赖于累积时间并保持恒定。然而，电流尖峰的高度和面积均显示出对累积时间的线性依赖，这凸显了累积模式感测相对于传统安培法的优势。即，可以通过改变测量技术中可容易调整的参数，例如累积电荷的时间段，来调整传感器的灵敏度。
根据本发明的实施方案，所述累积模式感测方法提供了一种在一定分析物浓度范围内的信号。图4A和4B示出了采用示例性葡萄糖传感器测量高达100μM葡萄糖浓度的校准实验的实例。如图所示，每次检测采用60秒的累积时间。图4A示出了该实验得到的电流相对于时间的轨迹。如图所示，稳态安培电流和累积模式电流峰的大小均随葡萄糖浓度的增加而增加。图4B示出了作为葡萄糖浓度函数的安培电流和电流尖峰的峰高和峰面积的图，其中全部三种信号均显示出对分析物浓度的线性依赖。因此，结果表明，无论是采用峰高还是采用峰面积测量的，累积模式感测均得到线性校准曲线，并由此其可以以类似于传统安培法的方式以增加的灵敏度来感测。因此，由于从累积模式感测获得的峰高是以电流单位测量的，因此可以将该测量方法的灵敏度与安培法的灵敏度进行定量比较。例如，可以通过比较校准曲线的斜率(比如图4B中所示的斜率)来完成测量方法的灵敏度。通过比较，安培法具有0.44nA/μM的灵敏度，而(采用峰高测量的)累积模式感测具有1.69nA/μM的灵敏度。因此，与安培法相比，通过60秒的累积时间，根据本发明的实施方案的累积模式感测使电化学测量的灵敏度增加了约4倍。
此外，由于峰高和峰面积均提供相同的结果和灵敏度，因此，在本发明的一些实施方案中，测量工作电极的所得电流信号的手段包括计算所述峰高和/或峰面积。
在本发明的一些实施方案中，采用具有外膜的传感器实施累积模式感测。由于电化学传感器经常涂布外膜(如聚合物膜)以便为感测试剂提供稳定性、大量转运限制、生物相容性和/或防止电极结垢，由此测试了涂布聚合物的传感器以确保累积模式感测按预期执行。参照图5，将涂布了通量限制性聚合物外膜的示例性葡萄糖传感器用于在0、50、100、200和500μM的葡萄糖浓度下通过安培法和累积模式感测获得校准曲线。如图5中的数据点所示，分别使用1、2、5和10分钟的不同累积时间在每个葡萄糖浓度下进行了四个连续测量。
如图5中所示，安培法(左侧小图)和累积模式测量(中间和右侧小图)均对分析物浓度产生线性响应。如所预期的，采用安培法(图5的左侧小图)，所述传感器的灵敏度与累积时间无关。然而，采用累积模式感测(图5的中间和右侧小图)，传感器的灵敏度随累积时间的增加而增加。由于通量限制性外膜，采用安培和累积模式感测的传感器的灵敏度均比无外膜的传感器要小的多。这是预料之中的，因为外膜限制了分析物向感测试剂的扩散。然而，如图5所示，当将聚合物外膜添加至传感器时，累积模式感测如所预期的执行并且给出另一个如何通过改变累积时间来调整传感器的灵敏度的实例。此外，应当注意，将大于10分钟的设定的时间段用于采用具有连续监测传感器的累积模式感测的电荷累积，可能会对传感器的时间分辨率造成负面影响。因此，在本发明的一些实施方案中，采用具有外膜的传感器实施累积模式感测，其中用于电荷累积的设定的时间段最长10分钟。
进一步注意到，虽然在测量低浓度的分析物时可能不需要外膜(比如通量限制性外膜)来防止电极结垢，但是外膜可提供与体内环境的生物相容性界面和/或向下面的包括电子转移剂和/或分析物特异性酶的感测层提供稳定性。对于其中采用了外膜的累积模式感测，用于累积电荷的设定的时间段可能会增加以允许总分析物浓度的氧化。在本发明的一些实施方案中，采用具有外膜的传感器的累积模式感测的方法包括将用于累积电荷的设定的时间段增加至长达1分钟、长达2分钟、长达3分钟、长达4分钟、长达5分钟、长达6分钟、长达7分钟、长达8分钟、长达9分钟或长达10分钟，以便允许工作电极处存在的全部分析物完全反应。在本发明的一些实施方案中，采用具有外膜的传感器的累积模式感测的方法包括将用于累积电荷的设定的时间段从10分钟增加至30分钟。
可选地，在本发明的一些实施方案中，外膜可以由高渗透性的材料制成，由此，在渗透性膜不会使分析物到达工作电极的感测层的速率减弱的同时，该渗透膜允许稳定性、大量转运限制和/或生物相容性。高渗透性膜材料的非限制行实例包括与高分子量(MW≥400g/mol)聚(乙二醇)二缩水甘油醚交联的聚(乙烯基吡啶)、与高分子量(MW≥400g/mol)聚(乙二醇)二缩水甘油醚交联的衍生的聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯醇)、聚(丙烯酸)和聚(甲基丙烯酸)。
参考图6A-6B，将电化学葡萄糖传感器用于体外实验中以测量(如感测)范围为0至1000纳摩尔(nM)葡萄糖的葡萄糖浓度。在该实施例中，所述传感器的工作电极包括葡萄糖氧化酶，其与沉积并固定在丝网印刷碳电极上的基于Os的氧化还原聚合物交联。该实验如本文所公开的(如实施例8)实施。另外，使用了丝网印刷碳对电极和Ag/AgCl参考电极。在每次测量前，使工作电极保持在相对于(vs.)Ag/AgCl的+40mV下达3分钟，在该时间点后测量电极的开路电位达3分钟。图6A中的图示出了所示(从0至100nM葡萄糖)的葡萄糖浓度的所得电位相对于时间的轨迹。因此，如图所示，更高的葡萄糖浓度导致更大幅度的电位漂移率。在本发明的一些实施方案中，所述漂移率计算为电位相对于时间的轨迹的斜率。图6B为校准曲线，其示出了所述漂移率(计算为从30至180秒的斜率)相对于葡萄糖浓度的图。如图6B所示，所述电位漂移率示出了对葡萄糖浓度的线性依赖。
参考图6C-6D，将在图6A-6B的实验中使用的相同的电化学葡萄糖传感器用于体外实验中，以测量范围为0至750nM(包括低于100nM的葡萄糖浓度(如10nM、25nM和50nM))葡萄糖的葡萄糖浓度。图6C中的图显示了图示葡萄糖浓度的所得电位相对于时间的轨迹。因此，如图6D所示，针对该实验所绘制的漂移率在低至10nM葡萄糖时仍保持线性。在示出了通过测试8个单独的葡萄糖传感器得到的校准曲线的图6E中进一步示出了上述相关性。此外，在该实验中还测试了不含葡萄糖氧化酶(但仍具有Os氧化还原聚合物)的对照传感器。如图6E和6F所示，由空心圆表示的对照传感器的漂移率对葡萄糖浓度未显示出依赖性。
根据本发明的一些实施方案，可将本发明公开的方法用于降低背景信号(如在[分析物]＝0时的信号)。参考图6G-6H，采用图6A所示的实验中使用的葡萄糖传感器作为工作电极进行实验。此外，在开路电位测量中将不含葡萄糖氧化酶但仍具有Os氧化还原聚合物的对照传感器作为参考电极。使用这种配置，可以使并非来自葡萄糖氧化的测量信号的量最小化。例如，当采用无葡萄糖氧化酶对照传感器作为参考电极时，背景信号(葡萄糖浓度为零时电位相对于时间的轨迹的斜率)大约为零。所得的图6H中所示的校准曲线的截距比图6F中所示的使用Ag/AgCl参考电极获得的校准曲线的截距小两个数量级。因此，本发明的方法和系统包括在开路电位测量期间使用无葡萄糖氧化酶对照传感器作为参考电极是用于降低信号背景的有效方法。
在本发明的一些实施方案中，可以调整或修改由工作电极的感测层处的分析物的氧化还原反应产生的信号，以增强任何给定传感器和/或分析物浓度的信号输出。在本发明的一些实施方案中，通过修改记录电流信号的频率来增强信号。例如，参考图7，为了使在累积检测电流尖峰期间测量的峰高最大化，可以以比在本文公开的累积模式感测实验中所用的和图3A-3D、4A-4B和5中所示的0.5Hz采样率的采样率和0.03Hz滤波器的频率更快的采样率(如0.1Hz)记录和更高的频率(如3.2Hz)过滤所述信号。如图7所示，在3.2Hz的更高频率下，检测峰更加尖锐，从而导致更大的峰高。因此，在本发明的一些实施方案中，所述累积模式感测方法包括将频率滤波器增加到3.2Hz，以使信号幅度最大化。注意到，在高于3.2Hz的频率下，信号与噪声的比例太大，无论使用安培电流还是累积峰值测量都无法进行精确测量。
在本发明的一些实施方案中，将碳纳米管(CNT)添加至工作电极的感测元件。例如，将CNT添加至包括氧化还原介体和分析物特异性酶的感测试剂中并应用于工作电极。参考图8A，在右侧的显微照片中将CNT添加至感测试剂，和在左侧的显微照片中未添加CNT。在具有和不具有CNT的情况下测量累积模式感测。如图8B所示，在工作电极上的感测元件中添加CNT的情况下，累积模式电流尖峰具有更大的峰高。
在本发明的一些实施方案中，累积模式感测包括使用具有30分钟累积时间(如针对累积电荷的设定的时间段)的传感器、3.2Hz的信号频率滤波器和将碳纳米管(CNT)添加至工作电极上的感测元件中。图9A示出了在CNT存在下，在0至200nM的葡萄糖浓度下代表性葡萄糖传感器以30分钟的累积时间获得的累积模式信号，并且所述信号以3.2Hz过滤。因此，如图9B的信号校准曲线所示，与安培法相比，根据本发明的实施方案的累积模式感测对低浓度分析物提供了增高的灵敏度。如图所示，采用30分钟的累积时间，采用峰高测量的累积模式感测使灵敏度相比安培法有800倍提高。就检测限而言，使用峰面积测量的累积模式感测更胜一筹，其得到4.7±1.4nM的检测下限(LOD)，相比于安培法有25倍的改进。尽管用于累积模式感测的线性范围比用于安培法的受到更多限制，但应注意，可以通过使用较短的累积时间将此范围移至更高的浓度。
用于累积模式感测的传感器
本文所述的传感器可以是体内传感器或体外传感器(即，离散的监测测试条)。此类传感器可在基板，如大体上平坦的基板上形成。在某些实施方案中，传感器是线，如，一个或多个其它电极与其相连(如，在上面，包括缠绕)的工作电极线内部分。传感器也可包括至少一个对电极(或对电极/参考电极)和/或至少一个参考电极或至少一个参考电极/对电极。
图12示意性描绘了根据本发明的实施方案的分析物传感器800的实施方案。所述传感器包括底座804上的电极801、802和803。可使用任何适当的技术，如，化学气相沉积(CVD)、物理气相沉积、溅射、反应溅射、印刷、涂布、烧蚀(例如，激光烧蚀)、涂覆、浸渍涂布、蚀刻等，应用或以其它方式处理电极(和/或其它特征)。材料包括但不限于以下中的任意一种或多种：铝、碳(包括石墨)、钴、铜、镓、金、铟、铱、铁、铅、镁、汞(作为汞齐)、镍、铌、锇、钯、铂、铼、铑、硒、硅(如，掺杂的多晶硅)、银、钽、锡、钛、钨、铀、钒、锌、锆、它们的混合物，和这些元素的合金、氧化物或金属化合物。
分析物传感器800可整体植入用户，或可配置成使得仅一部分置于用户内(内部)而另一部分在用户外(外部)。例如，传感器800可包括可置于皮肤表面810上方的第一部分，和置于皮肤表面下方的第二部分。在这些实施方案中，外部可包括触点(通过连动杆(trace)连接到第二部分的相应电极)来连接到也在用户外部的另一装置(如发射器单元)。虽然图12的实施方案示出在底座804的相同表面上并排的3个电极801、802和803，但是也可设想其它配置，例如，更少或更多的电极，在底座的不同表面或在另一底座上的一些或所有电极，层叠在一起的一些或所有电极，材料和规格不同的电极，等等。
图13示出了分析物传感器500的实施方案的横截面图，该传感器500具有可置于皮肤表面上方的第一部分(在该实施方案中可将其表征为主要部分)，和第二部分(在该实施方案中可将其表征为次要部分)，所述第二部分包括可置于皮肤表面下方(如穿过皮肤(真皮)并进入皮下空间并与穿戴者的生物流体(如间质液)接触)的传感器尾端530(本文可将其描述为***尖端)。电极触点(未示出)置于传感器500的位于皮肤表面上方的第一部分上，并延伸到传感器尾端530中的某个位置。在传感器500的第二部分处，特别是在传感器尾端530的底部处，示出了工作电极501、参考电极502和对电极503。应理解，可在传感器上提供更多或更少的电极。例如，传感器可包括多于一个的工作电极，且/或对电极和参考电极可以是单个对电极/参考电极等。
仍然参考图13，传感器500包括基板(或基板层)504和与感测区域509电连通的第一导电层508(如碳、金等)，由此共同限定工作电极501。通过在传感器500的一个或多个组件上提供抗菌品质(quality)，可以保护感测区域509免受微生物侵害，所述抗菌品质被设计为保护穿戴者的皮肤健康和/或保护感测区域509免受此类微生物的潜在干扰(如，由于微生物的潜在迁移而形成生物膜)。定义在图13中的传感器尾端530底部上的各种电极和感测区域可以共同构成一个感测区，并且在所述感测区上方(如感测区域509上方或电极503上方)的传感器尾端530的上部(上25％)中提供给予本文所述传感器尾端的任何此类抗菌品质。
第一绝缘层505(比如在一些实施方案中的第一介电层)可布置在或分层在第一导电层508的至少一部分上，和进一步地，第二导电层511可布置在或层叠在第一绝缘层(或介电层)505的至少一部分的顶部上。如图13所示，所述第二导电层511与第二导电材料510(比如银/氯化银(Ag/AgCl)层)结合可提供参考电极502。图14B中示出了第二导电材料510的另一种可能布置，以及覆盖各层的外膜520。
第二绝缘层506(如在一些实施方案中的第二介电层)可布置在或分层在第二导电层511的至少一部分上。另外，第三导电层513可布置在第二绝缘层506的至少一部分上，并可提供对电极503。最后，第三绝缘层507可布置在或分层在第三导电层513的至少一部分上。这样，可使传感器500分层，使得每个导电层的至少一部分由各自的绝缘层(如，介电层)隔开。图14B示出了另一种可能的层配置。图13和14B的实施方案示出了具有不同长度的层；然而在不脱离本发明的范围的情况下，一些或所有层可具有相同或不同长度和/或宽度。
在任意一个或全部实施方案中，电极501、502和503中的一些或所有可以如上文所述的分层结构布置在基板504的同一侧，或者可选地，可以以共面方式提供使得两个或更多个电极可置于基板504上的相同面(如，并排、平行或彼此相对成角度)。例如，共面电极可包括它们之间的适当间隔和/或包括布置在导电层/电极之间的介电材料或绝缘材料。此外，在一些实施方案中，电极501、502和503中的一个或多个可布置在基板504的相对侧。在此类实施方案中，接触垫可以在基板的相同或不同侧上。例如，电极可在第一侧上，而它对应的触点可在第二侧上，例如，连接电极和触点的连动杆可穿过基板。
现在参考图14A，其示出了根据本发明的一个或多个实施方案的分析物传感器的另一实施方案，并代表图13和14B的传感器500的变体。参考图14A，其示出了根据本发明的一个或多个实施方案的可植入(如皮下或经皮)感测区920，所述感测区920包括具有感测元件931的工作电极922。近端940被配置为连接至各种电连接以传输感测区920的输出信号。共同地，远端925和近端940形成传感器尾端。感测区920涵盖传感器尾端的底部。如所描绘的，感测区920包括圆形尖端，但是可选地可以存在其他尖端形状以利于***穿戴者的皮肤。
另外，在一个或多个实施方案中，感测区920可包括比如图13和14B中示出的那些的参考电极、对电极或对-参考电极。在不脱离本发明的范围的情况下，可以使用替代的电极配置。
参考图13、14A和14B，注意到传感器(或感测区)500、920包括在它们各自的传感器尾端的远端部分处的感测功能。如上文所述，该位置可以允许与穿戴者的皮肤之下的较深位置(如，皮下空间)增强的接触，在该位置，更容易接触到穿戴者的间质液，可能允许更容易接触到被测目标分析物(如，其浓度)。也就是说，将感测区放置在穿戴者的皮肤内足够深处以允许对特定分析物进行精确测量，而将感测区放置在距皮肤表面更近的位置可能不足以正确地测定所需分析物的浓度或其他特性。
参考图13和14B-14D，本发明的一个或多个实施方案包括具有感测区域509的工作电极501或320，所述感测区域509具有至少一个感测元件322，所述感测元件322包括，例如分析物特异性酶323和电子转移剂(如氧化还原介体)324。工作电极501或320被布置在基板504或325上，基板504或325安置为与工作电极501或320和对电极503接触并在工作电极501或320和对电极503之间。第一绝缘层505布置为与工作电极501或320的不与基板504或325接触的表面。参考电极502布置为与第一绝缘层505的不与工作电极501或320接触的表面接触，和第二导电材料(或层)510布置为与参考电极502的不与第一绝缘层505接触的表面接触。
图14C还示出了布置在工作电极320的至少一部分上的感测元件322。在本发明的一些实施方案中，可以在工作电极的感测层上提供两个或更多个感测元件322，其中所述两个或更多个感测元件彼此横向布置。
在本发明的一些实施方案中，任何合适配置的感测元件322均可以布置在工作电极320上。其它配置的感测元件公开在例如Hoss等(US 2012/0150005)中，其全部内容通过引用并入本文。
在本发明的一些实施方案中，参考图14B，传感器500包括至少覆盖工作电极501和感测区域509的外膜520。在其它实施方案中，所述外膜520覆盖整个传感器500。在一些实施方案中，所述外膜520覆盖传感器500的全部有效面积(active area)。例如，在图14A所示的感测区920上和图14B所示的感测区域509上发现的传感器500的有效面积。在一些实施方案中，所述外膜520覆盖感测区920或感测区域509上的工作电极、对电极和/或参考电极。
图14C描绘了覆盖布置在工作电极320上的感测元件322的外膜335的特写视图，述工作电极320布置在基板325上。如图所示，外膜335处于覆盖过程中。外膜335至少覆盖整个感测元件322。
分析物特异性酶和电子转移剂(氧化还原介体)
在本发明的一些实施方案中，本发明的传感器不能直接测量分析物。也就是说，所述传感器上的电极不能直接与分析物相互作用。因此，通过能够与分析物分子直接相互作用的酶蛋白来检测分析物。然而，由于一些酶(如葡萄糖氧化酶)的氧化还原活性位点被深埋在酶蛋白结构内，因此它们不能与电极直接交换电子。由此，为了在酶的氧化还原活性位点与电极之间转移电子，采用了电子转移剂(即，氧化还原介体)。由于固定的分子能够传递电子，因此电子转移剂和分析物特异性酶在感测层上的固定会形成所谓的“线(wire)”，并由此是“电连线的”。所述分析物特异性酶还称为“连线的酶(wired enzyme)”。在例如Gregg等(美国专利No.5,262,035)、Say等(美国专利No.6,134,461)和Hoss等(美国专利公开No.2012/0150005)中公开了连线的酶，它们的全部内容均通过引用并入本文。在一些实施方案中，所述分析物特异性酶是与电子转移剂交联的。
在本发明的一些实施方案中，电子转移剂(如，氧化还原介体)是所具有的氧化还原电位(电压)比标准甘汞电极(SCE)的氧化还原电位(电压)高或低几百毫伏的电还原性和电氧化性的离子或分子。在一些实施方案中，相对于SCE，在大于约-150mV时电子转移剂不再还原，在大于约+400mV时电子转移剂不再氧化。例如，在Mao等(美国专利No.6,605,200)中公开了氧化还原聚合物形式的合适的氧化还原介体的实例，其全部内容通过引用并入本文。
根据本发明的实施方案，参考图14D，电子转移剂324固定在工作电极320上。在一些实施方案中，通过任何合适的手段将电子转移剂324和分析物特异性酶323均固定在工作电极320上。在一些实施方案中，采用任何合适的交联剂将电子转移剂和分析物特异性酶共固定在工作电极上。在一些实施方案中，采用化学交联剂将电子转移剂和分析物特异性酶共固定，所述化学交联剂例如聚(乙二醇)二缩水甘油醚(PEGDGE)。
在本发明的一些实施方案中，在累积模式感测中使用的电子转移剂包括与选自聚(乙烯基吡啶)、聚(噻吩)、聚(苯胺)、聚(吡咯)或聚(乙炔)的聚合物偶联的选自锇、钌、铁或钴的氧化还原物质。在一些实施方案中，电子转移剂为式I的含锇(Os)的聚(乙烯基吡啶)氧化还原聚合物。
在本发明的一些实施方案中，电子转移剂可以是有机的、有机金属的或无机的。有机氧化还原物质的实例是醌和在其氧化状态具有醌式结构的物质，例如尼罗蓝和吲哚酚。一些醌和部分氧化的氢醌(quinhydrone)与蛋白质的官能团(例如半胱氨酸的硫醇基团、赖氨酸和精氨酸的胺基团和酪氨酸的酚基团)反应，这使得这些氧化还原物质不适于本发明的一些传感器，这是因为在含分析物的液体中存在干扰性蛋白质。应注意，大多数取代的醌和具有醌式结构的分子较少与蛋白质反应。在一些实施方案中，四取代的醌在1、2、3和4位上具有碳原子。
适用于根据本发明的实施方案的累积模式感测方法的电子转移剂具有防止或基本上减少在样本分析的时间段期间电子转移剂的扩散损失的结构或电荷。在本发明的一些实施方案中，电子转移剂包括结合至聚合物的氧化还原物质，所述聚合物能够固定至工作电极的感测层上。氧化还原物质和聚合物之间的结合可以是共价的、配位的或离子的。在美国专利No.5,264,104、No.5,356,786、No.5,262,035和No.5,320,725中描述了有用的电子转移剂及其制备方法，这些专利的全部内容均通过引用并入本文。尽管任何有机或有机金属的氧化还原物质可以结合至聚合物并用作电子转移剂，但在本发明的一些实施方案中，氧化还原介体是过渡金属化合物或络合物。在一些实施方案中，过渡金属化合物或络合物包括锇、钌、铁和钴化合物或络合物。应该理解，本文描述的许多氧化还原介体物质(例如没有聚合物组分)都可以用作载体液或传感器的感测层中的电子转移剂，在所述载体液或传感器的感测层中，电子转移剂的浸出是可接受的。
一类的不可释放的聚合物的电子转移剂包含共价结合在聚合物组合物中的氧化还原物质。此类介体的实例是聚(乙烯基二茂铁)。
另一类不可释放的电子转移剂包含离子结合的氧化还原物质。典型地，此类介体包括偶联至带相反电荷的氧化还原物质的带电聚合物。此类介体的实例包括偶联至带正电荷的氧化还原物质(比如与锇、钌、铁或钴偶联的聚吡啶基阳离子)的带负电荷的聚合物(比如Nafion(Dupont))。离子结合介体的另一个实例是偶联至带负电荷的氧化还原物质(比如铁氰化物或亚铁氰化物)的带正电荷的聚合物(比如季铵化的聚(4-乙烯基吡啶)或聚(1-乙烯基咪唑))。在本发明的一些实施方案中，结合的氧化还原物质是结合到带相反电荷的氧化还原聚合物中的高度带电的氧化还原物质。
在本发明的一些实施方案中，合适的不可释放的电子转移剂包括配位结合到聚合物的氧化还原物质。例如，通过使锇或钴2,2’-二吡啶络合物与聚(1-乙烯基咪唑)或聚(4-乙烯基吡啶)配位形成的介体。
在本发明的一些实施方案中，电子转移剂是具有一个或多个配体的锇过渡金属络合物，每个配体具有含氮杂环，比如2,2’-二吡啶、1,10-菲咯啉或它们的衍生物。此外，在一些实施方案中，电子转移剂具有一个或多个共价结合到聚合物中的配体，每个配体具有至少一个含氮杂环，比如吡啶、咪唑或它们的衍生物。这些优选的电子转移剂迅速地在彼此和工作电极之间交换电子，以使得可迅速地使络合物被氧化和被还原。
在本发明的一些实施方案中，电子转移剂包括(a)具有吡啶或咪唑官能团的聚合物或共聚物，和(b)与两个配体络合的锇阳离子，每个配体包含2,2’-二吡啶、1,10-菲咯啉或它们的衍生物，两个配体不一定是相同的。在一些实施方案中，用于与锇阳离子络合的2,2’-二吡啶的衍生物是4,4’-二甲基-2,2’-二吡啶和单-、二-和聚烷氧基-2,2’-二吡啶，比如使用4,4’-二甲氧基-2,2’-二吡啶。在一些实施方案中，用于与锇阳离子络合的1,10-菲咯啉的衍生物是4,7-二甲基-1,10-菲咯啉和单-、二-和聚烷氧基-1,10-菲咯啉，比如4,7-二甲氧基-1,10-菲咯啉。在本发明的一些实施方案中，用于与锇阳离子络合的聚合物包括聚(1-乙烯基咪唑)(称为“PVI”)和聚(4-乙烯基吡啶)(称为“PVP”)的聚合物和共聚物。合适的聚(1-乙烯基咪唑)的共聚物取代物包括丙烯腈、丙烯酰胺和取代的或季铵化的N-乙烯基咪唑。在一些实施方案中，电子转移剂包括络合至聚(1-乙烯基咪唑)的聚合物或共聚物的锇。
根据本发明的实施方案，电子转移剂具有相对于标准甘汞电极(SCE)的范围为-100mV至约+150mV的氧化还原电位(电压)。更特别地，电子转移剂的电位(电压)的范围为-100mV至+150mV，在一些实施方案中，所述电位(电压)的范围为-50mV至+50mV。在本发明的其他实施方案中，电子转移剂具有锇、钌、铁或钴氧化还原中心，以及相对于SCE的范围为+50mV至-150mV的氧化还原电位(电压)。
分析物特异性酶的实例
在本发明的一些实施方案中，将分析物特异性酶提供(例如固定)在工作电极上以便催化待测分析物的氧化。如本文所用，还可将分析物特异性酶称为分析物氧化酶。在本发明的一些实施方案中，所述分析物特异性酶选自用于氧化葡萄糖的葡萄糖氧化酶、NAD-葡萄糖脱氢酶和FAD-葡萄糖脱氢酶。在一些实施方案中，所述分析物特异性酶为用于氧化乳酸的乳酸氧化酶或NAD-乳酸脱氢酶。在一些实施方案中，所述分析物特异性酶为用于氧化3-羟基丁酸的NAD-3-羟基丁酸脱氢酶。在一些实施方案中，所述分析物特异性酶为用于氧化皮质醇的11β-羟基类固醇脱氢酶2型。在一些实施方案中，所述分析物特异性酶是用于氧化醇的NAD-醇脱氢酶。在一些实施方案中，所述分析物特异性酶为用于氧化丙酮酸的丙酮酸氧化酶。在一些实施方案中，所述分析物特异性酶是用于氧化谷氨酸的NAD-谷氨酸脱氢酶。在一些实施方案中，所述分析物特异性酶是用于氧化茶碱的黄嘌呤氧化酶。
本领域普通技术人员将理解的，可以将任何烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或黄素氧化酶偶联或固定至工作电极的感测层，以便氧化其相应的分析物底物。
在本发明的一些实施方案中，NAD-依赖性酶的实例包括(-)-冰片脱氢酶、(+)-冰片脱氢酶、(+)-桧萜醇脱氢酶、(+)-反式香芹醇脱氢酶、(3S,4R)-3,4-二羟基环己-1,5-二烯-1,4-二羧酸脱氢酶、(R,R)-丁二醇脱氢酶、(R)-2-羟基脂肪酸脱氢酶、(R)-2-羟酸脱氢酶、(R)-4-羟基苯基乳酸脱氢酶、(R)-氨基丙醇脱氢酶、(R)-脱氢泛酸脱氢酶、(S,S)-丁二醇脱氢酶、(S)-2-羟基脂肪酸脱氢酶、(S)-肉碱3-脱氢酶、(S)-地衣酸还原酶、1,2-二羟基-6-甲基环己-3,5-二烯羧酸脱氢酶、1,3-丙二醇脱氢酶、1,6-二羟基环己-2,4-二烯-1-羧酸脱氢酶、2-(R)-羟丙基-CoM脱氢酶、2-(S)-羟丙基-CoM脱氢酶、2-烯醛还原酶、2-炔-1-醇脱氢酶、2-氨基苯磺酸2,3-双加氧酶、2-氯苯甲酸1,2-双加氧酶、2-香豆酸还原酶、2-脱氢-3-脱氧-D-葡糖酸5-脱氢酶、2-脱氧-D-葡糖酸3-脱氢酶、2-烯酸(enoate)还原酶、2-羟基-1,4-苯醌还原酶、2-羟基-3-氧基丙酸还原酶、2-羟基联苯3-单加氧酶、2-羟甲基戊二酸脱氢酶、2-羟基喹啉5,6-双加氧酶、2-羟基喹啉8-单加氧酶、2-氧代己二酸还原酶、2-氧代醛脱氢酶(NAD+)、2-氧代异戊酸脱氢酶(酰化)、2,3-二氢-2,3-二羟基苯甲酸脱氢酶、2,3-二羟基-2,3-二氢-p-香豆酸(cumate)脱氢酶、2,4-二氨基戊酸脱氢酶、2,6-二羟基吡啶3-单加氧酶、2'-磷酸转移酶、3-(咪唑-5-基)乳酸脱氢酶、3"-脱氨基-3"-氧代烟酰胺(oxonicotianamine)还原酶、3-脱氢-L-古洛糖酸2-脱氢酶、3-羟基-2-甲基丁酰基-CoA脱氢酶、3-羟基-2-甲基吡啶羧酸双加氧酶、3-羟酰基-CoA脱氢酶、3-羟基苯甲酸6-单加氧酶、3-羟基丁酸脱氢酶、3-羟基异丁酸脱氢酶、3-羟基苯乙酸6-羟化酶、3-羟基庚二酰(hydroxypimeloyl)-CoA脱氢酶、3-羟基丙酸脱氢酶、3-甲基丁醛还原酶、3-氧代酰基-(酰载体蛋白)还原酶(NADH)、3-苯基丙酸双加氧酶、3(或17)a-羟基类固醇脱氢酶、3α-羟基-5β-雄甾烷-17-酮3α-脱氢酶、3α-羟基胆烷酸脱氢酶、3α-羟基类固醇脱氢酶(A-特异性)、3α-羟基类固醇脱氢酶(B-特异性)、3α,7α,12α-三羟基胆甾烷-26-醛26-氧化还原酶、3α(17β)-羟基类固醇脱氢酶(NAD+)、3α(或20β)-羟基类固醇脱氢酶、3β-羟基类固醇脱氢酶、4-(羟甲基)苯磺酸脱氢酶、4-氨基苯甲酸1-单加氧酶、4-氯苯基乙酸3,4-双加氧酶、4-甲酰基苯磺酸脱氢酶、4-羟基-四氢吡啶二羧酸(tetrahydrodipicolinate)还原酶、4-羟基苯甲醛脱氢酶、4-羟基苯甲酸1-羟化酶、4-羟基苯甲酸3-单加氧酶(NAD(P)H)、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基环己烷羧酸脱氢酶、4-羟基粘康半醛脱氢酶、4-羟苯乙醛脱氢酶、4-羟基苯乙酸1-单加氧酶、4-羟基喹啉3-单加氧酶、4-羟基苏氨酸-4-磷酸脱氢酶、4-硝基酚2-单加氧酶、4-氧代脯氨酸还原酶、4-磷酸赤藓酸(phosphoerythronate)脱氢酶、4-磺基苯甲酸3,4-双加氧酶、4-三甲基铵丁醛脱氢酶、5-羧基甲基-2-羟基粘康酸半醛脱氢酶、5,6-二羟基-3-甲基-2-氧代-1,2,5,6-四氢喹啉脱氢酶、6-内式-羟基桉树脑脱氢酶、6-羟基己酸脱氢酶、6,7-二氢蝶啶还原酶、7-α-羟基类固醇脱氢酶、15-羟基二十碳四烯酸(hydroxyicosatetraenoate)脱氢酶、15-羟基***素脱氢酶(NAD+)、15-氧代***素13-氧化酶、16-α-羟基类固醇脱氢酶、17β-羟基类固醇脱氢酶、20-α-羟基类固醇脱氢酶、21-羟基类固醇脱氢酶(NAD+)、ADP-甘油甘露-庚糖6-差向异构酶、丙氨酸脱氢酶、阿兰碱(Alanopine)脱氢酶、醇(Alcohol)脱氢酶、醇(Alcohol)脱氢酶(NAD(P)+)、醛脱氢酶(NAD(P)+)、醛(Aldehyde)脱氢酶(NAD+)、醛醣1-脱氢酶、烯烃单加氧酶、α-蛔蒿素1,2-还原酶、氨基丁醛脱氢酶、氨基粘康半醛脱氢酶、花青素还原酶、邻氨基苯甲酸1,2-双加氧酶(脱氨基、脱羧)、氨茴酰-CoA单加氧酶、洋芹糖1-还原酶、水钴胺素还原酶、阿罗酸(Arogenate)脱氢酶、阿罗酸脱氢酶(NAD(P)+)、芳醇脱氢酶、芳醛脱氢酶、天冬酸(asparagusate)还原酶、天冬氨酸脱氢酶、ATP-依赖性NAD(P)H-水合脱水酶、苯甲醛脱氢酶(NAD+)、苯1,2-双加氧酶、苯甲酸1,2-双加氧酶、β-阿兰碱(alanopine)脱氢酶、甜菜碱醛脱氢酶、联苯2,3-双加氧酶、丁醛脱氢酶、肉碱3-脱氢酶、CDP-4-脱氢-6-脱氧葡萄糖还原酶、CDP-葡萄糖4,6-脱水酶、CDP-泊雷糖2-差向异构酶、胆甾-5-烯-3β,7α-二醇3β-脱氢酶、胆甾烷四醇26-脱氢酶、顺-1,2-二氢-1,2-二羟基萘脱氢酶、顺-1,2-二氢苯-1,2-二醇脱氢酶、顺-1,2-二羟基-4-甲基环己-3,5-二烯-1-羧酸脱氢酶、顺-2,3-二羟基联苯-2,3-二醇脱氢酶、顺-3,4-二氢菲-3,4-二醇脱氢酶、顺-二氢乙基儿茶酚脱氢酶、CoA-二硫化物还原酶、Cob(II)阿拉明(alamin)还原酶、松柏醛脱氢酶、葫芦素δ23-还原酶、环己烷-1,2-二醇脱氢酶、环己醇脱氢酶、环戊醇脱氢酶、胱氨酸还原酶、D-***糖醇2-脱氢酶、D-***糖醇4-脱氢酶、D-***糖1-脱氢酶、D-***糖1-脱氢酶(NAD(P)+)、D-艾杜糖醇2-脱氢酶、D-苹果酸脱氢酶(脱羧)、D-苏糖-醛糖1-脱氢酶、D-木糖1-脱氢酶、D-木酮糖还原酶、二苯并噻吩二氢二醇脱氢酶、二铁转铁还原酶、二氢尿嘧啶脱氢酶(NAD+)、二碘苯丙酮酸还原酶、二甲基苹果酸脱氢酶、DTDP-葡萄糖4,6-脱水酶、麻黄碱脱氢酶、赤藓糖-4-磷酸脱氢酶、***17α-脱氢酶、***17β-脱氢酶、脂酰-CoA合成酶、铁氧化还原蛋白-NAD(+)还原酶、铁螯合物还原酶、芴-9-醇脱氢酶、氟乙醛脱氢酶、FMN还原酶、甲醛脱氢酶、果糖酮酸(Fructuronate)还原酶、延胡索酸还原酶(NADH)、呋喃基糠酰胺异构酶、半乳糖醇2-脱氢酶、半乳糖醇-1-磷酸5-脱氢酶、半乳糖1-脱氢酶、γ-胍基丁醛脱氢酶、GDP-4-脱氢-6-脱氧-D-甘露糖还原酶、GDP-4-脱氢-D-鼠李糖还原酶、GDP-6-脱氧-D-塔罗糖4-脱氢酶、GDP-甘露糖4,6-脱水酶、GDP-甘露糖6-脱氢酶、葡糖酸5-脱氢酶、葡萄糖1-脱氢酶、葡萄糖1-脱氢酶(NAD+)、谷氨酸合成酶(NADH)、戊二酸-半醛脱氢酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(NAD(P)+)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(磷酸化)、甘油酸脱氢酶、甘油脱氢酶、甘油-3-磷酸脱氢酶(NAD(P)+)、甘油-3-磷酸脱氢酶(NAD+)、甘氨酸裂解体系、甘氨酸脱氢酶、乙醇醛脱氢酶、乙醛酸还原酶、十六醛脱氢酶(酰化)、十六醇脱氢酶、组氨醇脱氢酶、高异柠檬酸脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、氢(hydrogen)脱氢酶、羟基环己烷羧酸脱氢酶、羟胺还原酶(NADH)、羟丙二酸脱氢酶、羟甲基戊二酰-CoA还原酶、羟基苯丙酮酸还原酶、羟基丙酮酸还原酶、连二次硝酸还原酶、亚牛磺酸脱氢酶、二十烷酰基(Icosanoyl)-CoA合成酶、咪唑乙酸4-单加氧酶、IMP脱氢酶、茚醇脱氢酶、吲哚-3-乙醛还原酶(NADH)、吲哚乳酸脱氢酶、肌醇2-脱氢酶、肌醇-3-磷酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶、异薄荷烯醇脱氢酶、犬尿喹啉酸(Kynurenate)-7,8-二氢二醇脱氢酶、L-氨基-酸脱氢酶、L-氨基己二酸-半醛脱氢酶、L-***糖醇2-脱氢酶、L-***糖醇4-脱氢酶、L-***糖1-脱氢酶、L-赤型-3,5-二氨基己酸脱氢酶、L-二醇脱氢酶、L-古洛糖酸3-脱氢酶、L-艾杜醇2-脱氢酶、L-艾杜糖酸5-脱氢酶、L-鼠李糖1-脱氢酶、L-苏糖酸3-脱氢酶、L-苏氨酸3-脱氢酶、乳醛脱氢酶、乳醛还原酶、烯胆甾烷醇氧化酶、豆血红蛋白还原酶、亮氨酸脱氢酶、长链醇脱氢酶、赖氨酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶(脱羧)、苹果酸脱氢酶(草酰乙酸脱羧)、马来酰乙酸还原酶、丙二酸-半醛脱氢酶、丙二酸-半醛脱氢酶(乙酰化)、甘露醇2-脱氢酶、甘露醇脱氢酶、甘露醇-1-磷酸5-脱氢酶、甘露糖醛还原酶、黄木樨酸(Melilotate)3-单加氧酶、内消旋-酒石酸脱氢酶、甲醇脱氢酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶(NAD+)、甲基乙二醛还原酶(NADH-依赖性)、甲基丙二酸-半醛脱氢酶(酰化)、3-羟-3-甲戊醛酸(Mevaldate)还原酶、单脱氢抗坏血酸还原酶(NADH)、***6-脱氢酶、霉菌硫醇(Mycothiol)-依赖性甲醛脱氢酶、霉硫酮(Mycothione)还原酶、肉豆蔻酰基-CoA11-(E)去饱和酶、肉豆蔻酰基-CoA 11-(Z)去饱和酶、N-乙酰己醣胺1-脱氢酶、N-乙酰甘露糖胺1-脱氢酶、N-羟基-2-乙酰氨基芴还原酶、NAD(+)—二氮-还原酶ADP-D-核糖转移酶、NAD(+)-白喉酰胺ADP-核糖转移酶、NAD(P)(+)—蛋白-精氨酸ADP-核糖转移酶、NAD(P)+核苷酶、NAD(P)+转氢酶(Re/Si-特异性)、NAD(P)+转氢酶(Si-特异性)、NAD(P)H脱氢酶(醌1)、NAD(P)H脱氢酶(醌)、NAD+二磷酸酶、NAD+核苷酶、NAD+合成酶、NAD+合成酶(谷氨酰胺水解)、NADH脱氢酶(醌)、NADH过氧化物酶、萘1,2-双加氧酶、烟酰胺-核苷酸腺苷酰转移酶、一氧化氮双加氧酶、亚硝酸还原酶(NAD(P)H)、硝基喹啉-N-氧化物还原酶、辛醇脱氢酶、ω-羟基癸酸脱氢酶、冠瘿碱(Opine)脱氢酶、苔黑素(Orcinol)2-单加氧酶、鸟氨酸环化脱氨酶、乳清酸还原酶(NADH)、草酰乙醇酸还原酶(脱羧)、泛酸4-脱氢酶、紫苏子醇脱氢酶、苯乙醛脱氢酶、苯丙氨酸脱氢酶、苯乙醛酸脱氢酶(酰化)、磷脂酰胆碱12-单加氧酶、磷脂酰胆碱去饱和酶、磷酸葡糖酸2-脱氢酶、磷酸甘油酸脱氢酶、膦酸脱氢酶、邻苯二甲酸4,5-顺-二氢二醇脱氢酶、邻苯二甲酸4,5-双加氧酶、庚二酰-CoA脱氢酶、前咕啉(Precorrin)-2脱氢酶、前咕啉(Precorrin)-3B合成酶、预苯酸脱氢酶、丙二醇-磷酸脱氢酶、蛋白-二硫化物还原酶、吡哆醛4-脱氢酶、吡咯啉-2-羧化物还原酶、吡咯啉-5-羧化物还原酶、奎尼酸脱氢酶、视黄醛脱氢酶、视黄醇脱氢酶、核糖苷2-脱氢酶、核糖苷-5-磷酸2-脱氢酶、玉红氧还蛋白—NAD(+)还原酶、玉红氧还蛋白—NAD(P)(+)还原酶、S-(羟甲基)谷胱甘肽脱氢酶、酵母氨酸脱氢酶(NAD+，L-谷氨酸-形成)、酵母氨酸脱氢酶(NAD+，L-赖氨酸-形成)、水杨醛脱氢酶、水杨酸1-单加氧酶、红杉醇脱氢酶、丝氨酸2-脱氢酶、Sn-甘油-1-磷酸脱氢酶、山梨醇-6-磷酸2-脱氢酶、类固醇17α-单加氧酶、固醇-4α-羧化物3-脱氢酶(脱羧)、斯插宾(Strombine)脱氢酶、琥珀酸-半醛脱氢酶、琥珀酸-半醛脱氢酶(NAD(P)+)、琥珀酰谷氨酸-半醛脱氢酶、甲基庚烯酮(Sulcatone)还原酶、塔格糖酮酸(Tagaturonate)还原酶、酒石酸脱氢酶、牛磺奥品(Tauropine)脱氢酶、黄杉素8-单加氧酶、对苯二甲酸1,2-顺-二氢二醇脱氢酶、对苯二甲酸1,2-双加氧酶、睾酮17β-脱氢酶、四羟基蝶啶环异构酶、硫代吗啉-羧化物脱氢酶、TM0436、甲苯双加氧酶、反-2-烯酰-CoA还原酶(NAD+)、三甲胺-N-氧化物还原酶、色氨酸脱氢酶、UDP-葡萄糖4-差向异构酶、UDP-葡萄糖6-脱氢酶、UDP-葡萄糖醛酸5'-差向异构酶、UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖6-脱氢酶、脲基乙醇酸脱氢酶、糖醛酸脱氢酶、香草酸单加氧酶、香草醛脱氢酶、吐叶醇脱氢酶、黄嘌呤脱氢酶、眼黄素(Xanthommatin)还原酶或黄氧素脱氢酶。
在本发明的一些实施方案中，所述分析物特异性酶包括黄素氧化酶，比如黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖性氧化酶或黄素单核苷酸(FMN)依赖性氧化酶。FAD-依赖性或FMN-依赖性氧化酶的实例包括：(R)-6-羟烟碱氧化酶、(S)-2-羟基-酸氧化酶、(S)-6-羟烟碱氧化酶、2-烯酸(enoate)还原酶、2-甲基-支链-烯酰-CoA还原酶、2-硝基丙烷双加氧酶、2,4-二氯苯酚6-单加氧酶、2,6-二羟基吡啶3-单加氧酶、3-异-硝基丙酸氧化酶、3-羟基-2-甲基吡啶羧化物双加氧酶、3-羟基苯甲酸4-单加氧酶、3-羟基苯甲酸6-单加氧酶、3-羟基苯乙酸6-羟化酶、4-氨基苯甲酸1-单加氧酶、4-甲酚脱氢酶(羟基化)、4-羟基苯甲酸1-羟化酶、4-羟基苯甲酸3-单加氧酶、4-羟基苯甲酸3-单加氧酶(NAD(P)H)、4-羟基扁桃酸氧化酶、4-羟基苯乙酸1-单加氧酶、4-羟基苯乙酸3-单加氧酶、4-硝基苯酚2-单加氧酶、4-磺基苯甲酸3,4-双加氧酶、5-吡哆酸(pyridoxate)双加氧酶、酰基-CoA氧化酶、腺苷酰-硫酸还原酶、阿苯达唑单加氧酶、醇氧化酶、氨茴酰-CoA单加氧酶、水钴胺素还原酶、水钴胺素还原酶(NADPH)、精氨酸2-单加氧酶、苯1,2-双加氧酶、苯甲酸1,2-双加氧酶、β-环匹阿尼酸(cyclopiazonate)脱氢酶、纤维二糖脱氢酶(接受体)、胆碱氧化酶、CoA-谷胱甘肽还原酶、Cob(II)阿拉明(alamin)还原酶、氰钴铵素还原酶(氰化物消除)、环己胺氧化酶、D-2-羟基-酸脱氢酶、D-氨基酸氧化酶、D-***糖酸-1,4-内酯氧化酶、D-天冬氨酸氧化酶、D-谷氨酸(D-天冬氨酸)氧化酶、D-乳酸脱氢酶(细胞色素)、D-山梨醇脱氢酶(接受体)、脱氢葡糖酸脱氢酶、脱氧核糖嘧啶光裂解酶、二氢尿嘧啶氧化酶、二甲胺脱氢酶、二甲基甘氨酸脱氢酶、二甲基甘氨酸氧化酶、铁氧还蛋白—NADP(+)还原酶、葡糖酸2-脱氢酶(接受体)、葡萄糖脱氢酶(接受体)、葡糖苷3-脱氢酶、谷氨酸合成酶(铁氧还蛋白)、谷氨酸合成酶(NADH)、谷氨酸合成酶(NADPH)、谷胱甘肽氧化酶、甘油-3-磷酸氧化酶、氢脱氢酶、羟胺还原酶、咪唑乙酸4-单加氧酶、吲哚2,3-双加氧酶、吲哚-3-乙醛氧化酶、异戊酰基-CoA脱氢酶、犬尿氨酸(Kynurenine)3-单加氧酶、L-氨基-酸氧化酶、L-天冬氨酸氧化酶、L-半乳糖酸内酯氧化酶、L-谷氨酸氧化酶、L-乳酸脱氢酶(细胞色素)、乳酸2-单加氧酶、烯胆甾烷醇氧化酶、Latia-萤光素单加氧酶(去甲基化)、长链酰基-CoA脱氢酶、赖氨酸2-单加氧酶、苹果酸脱氢酶(醌)、苹果酸氧化酶、扁桃腈裂解酶、黄木樨酸(Melilotate)3-单加氧酶、N-甲基-L-氨基酸氧化酶、NAD(P)+转氢酶(Si-特异性)、NAD(P)H脱氢酶(醌1)、NAD(P)H脱氢酶(醌)、NADH过氧化物酶、NADPH脱氢酶、NADPH脱氢酶(醌)、NADPH—细胞色素—c2还原酶、NADPH—血红素蛋白还原酶、烟酸脱氢酶、烟碱脱氢酶、亚硝酸还原酶(NAD(P)H)、亚硝酸还原酶(NO-形成)、苔黑素(Orcinol)2-单加氧酶、乳清酸还原酶(NADH)、乳清酸还原酶(NADPH)、草酸氧化酶、酚2-单加氧酶、苯乙醛酸脱氢酶(酰化)、邻苯二甲酸4,5-双加氧酶、多胺氧化酶、脯氨酸脱氢酶、腐胺氧化酶、吡喃糖氧化酶、吡哆醇4-氧化酶、吡哆醇5-脱氢酶、丙酮酸脱氢酶(细胞色素)、丙酮酸氧化酶、丙酮酸氧化酶(CoA-乙酰化)、视黄醛脱氢酶、玉红氧还蛋白—NAD(+)还原酶、水杨酸1-单加氧酶、肌氨酸脱氢酶、短链酰基-CoA脱氢酶、亚精胺脱氢酶、类固醇9α-单加氧酶、丙醇二酸-半醛合成酶、黄杉素8-单加氧酶、硫胺氧化酶、锥虫胱甘肽-二硫化物还原酶、UDP-N-乙酰胞壁酸(acetylmuramate)脱氢酶或香草醇氧化酶。
传感器膜
在本发明的一些实施方案中，参考图13和14B-14D，传感器500或传感器500的一部分包括至少覆盖工作电极501或320和感测元件322或感测区域509的外膜520或335。为了向感测试剂(如，分析物特异性酶323和氧化还原介体324)提供稳定性，以及提供大量转运限制、生物相容性和/或防止电极结垢，电化学传感器通常涂布有外膜520或335(如，聚合物膜)。
在本发明的一些实施方案中，所述膜由两种组分组成：亲水性(亲水的)聚合物和交联剂。所述交联剂将聚合物分子连接在一起，并将其锚定至传感器的感测层。对于体内浓度为约5mM的分析物(比如葡萄糖)，必须使用通量限制膜来防止电极结垢。在例如Mao等的美国专利No.6,932,894中公开了通量限制传感器膜的实例，其全部内容通过引用并入本文。
对于较低浓度的分析物，可以采用增加的例如长达30分钟的累积时间来使用通量限制膜。可选地，对于较低浓度的分析物，可以使用高渗透性的膜以便维持分析物向感测层的自然流动，同时还具有膜以增加传感器的生物相容性。例如，亲水性膜表面不会刺激(aggravate)人体的免疫系统，由此降低炎症的风险以及其他可能损害传感器性能的响应。
分析物监测系统
因此，实施方案包括分析物监测装置和系统，该系统包括用于体液中分析物的体内检测的分析物传感器，该分析物传感器的至少一部分可置于用户皮肤表面之下。在Say等(美国专利No.6,134,461)和Hoss等(美国专利申请公开No.2012/0150005)中公开了分析物监测系统，二者的全部内容通过引用并入本文。本发明的实施方案包括可完全植入的分析物传感器和仅传感器的一部分置于皮肤之下而传感器的一部分留在皮肤上方的分析物传感器，其中传感器的留在皮肤上方的部分用于如与传感器控制单元(其可包括发射器)、接收器/显示单元、收发器、处理器等联系。所述传感器，例如，可以皮下地置于用户体内以用于连续性或周期性监测用户的间质液中的分析物水平。出于这种描述的目的，除非另外注明，否则连续性监测和周期性监测可互换使用。可以将传感器响应与血液或其他液体中的分析物水平关联和/或转化成所述分析物水平。在某些实施方式中，可以将分析物传感器放置为与间质液接触以检测分析物水平，所检测到的分析物水平可以用于推断用户血流中的分析物水平。可以将分析物传感器***到静脉、动脉或含有液体的其他身体部分中。在一些实施方案中，可以配置所述分析物传感器以监测分析物水平达一定时间段，所述一定时间段可以是几秒钟、几分钟、几小时、几天、几周至几个月，或更长的时间。
在本发明的一些实施方案中，所述分析物传感器能够体内检测分析物达1小时或更长时间，例如几小时或更长时间，如几天或更长时间，如三天或更多天，如五天或更长时间，如七天或更长时间，如几周或更长时间，或一个月或更长时间。可以基于所获得的信息，如时间t0时的当前分析物水平、分析物的变化速率等，来预测未来的分析物水平。预测性报警可以在用户的分析物水平达到预测的未来分析物水平之前通知用户可能需要注意的预测分析物水平。这为用户提供了采取矫正行动的机会。
图15示出了数据监测和管理系统，比如，例如，根据本发明的某些实施方案的分析物监测系统400。仅为了方便起见，主要就葡萄糖监测装置和系统以及葡萄糖检测方法进一步说明了本发明的实施方案的方面，并且这样的描述绝不是意欲限制所述实施方案的范围。应理解该分析物监测系统可以被配置为在相同或不同的时间监测如本文所公开的多种分析物。
可以监测的分析物包括、但不限于，葡萄糖、乳酸、3-羟基丁酸、皮质醇、醇、丙酮酸、谷氨酸、茶碱、乙酰胆碱、淀粉酶、胆红素、胆固醇、绒毛膜***、糖基化血红蛋白(HbA1c)、肌酸激酶(如，CK-MB)、肌酸、肌酸酐、DNA、果糖胺、葡萄糖衍生物、谷氨酰胺、生长激素、激素、3-羟基丁酸、酮类、酮体、过氧化物、***特异性抗原、凝血酶原、RNA、促甲状腺激素和肌钙蛋白。还可以监测的分析物还包括药物，比如，例如，抗生素(如，庆大霉素、万古霉素等)、洋地黄毒苷、地高辛、滥用的药物、茶碱、和华法林(warfarin)。在一些实施方案中，监测多于一种分析物，可以在相同或不同的时间监测所述分析物。
分析物监测系统400包括分析物传感器401、可与传感器401连接的数据处理单元402和第一接收器单元404。在一些情况下，将第一接收器单元404配置为通过通信线路403与数据处理单元402通信。在某些实施方案中，还可以将第一接收器单元404配置为将数据传输到数据处理终端405以评价或另外处理或格式化第一接收器单元404所接收的数据。可将数据处理终端405配置为通过可以可选地配置为用于双向通信的通信线路407从数据处理单元402直接接收数据。另外，数据处理单元402可以包括发射器或收发器，以将数据传输至第一接收器单元404和/或数据处理终端405和/或任选的第二接收器单元406，和/或从第一接收器单元404和/或数据处理终端405和/或任选的第二接收器单元406接收数据。
图15中还示出了任选的第二接收器单元406，其可操作地与通信线路403连接并且被配置为接收从数据处理单元402传输的数据。可以将第二接收器单元406配置为与第一接收器单元404以及数据处理终端405通信。在一些实施方案中，可以将第二接收器单元406配置为与第一接收器单元404和数据处理终端405中的每一个双向无线通信。如以下进一步详细讨论的，在一些情况下，与第一接收器单元404相比，第二接收器单元406可以是去特征化(de-featured)的接收器，例如与第一接收器单元404相比，第二接收器单元406可以包括有限的或最少数量的功能和特征。如此，第二接收器单元406可以包括较小(在一个或多个维度上、包括所有维度)的紧凑外壳或体现在包括例如腕表、臂章、PDA、MP3播放器、手机等的装置中。可选地，可将第二接收器单元406配置为具有与第一接收器单元404相同或基本类似的功能和特征。第二接收器单元406可以包括对接部(docking portion)，该对接部被配置为与置于例如床侧以用于夜间监测的对接支架单元(docking cradle unit)和/或双向通信装置配合。对接支架可以为电源充电。
在图15所示的分析物监测系统400的实施方案中，仅示出了一个分析物传感器401、数据处理单元402和数据处理终端405。然而，本领域普通技术人员将理解，分析物监测系统400可以包括多于一个传感器401和/或多于一个数据处理单元402、和/或多于一个数据处理终端405。可以在用户体内放置多个传感器以用于在相同或不同的时间对分析物进行监测。在某些实施方案中，可以将通过放置在用户中的第一传感器获得的分析物信息用于与通过第二传感器获得的分析物信息进行比较。这对于确认或验证从一个或两个传感器所获得的分析物信息可以是有用的。如果在关键的治疗相关决策中考虑了分析物信息，那么这样的冗余(redundancy)可以是有用的。在某些实施方式中，第一传感器可以用于校准第二传感器。
分析物监测系统400可以是连续监测系统，或是半连续或不连续监测系统。在多部件环境中，可以将每个部件配置为被系统中的一个或多个其他部件唯一地识别，以使得可以容易地解决分析物监测系统400中各部件之间的通信冲突。例如，可以使用唯一的ID、信道等。
在某些实施方式中，将传感器401物理地置于正在监测其分析物水平的用户的体内或体表。可以将传感器401配置为至少周期性地对用户的分析物水平进行采样，并将所采集到的分析物水平转换成用于由数据处理单元402传输的相应信号。数据处理单元402能够与传感器401连接以使得这两个装置均置于用户的体内或体表，其中分析物传感器401的至少一部分是经皮放置的。数据处理单元可以包括固定元件(比如粘合剂等)以将其固定至用户的身体。可以使用可附接到用户并且可与数据处理单元402配合的安装架(mount)。例如，安装架可以包括粘合表面。数据处理单元402执行数据处理功能，其中这些功能可以包括、但不限于，数据信号的过滤和编码，其中每个信号对应于所采集的用户的分析物水平，以用于通过通信线路403传输至第一接收器单元404。在一些实施方案中，可以将传感器401或数据处理单元402或组合的传感器/数据处理单元完全植入到用户的皮肤表面之下。
在某些实施方案中，第一接收器单元404可以包括模拟接口部分，其包括RF接收器和配置为通过通信线路403与数据处理单元402通信的天线，以及用于处理从数据处理单元402接收的数据的数据处理部分，所述处理包括数据解码、误差检测和校正、数据时钟产生、数据位恢复等，或它们的任意组合。
在操作中，在某些实施方案中，将第一接收器单元404配置为与数据处理单元402同步从而基于例如数据处理单元402的识别信息唯一地识别数据处理单元402，并且随后，周期性地接收从数据处理单元402传输的信号，所述信号与通过传感器401检测到的监测的分析物水平有关。
再次参考图15，数据处理终端405可以包括个人计算机、便携式计算机包括笔记本或手持装置(如个人数字助理(PDA)、包括移动电话(如多媒体和启用互联网的移动电话，包括iPhoneTM、
数据处理终端405可以包括比如胰岛素输液泵等的药物递送装置(如输注装置)，可以将该装置配置为向用户施用药物(如胰岛素)，并且将该装置配置为与第一接收器单元404通信从而尤其是用于接收所测量到的分析物水平。可选地，可以将第一接收器单元404配置为将输注装置集成到其中以使得第一接收器单元404被配置为向用户施用合适的药物(如胰岛素)，例如，用于管理和修改基本分布，以及基于尤其是从数据处理单元402接收的所检测到的分析物水平来确定所施用的合适推注量。输注装置可以是外部装置或内部装置，所述内部装置比如完全植入用户体内的装置。
在某些实施方案中，可以将可包括输注装置(如胰岛素泵)的数据处理终端405配置为接收来自数据处理单元402的分析物信号，并由此将包括用于管理用户胰岛素疗法和分析物监测的数据处理的第一接收器单元404的功能合并。在某些实施方案中，图15中所示的通信线路403以及一个或多个其他通信接口可以使用例如、但不限于以下的一种或几种无线通信协议：RF通信协议、红外通信协议、启用蓝牙的通信协议、802.11x无线通信协议、或允许若干单元的安全无线通信(例如，根据《健康保险可携性和责任法案》(HIPPA)的要求)并且避免可能的数据冲突和干扰的等效无线通信协议。
在另外的实施方案中，数据处理单元402和/或第一接收器单元404和/或第二接收器单元406和/或数据处理终端(输注装置)405可配置成经由通信线路从例如血液分析物仪无线地接收分析物值。在其它实施方案中，处理或使用分析物监测系统400(图15)的用户可使用例如结合到数据处理单元402、第一接收器单元404、第二接收器单元406或数据处理终端(输注装置)405中的一个或多个的用户接口(例如，键盘、小键盘、语音命令等)来手动输入分析物值。
可以将如本文所公开的用于测量低纳摩尔浓度的分析物的传感器(如酶生物传感器)用在体内监测系统中，该体内检测系统可放置在用户(如人受试者)体内以使其与用户的体液接触并感测包含在其中的一种或多种分析物水平。体内监测系统可以包括一个或多个读取器装置，该读取器装置从传感器控制设备接收感测到的分析物数据。这些读取器装置可以以多种形式向用户处理和/或显示感测到的分析物数据或传感器数据。
参考图16，在一些实施方案中，读取器装置120可以是移动通信设备，比如专用读取器装置(将其配置为与传感器控制装置102(图17)通信以及任选地没有移动电话通信能力的计算机系统)或移动电话，所述移动电话包括、但不限于Wi-Fi或启用Internet的智能手机、平板电脑或个人数字助理(PDA)。智能手机的实例包括这样的移动电话，它们基于
还可以将读取器装置120配置成移动智能可穿戴电子组件，例如戴在用户眼睛上方或附近的光学组件(如，作为移动通信装置的智能镜片或诸如谷歌眼镜之类的智能眼镜)。该种光学组件可以具有透明的显示器，该透明的显示器向用户显示关于用户的分析物水平的信息，同时允许用户透过显示器视物，使得最小限度地阻挡用户的整体视野。光学组件可以像智能电话一样能够进行无线通信。可穿戴电子设备的其他实例包括在用户的手腕(例如手表等)、脖子(例如项链等)、头(例如头带、帽子等)、胸部等周围或附近佩戴的设备。
图16是配置为智能电话的读取器装置120的示例性实施方案的框图。在此，读取器装置120包括输入组件121、显示器122和处理电路206，所述处理电路206可包括一个或多个处理器、微处理器、控制器和/或微控制器，它们中的每一个可以是离散芯片或分布在多个不同芯片之间(和多个不同的芯片的一部分之间)。在此，处理电路206包括具有在板存储器203的通信处理器202和具有在板存储器205的应用处理器204。读取器装置120进一步包括与RF天线209连接的RF通信电路208、存储器210、与一个或多个相关天线214连接的多功能电路212、电源216、功率管理电路218和时钟219。图16是智能电话中的典型硬件和功能的缩略表示，并且本领域普通技术人员将容易认识到，也可以包括其他硬件和功能(如，编解码器、驱动器、胶合逻辑)。
如图16所示，通信处理器202可以与RF通信电路208接合，并且执行模数转换、编码和解码、数字信号处理以及促进将声音、视频和数据信号转换成适于提供给RF通信电路208的格式(如同相和正交的)的其他功能，然后，该RF通信电路208可以无线传输信号。通信处理器202还可以与RF通信电路208接合，以执行接收无线传输并且将其转换成数字数据、声音以及视频所需要的反向功能。RF通信电路208可包括发射器和接收器(如集成为收发器)和相关联的编码器逻辑。
还参考图16，应用处理器204可以适于执行操作系统以及位于读取器装置120上的任何软件应用，处理视频和图形，并且执行与通过RF天线209传输和接收的通信的处理不相关的那些其他功能。智能电话操作系统将与读取器装置120上的多个应用一起运行。多个应用(也称为“用户界面应用”)可以在任何时候在读取器装置120上运行，并且除了其他通常使用的与糖尿病检测方案不相关的应用(如，电子邮件、日历、天气、运动、游戏等)以外，还可以包括与糖尿病监测方案相关的一个或多个应用。例如，可以将由读取器装置接收到的表示感测到的分析物水平和体外血液分析物测量值的数据安全地传送到放置在读取器装置120的存储器210中的用户界面应用。可以例如通过使用移动应用程序的集装箱化(containerization)或包装技术来安全地执行此类通信。
存储器210可以由存在于读取器装置120内的各种功能单元中的一个或多个共享，或者可以分布在其中的两个或更多个之间(如，作为存在于不同芯片内的单独存储器)。存储器210还可以是其自己的单独芯片。存储器203、205和210是永久性的，并且可以是易失性(如，RAM等)和/或非易失性存储器(如，ROM、闪速存储器、F-RAM等)。多功能电路212也可以实现为一个或多个芯片和/或部件(如发射器、接收器、收发器和/或其它通信电路)，所述芯片和/或部件执行其它功能，比如在合适的协议(如Wi-Fi协议、蓝牙协议、蓝牙低能量协议、近场通信(NFC)协议、射频识别(RFID)协议、专有协议等)下例如利用传感器控制装置120进行的局部无线通信并且确定读取器装置120(如，全球定位系统(GPS)硬件)的地理位置。一个或多个其他天线214根据需要与功能电路212相关联，从而与多个协议和电路一起运行。
电源216可以包括一个或多个电池，其可以是可充电式或者单次使用的一次性电池。功率管理电路218可以调节电池充电和电力监测、提高功率、执行DC转换等。
读取器装置120可包括药物(如胰岛素等)递送装置或与其集成，使得它们如共享相同的外壳。此类药物递送装置的实例可包括具有留在体内的套管的药物泵，该药物泵允许在数小时或数天的时间内进行输注(如，用于递送基础胰岛素和推注胰岛素的可穿戴式泵)。当读取器装置120与药物泵组合时，其可包括用以储存药物的贮液器、可连接到传送管的泵以及输注套管。所述泵可以将药物从贮液器中压出，通过该管并通过***糖尿病人体内的套管的方式进入糖尿病人体内。可以包括在读取器装置120中(或与之集成)的药物递送装置的其他实例包括便携式注射装置，该便携式注射装置仅在每次递送时刺穿皮肤并且随后被移除(如，胰岛素笔)。当读取器装置120与便携式注射装置组合时，其可以包括注射针、用于携带药物的药筒、用于控制待递送的药物的量的接口以及引起注射发生的致动器。该装置可以重复使用直到药物用尽，此时可以丢弃该组合装置，或者可以用新的药筒更换所述药筒，此时可以重复使用该组合装置。每次注射后可以更换针头。
组合装置可以作为闭环系统(如，不需要用户干预即可操作的人工胰腺系统)或半闭环系统(如，需要很少用户干预即可操作的胰岛素环系统，比如确认剂量的改变)的一部分起作用。例如，可以通过传感器控制装置102以重复的自动方式来监测糖尿病的分析物水平，随后传感器控制装置102可以将所监测的分析物水平传输给读取器装置120，并且可自动确定用于控制糖尿病的分析物水平的适当药物剂量，并随后递送至糖尿病人的体内。用于控制泵和所递送的胰岛素量的软件指令可以存储在读取器装置120的存储器中，并由读取器装置的处理电路执行。这些指令还可以引发药物递送量和持续时间(如推注和/或基础输注情况(profile))的计算，所述计算基于直接或间接地从传感器控制装置102获得的分析物水平测量值。在一些实施方案中，传感器控制装置102可以确定药物剂量并将其传输给读取器装置120。
图17是示出具有分析物传感器104和传感器电子器件250(包括分析物监测电路)的传感器控制装置102的一个示例性实施方案的框图，传感器电子器件250可具有大部分处理能力，以呈现适合于显示给用户的最终结果数据。在图17中，描绘了单个半导体芯片251，其可以是自定义的专用集成电路(ASIC)。在ASIC 251内示出了某些高级功能单元，包括模拟前端(AFE)252、功率管理(或控制)电路254、处理器256、以及通信电路258(根据通信协议，可以将其实现作为发射器、接收器、收发器、无源电路或其他方式)。在此实施方案中，AFE 252和处理器256用作分析物监测电路，但是在其他实施方案中，任一个电路可以执行分析物监测功能。处理器256可以包括一个或多个处理器、微处理器、控制器和/或微控制器，它们中的每一个可以是离散芯片或分布在多个不同芯片之间(和多个不同的芯片的一部分之间)。
存储器253也包括在ASIC 251内，并且可以由存在于ASIC 251内的各种功能单元共享，或者可以分布在它们中的两个或更多个之间。存储器253可以是单独的芯片。存储器253是永久性的且可以是易失性和/或非易失性存储器。在此实施方案中，ASIC 251与电源260(其可以是钮扣电池等)连接。AFE 252与体内分析物传感器104接合，并且从中接收测量数据，并且以数字形式将数据输出给处理器256，在一些实施方案中，该处理器256又可以任何合适的方式进行处理。然后，将该数据提供给通信电路258，用于通过天线261发送给读取器装置120，例如这样的话常驻的软件应用需要最小限度的进一步处理来显示数据。可以根据应用需要和通信协议来配置天线261。天线261可以是，例如印刷电路板(PCB)走线天线、陶瓷天线或离散的金属天线。可以将天线261配置为单极天线、偶极天线、F型天线、环形天线等。
可以在传感器控制装置102或读取器装置120的启动下将信息从传感器控制装置102传送到第二装置(如，读取器装置120)。例如，当分析物信息可用时或根据时间表(如，约每1分钟、约每5分钟、约每10分钟等)，可以将信息通过传感器控制装置102自动地和/或重复地(如连续地)传送，在这种情况下，可以将信息存储或记录在传感器控制装置102的存储器中以用于以后的传送。可以响应于接收到的第二装置的请求而从传感器控制装置102传输该信息。该请求可以是自动请求，如，第二装置根据时间表发送的请求，或者可以是在用户的启动下生成的请求(例如，临时请求或手动请求)。在一些实施方案中，将对数据的手动请求称为传感器控制装置102的“扫描”或来自装置102的“按需”数据传输。在一些实施方案中，第二装置可以向传感器控制装置102发送轮询信号或数据包，并且装置102可以将每个轮询(或以一定时间间隔发生的轮询)处理为对数据的请求，并且，如果数据可用，则可以将此类数据传输至第二装置。在许多实施方案中，传感器控制装置102与第二装置之间的通信是安全的(例如，加密的和/或在认证的装置之间)，但是在一些实施方案中，数据可以以不安全的方式(如，作为面向范围内所有听取装置的广播)从传感器控制装置102传输。
可以将不同类型和/或形式和/或数量的信息作为每次通信的一部分发送，包括、但不限于当前传感器测量值中的一个或多个(如，在时间上对应于读取开始的时间的最新获得的分析物水平信息)、在预定时间段内测得的度量变化率、度量变化率的速率(变化率的加速度)或与在给定读取之前获得的并且存储在传感器控制装置102的存储器中的度量信息相对应的历史度量信息。
在给定通信或传输中可以将实时、历史、变化率、变化率的速率(如加速度或减速度)信息中的一些或全部发送至读取器装置120。在某些实施方案中，发送至读取器装置120的信息的类型和/或形式和/或数量可以是被预编程和/或不可更改的(如在制造过程中预设)，或可以不是被预编程和/或不可更改的，以使得在本领域可选择和/或可更改一次或多次(如通过激活系统的开关等)。因此，在某些实施方案中，读取器装置120可以输出当前(实时)传感器产生的分析物数值(如以数字格式)、当前分析物变化率(如以分析物速率指示物的形式，比如指向指示当前速率的方向的箭头)、以及基于由传感器控制装置102的存储器获取并存储于其中的传感器读数的分析物走势历史数据(如，以图形轨迹形式)。另外，可以通过可选的温度传感器257收集皮肤上或传感器上的温度读数或测量值。可以将这些读数或测量值(单独地或作为一段时间内的集合测量值)从传感器控制装置102传输至另一装置(如读取器或读取器装置120)。但是，温度读数或测量值可以与由读取器装置120执行的软件程序结合使用以纠正或补偿向用户输出的分析物测量值，从而代替向用户实际显示温度测量值或在其之外。
提供以下这些实施例仅用于说明目的，其不限制本申请的范围或内容。
实施例
实施例1采用聚合物涂布的传感器和长累积时间来计算累积模式检测的灵敏度。图5示出了采用聚合物涂布的葡萄糖传感器在0至500μM的葡萄糖浓度下经由安培法和累积模式感测获得的校准曲线。每条校准曲线为四个传感器的平均响应。然而，与安培法不同，累积模式感测通过改变累积时间能够轻松地调整传感器的灵敏度。对于峰高和峰面积测量，通过将累积时间从1分钟增加到10分钟，使传感器灵敏度提高了大约10倍。将图5中所示的每条校准曲线的灵敏度计算为线性拟合的斜率，其中列表数据示于表1。
表1
由于峰高和安培法测量是在相同的单位下进行的，因此可以将它们的灵敏度直接进行比较。采用来自如图5所示的通量膜传感器的数据，应用表2所示的表格在等效传感器条件下计算累积模式灵敏度与安培法灵敏度的比率(即倍数增加)。如所示出的，在累积时间为1分钟时，采用累积模式感测比采用安培法的传感器灵敏度为2倍之高。因此，通过将累积时间增加至10分钟，灵敏度差异增加至15倍。
表2
实施例2采用增加的频率和碳纳米管的添加来优化累积模式信号以用于高灵敏度检测。图7示出了在0.032Hz和3.2Hz两种不同的信号过滤频率下200nM葡萄糖的累积模式检测。如图所示，采用更高频率的过滤器，检测峰更加尖锐，从而导致更大的峰高。然而，在两条曲线下的面积没有改变。这表明当采用峰高测量时，更高频率的过滤器是理想的以使信号幅度最大化。特别地，当将过滤频率从0.032Hz改为3.2Hz时，发现峰高信号增加了2-3倍。此外，在高于3.2Hz的过滤频率下，信噪太大，无法进行安培电流和累积峰特征(峰高和峰面积)的精确测量。
作为用于增强累积模式信号的机制手段，添加了碳纳米管(CNT)以使沉积的感测试剂更加均匀和导电，由此提高氧化还原介导的氧化步骤的动力学。该种动力学的增加得到了具有更大峰高的累积模式电流尖峰。图8A示出了具有和不具有CNT的沉积和固化的葡萄糖感测试剂的显微照片。如图所示，包含CNT的感测试剂沉积得更均匀，而不含CNT的感测试剂则表现出大的“咖啡环效应”。发现将CNT添加至感测试剂使峰高信号增加了5至6倍。
另外，图8B示出实验的结果，该实验采用如所示的0-200nM葡萄糖浓度的示例性葡萄糖传感器使用安培法和通过峰高和峰面积测量的累积模式感测，探索了信号过滤频率和感测试剂中CNT的添加对传感器灵敏度的影响。测试了两种类型(感测试剂中具有和不具有CNT)的四个传感器，每条校准曲线为四个所示的传感器的平均响应。对每个累积模式检测应用10分钟的累积时间。在每一葡萄糖浓度下进行两次连续测量：一次使用0.032Hz的过滤频率，一次使用3.2Hz的过滤频率。
将图8B中每条校准曲线的灵敏度计算为线性拟合的斜率，和列表数据示于表3。如所示出的，安培测量的传感器灵敏度随过滤频率和CNT的存在而出现很小的变化，在所有条件下均保持在0.0003nA/nM以下。对于采用峰面积的累积模式测量，传感器的灵敏度不会随过滤频率的变化而变化，但是在向感测试剂添加CNT时，传感器的灵敏度会略有提高。在采用峰高的累积模式测量中观察到了传感器灵敏度的最大变化。过滤频率和感测试剂中CNT的添加均使传感器灵敏度提高。将过滤频率从0.032Hz增加到3.2Hz使灵敏度提高了约2.5倍，而将CNT添加到感测试剂中，则使灵敏度提高了约5.5倍。此外，滤波器频率的增加与CNT的添加的组合使累积模式测量的灵敏度提高了约14倍。
表3
由于将峰高和安培法测量是在相同的单位下进行的，因此可以将它们的灵敏度直接进行比较。表4给出了在等效传感器条件下累积模式灵敏度与安培法灵敏度的比率。如所示出的，即使在0.032Hz的过滤频率和感测试剂中不具有CNT的情况下，采用累积模式感测仍然比采用安培法的传感器灵敏度高30倍。因此，通过增加过滤频率和将CNT添加至感测试剂中来使累积模式峰高优化，灵敏度差异提高到近400倍。
表4
实施例3安培法和累积模式感测的灵敏度、检测限和线性范围的比较，其中累积模式感测采用30分钟的累积时间、3.2Hz信号频率和碳纳米管的添加。如图9B所示，与安培测量相关的电流非常小(<50pA)，并且在100nM以下失去线性，而累积模式感测的信号则大得多，并且在100nM以下保持很好的线性。下表5示出了与实施例5公开的这些测量相关的灵敏度、检测下限(LOD)(计算为3σ/斜率，采用标准方法1)和线性检测范围。在Mocak等，PureAppl.Chem.1997,69:297-328中公开了标准方法1，其全部内容通过引用并入本文。特别地，标准方法1是一种用于以“3σ/斜率”计算LOD的方法，其中“σ”是空白的标准偏差和“斜率”是校准曲线的斜率。
表5
实施例4背景信号的分析。参考图9A和9B，当在对大气开放的缓冲溶液中进行感测时，观察到阴性(阴极(cathodic))背景信号。不受任何理论的束缚，氧化还原反应可能是造成这种阴性背景的原因。具体而言，锇氧化还原介体和CNT能够催化氧化还原反应，当在累积期间断开电路时，这会导致锇介体的氧化，从而导致Os3+的积聚。当电路重新连通时，积聚的Os3+被还原，从而导致阴极峰。为了检验该种假设，在大气条件和氧气清除(例如通过鼓泡)条件下，在不包含葡萄糖的100mM磷酸盐缓冲液中测试了示例性葡萄糖传感器。图10A示出了在如所示的大气条件和氧气清除条件下，2、5和10分钟的累积时间的代表性传感器获得的所得累积模式信号。如所观察到的，在大气条件下，所述信号为阴极峰，而在氧气清除条件下，所述信号为较小的阳极峰。将4个传感器的平均(平均值)信号绘制在图10B中。如所示的，观察到安培法信号从在大气条件下的轻微阴性信号至在氧气清除条件下的轻微阳性信号。该实验的结果表明阴性背景的原因在于Os催化的氧气还原。
实施例5线性检测范围。为了测定累积模式感测的线性检测范围，实施图9A和9B中所示的校准实验直至200μM的葡萄糖浓度。得到的安培法和累积模式校准曲线示于图11。预测从0到200nM浓度测定的线性最佳拟合线为较高浓度。如图所示，安培法信号在高达至少100μM时仍然保持线性。另一方面，累积模式信号在开始在更高的浓度时达到平稳之前，在高达2至5μM时仍保持线性。这是可以预期的，因为Os氧化还原介体具有有限的电荷存储能力。对于在该实验中使用的传感器，该种能力显示为约5000nC。注意到，当采用较短的累积时间时，累积模式感测的线性范围可以移至更高的浓度。对于本文示出的数据，采用相对长(如30分钟)的累积时间以获得高灵敏度。
实施例6材料。从Steven Label,Inc.(Santa Fe Springs,CA)获得PET基板上的丝网印刷碳传感器。工作电极的有效面积由葡萄糖氧化催化剂的沉积面积限定，约为0.1mm2。根据公开的程序合成了用于葡萄糖氧化酶(GOx)接线的专有氧化还原聚合物和专有的通量限制膜聚合物，并分别从Nanosyn,Inc.(Santa Rosa,CA)和Regis Technologies,Inc.(Morton Grove,IL)获得。自Toyobo Co,Ltd.(Osaka,Japan)获得来自曲霉II的葡萄糖氧化酶(GOx，EC 1.1.3.4，活性130U/mg)。自Polysciences,Inc.(Warrington,PA)获得聚(乙二醇)(400)二缩水甘油醚(PEGDGE 400)和甘油三缩水甘油醚。自MK Nano(Mississauga,Ontario,Canada)获得多壁碳纳米管(CNT，OD 20-40nm，长度10-20μm)。自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)获得葡萄糖和用于缓冲溶液的常用化学品。所有水溶液均采用自ThermoScientific Barnstead E-Pure超纯水净化系统获得的>18.0MΩ·cm-1的去离子水制备。
实施例7传感器装配。使用了两种不同类型的葡萄糖感测试剂，一种不具有CNT，一种具有CNT。所述无CNT试剂如下制备。首先在10mM 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)缓冲液(pH 8)中制备三种溶液：4％(w/v)氧化还原聚合物、8.08％(w/v)GOx和8.08％(w/v)PEGDGE400。将这三种溶液以3.04:5.1:1.86的比例混合以得到葡萄糖感测试剂。为了制备具有CNT的葡萄糖感测试剂，遵循上述过程，除了将4％氧化还原聚合物溶液和8.08％PEGDGE400溶液在水性5％(w/v)CNT溶液中制备而非在10mM HEPES溶液中制备。制备后，将葡萄糖感测试剂以15nL的等分试样通过微注射器(Hamilton Co.)分配到传感器的碳工作电极上。将每个工作电极的有效面积由分配的感测试剂液滴的面积限定。该面积通常为0.1mm2。分配感测试剂之后，将传感器在25℃和60％的相对湿度下固化至少12小时。对于图5所示实验中使用的传感器，将外部、通量限制聚合物膜施加到传感器。按照如之前Liu等，Anal.Chem.2012,84:3403-3409中所述，通过浸涂施加所述膜(其由在80/20乙醇/水中的14％(w/v)的膜聚合物和3.5％(w/v)的甘油三缩水甘油醚的体积比为4:1的混合物组成)，其全部内容通过引用并入本文。
实施例8电化学测量。除非另有指示，否则全部电化学测量均采用合适的三电极电池进行，其中葡萄糖传感器作为工作电极，Ag/AgCl作为参考电极(在3M KCl中；Bioanalytical Systems，Inc.)和丝网印刷碳计数器电极。在累积模式实验过程中，使用恒电位仪测量传感器的电流相对于(vs.)时间的轨迹。对于累积模式测量，工作电极自恒电位仪电断开达设定量的时间(累积时间)，该时间点后将其重新连接至电路。图2示出了电极图式的示意图。当传感器的工作电极为电断开时，其保持在+40mV。对于图3A-3D、4A-4B、5和6A-6H中示出的实验，将BASi Petit安培恒电位仪(型号LC-3D；Bioanalytical Systems,Inc.,West Lafayette,IN)用于电流测量。采用0.5秒(s)的取样间隔和0.03Hz的滤波器，并采用内部LabView(National Instruments)软件记录电流信号。对于全部其它实验，需要增加的时间分辨率。因此，使用了具有更高时间分辨率的恒电位仪(型号1030C；CHInstruments,Inc.,Austin,TX)。除了图7和8B中所示的实验外，该恒电位仪以0.1秒的采样间隔和3.2Hz的滤波器使用。对于前述这些实验，该恒电位仪按照所指示的以0.1秒的采样间隔和3.2Hz的滤波器或0.032Hz的滤波器使用。采用制造商提供的软件记录该信号。采用Graphpad Prism 6软件进行所得到的电流vs.时间的轨迹中的峰高、峰面积和安培电流的测量。所有的实验均在100mM PBS缓冲液(pH＝7.4,100mM NaCl)和在33℃下进行。
如本文所公开和如全文所示，根据本发明的实施方案的累积模式感测可以用于在低分析物浓度下提供优于安培法的检测。
尽管已经参照某些示例性实施方案说明并描述了本发明，但是本领域普通技术人员将理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以对所描述的实施方案进行各种修饰和改变，如所附权利要求中所限定的。
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