一种基于氧化石墨烯蔗糖生物传感器的传感电极制备方法
阅读说明：本技术 一种基于氧化石墨烯蔗糖生物传感器的传感电极制备方法 (Method for preparing sensing electrode based on graphene oxide sucrose biosensor ) 是由 周杰 庄妮莎 董维亮 薛瑞 姜岷 于 2019-08-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物传感器的技术领域,更具体地,本发明提供了一种基于氧化石墨烯蔗糖生物传感器的传感电极制备方法。本发明第一方提供了一种基于氧化石墨烯蔗糖生物传感器的传感电极制备方法,包括杂化纳米片的制备、镜面玻碳电极的制备以及镜面玻碳电极的后处理；其中,杂化纳米片的制备原料包括氧化石墨烯与石墨烯量子点；同时采用壳聚糖将蔗糖酶、变旋酶及葡萄糖氧化酶固定在氧化石墨烯修饰后的电极表面。采用本方法制备的蔗糖生物传感电极及含有该电极的传感器线性检测上限较高,弥补了发酵生产中高浓度蔗糖无法直接检测的缺陷,也为后续开发蔗糖在线检测设备奠定了理论与应用基础。(The invention relates to the technical field of biosensors, and particularly provides a method for preparing a sensing electrode based on a graphene oxide sucrose biosensor. The first aspect of the invention provides a method for preparing a sensing electrode based on a graphene oxide sucrose biosensor, which comprises the steps of preparing a hybrid nanosheet, preparing a mirror surface glassy carbon electrode and post-treating the mirror surface glassy carbon electrode; the preparation raw materials of the hybrid nanosheet comprise graphene oxide and graphene quantum dots; meanwhile, the sucrase, the mutarotase and the glucose oxidase are fixed on the surface of the electrode modified by the graphene oxide by adopting chitosan. The sucrose biosensor electrode prepared by the method and the sensor containing the electrode have higher linear detection upper limit, make up the defect that high-concentration sucrose cannot be directly detected in fermentation production, and lay the theoretical and application foundation for the subsequent development of sucrose on-line detection equipment.)
技术领域
本发明涉及生物传感器的技术领域，更具体地，本发明提供了一种基于氧化石墨烯蔗糖生物传感器的传感电极制备方法。
背景技术
蔗糖是由一分子葡萄糖的半缩醛羟基与一分子果糖的半缩醛羟基彼此缩合脱水而成。蔗糖几乎普遍存在于植物界的叶、花、茎、种子及果实中，在甘蔗、甜菜及槭树汁中含量尤为丰富。蔗糖是多种制品的原料，在工业及食品上应用范围较广，可作为酵母的营养剂、食品甜味剂等。
目前对蔗糖的研究大多数集中蔗糖的高效生产及后期利用，对于生产过程中蔗糖浓度的变化关注较少。而且当前多数蔗糖检测方式为化学法，通过盐酸水解成葡萄糖进行检测。这种检测方法步骤繁琐，预处理周期长，滞后性以及干扰性较大，成本代价高等各类缺点，而新兴酶生物传感器以蔗糖酶、变旋酶及葡萄糖氧化酶为固定酶元件，具有实时便捷，灵敏度高，专一性强等优点。同时工业生产中所使用的蔗糖浓度较高，蔗糖检测更为困难。因此，开发一种高检测上限蔗糖生物传感器势在必行。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明第一方提供了一种基于氧化石墨烯蔗糖生物传感器的传感电极制备方法，包括杂化纳米片的制备、镜面玻碳电极的制备以及镜面玻碳电极的后处理；其中，杂化纳米片的制备原料包括氧化石墨烯与石墨烯量子点。
作为本发明的一种优选技术方案，其中，杂化纳米片的制备过程为将氧化石墨烯与石墨烯量子点溶于水中，超声，反应，离心，干燥。
作为本发明的一种优选技术方案，其中，镜面玻碳电极的后处理过程中包括：
A.将杂化纳米片溶于水，然后浇注于镜面玻碳电极；
B.将蔗糖酶、变旋酶、葡萄糖氧化酶的混合酶液以及壳聚糖溶液混合，再滴定于步骤A所得电极表面。
作为本发明的一种优选技术方案，其中，石墨烯量子点的粒径<10nm，氧化石墨烯的片径<500nm。
作为本发明的一种优选技术方案，其中，杂化纳米片溶于水中的浓度为0.5～1.5mg/mL。
作为本发明的一种优选技术方案，其中，蔗糖酶为0.05～0.3U，葡萄糖氧化酶为0～10U。
作为本发明的一种优选技术方案，其中，变旋酶含量为0.01～0.03mg，壳聚糖浓度为0.15～0.35wt％。
作为本发明的一种优选技术方案，其中，蔗糖酶及变旋酶的制备方法包括：
(1)将蔗糖酶以及变旋酶基因序列构建至表达质粒上，得到重组质粒；
(2)将重组质粒转化至宿主菌，得到蔗糖酶生产菌及变旋酶生产菌；
(3)蔗糖酶生产菌及变旋酶生产菌接种于培养基中，诱导表达，收集菌体；
(4)对步骤(3)所得菌体洗涤、离心、破碎、收集上清液，得粗酶液；
(5)粗酶液纯化，得蔗糖酶及变旋酶酶液。
作为本发明的一种优选技术方案，其中，粗酶液纯化的过程为：将粗酶液与Ni柱进行特异性结合，并用咪唑溶液洗脱，得到含有目的蛋白的洗脱液；再将含有目的蛋白的洗脱液通过超滤管离心富集，得到纯化的蔗糖酶及变旋酶酶液。
本发明的第二方面提供了一种所述传感电极制备方法制备得到的蔗糖生物传感器的传感电极。
与现有技术相比，本发明提供的基于氧化石墨烯蔗糖生物传感器的传感电极的方法，采用壳聚糖将蔗糖酶、变旋酶及葡萄糖氧化酶固定在氧化石墨烯修饰后的电极表面。采用本方法制备的蔗糖生物传感电极及含有该电极的传感器线性检测上限较高，弥补了发酵生产中高浓度蔗糖无法直接检测的缺陷，也为后续开发蔗糖在线检测设备奠定了理论与应用基础。
附图说明
图1为制备的传感电极对不同浓度的蔗糖电流—浓度响应曲线；
1-蔗糖含量为1.0mM；2-蔗糖含量为2.0mM；3-蔗糖含量为3.0mM；4-蔗糖含量为4.0mM；
图2为制备的传感电极对不同浓度的蔗糖电流—浓度响应曲线；
图3为制备的传感电极对相同浓度的不同物质电流—浓度响应曲线；
1-蔗糖；2-乳糖；3-半乳糖；4-果糖；5-麦芽糖；6-苹果酸；7-柠檬酸；8-蔗糖。
具体实施方式
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。
下面结合具体实施方式对本发明提供技术方案中的技术特征作进一步清楚、完整的描述，并非对其保护范围的限制。
本发明中的词语“优选的”、“优选地”、“更优选的”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。本发明中未提及的组分的来源均为市售。
本发明第一方面提供了一种基于氧化石墨烯蔗糖生物传感器的传感电极制备方法，包括杂化纳米片的制备、镜面玻碳电极的制备以及镜面玻碳电极的后处理；其中，杂化纳米片的制备原料包括氧化石墨烯与石墨烯量子点。
在一种实施方式中，一种基于氧化石墨烯蔗糖生物传感器的传感电极制备方法，包括如下步骤：
I.杂化纳米片的制备；
II.镜面玻碳电极的制备；
III.镜面玻碳电极的后处理。
在一种实施方式中，杂化纳米片的制备过程为将氧化石墨烯与石墨烯量子点溶于水中，超声，反应，离心，干燥。
优选地，杂化纳米片的制备过程为将氧化石墨烯与石墨烯量子点溶于超纯水中，超声1～5h；然后将所得溶液在150～200℃下反应10～20h；再将反应所得溶液于6000～10000rpm下离心3～9h；再将其于真空烘箱中45～75℃下干燥10～20h。
更优选地，杂化纳米片的制备过程为将氧化石墨烯与石墨烯量子点溶于超纯水中，超声2h；然后将所得溶液在180℃下反应14h；再将反应所得溶液于8000rpm下离心6h；再将其于真空烘箱中60℃下干燥14h。
在一种实施方式中，氧化石墨烯与石墨烯量子点溶于超纯水中所得溶液的浓度为0.8～2mg/mL；优选地，氧化石墨烯与石墨烯量子点溶于超纯水中所得溶液的浓度为1～1.5mg/mL；更优选地，氧化石墨烯与石墨烯量子点溶于超纯水中所得溶液的浓度为1.3mg/mL。
在一种实施方式中，石墨烯量子点的粒径<10nm，氧化石墨烯的片径<500nm；优选地，石墨烯量子点的粒径3～9nm，氧化石墨烯的片径100～400nm；更优选地，石墨烯量子点的粒径7nm，氧化石墨烯的片径220nm。
在一种实施方式中，氧化石墨烯与石墨烯量子点的重量比为1：(0.5～1.5)；优选地，氧化石墨烯与石墨烯量子点的重量比为1：1。
在一种实施方式中，镜面玻碳电极的制备方法包括如下步骤：
(1)将玻碳电极用氧化铝粉末抛光处理；
(2)对步骤(1)所得材料分别用硝酸溶液、无水乙醇及超纯水进行超声处理1～5h；
(3)将步骤(1)所得材料于氮气条件下干燥，即得镜面玻碳电极。
优选地，镜面玻碳电极的制备方法包括如下步骤：
(1)将玻碳电极用氧化铝粉末抛光处理；
(2)对步骤(1)所得材料分别用相同体积的50％(v/v)硝酸溶液、无水乙醇及超纯水进行超声处理2h；
(3)将步骤(1)所得材料于氮气条件下干燥，即得镜面玻碳电极。
在一种实施方式中，玻碳电极的直径为1～3mm，优选地，玻碳电极的直径为2mm。
在一种实施方式中，氧化铝的直径为0.02～0.5μm；优选地，氧化铝的直径为0.05μm与0.3μm；进一步优选地，0.05μm的氧化铝与0.3μm的氧化铝重量比为1：(0.5～1.5)；更优选地，0.05μm的氧化铝与0.3μm的氧化铝重量比为1：1。
在一种实施方式中，镜面玻碳电极的后处理过程中包括：
A.将杂化纳米片溶于水，然后浇注于镜面玻碳电极；
B.将蔗糖酶、变旋酶、葡萄糖氧化酶的混合酶液以及壳聚糖溶液混合，再滴定于步骤A所得电极表面。
优选地，镜面玻碳电极的后处理过程中包括：
A.将杂化纳米片溶于超纯水，超声1～5h，然后取10～30μL浇注于镜面玻碳电极；
B.将蔗糖酶、变旋酶、葡萄糖氧化酶的混合酶液以及壳聚糖溶液混合，再滴定于步骤A所得电极表面。
更优选地，镜面玻碳电极的后处理过程中包括：
A.将杂化纳米片溶于超纯水，超声2h，然后取15μL浇注于镜面玻碳电极；
B.将蔗糖酶、变旋酶、葡萄糖氧化酶的混合酶液以及壳聚糖溶液混合，再滴定于步骤A所得电极表面。
在一种实施方式中，杂化纳米片溶于水中的浓度为0.5～1.5mg/mL；优选地，杂化纳米片溶于水中的浓度为0.8～1.2mg/mL；更优选地，杂化纳米片溶于水中的浓度为1.0mg/mL。
在一种实施方式中，壳聚糖溶液中的溶剂为极性溶剂，包括但不局限于：冰醋酸、无水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、***、醋酸丁酯中的至少一种；优选地，溶剂为冰醋酸。
在一种实施方式中，壳聚糖溶液的质量分数为0.5％～5％；优选地，壳聚糖溶液的质量分数为1％～3％；更优选地，壳聚糖溶液的质量分数为1.25％。
在一种实施方式中，蔗糖酶为0.05～0.3U，葡萄糖氧化酶为0～10U；优选地，蔗糖酶为0.1～0.2U，葡萄糖氧化酶为3～7U；更优选地，蔗糖酶为0.16U，葡萄糖氧化酶为5.92U。
在一种实施方式中，变旋酶含量为0.01～0.03mg，壳聚糖浓度为0.15～0.35wt％；优选地，变旋酶含量为0.01～0.02mg，壳聚糖浓度为0.2～0.3wt％；更优选地，变旋酶含量为0.013mg，壳聚糖浓度为0.23wt％。
在一种实施方式中，蔗糖酶及变旋酶的制备方法包括：
(1)将蔗糖酶以及变旋酶基因序列构建至表达质粒上，得到重组质粒；
(2)将重组质粒转化至宿主菌，得到蔗糖酶生产菌及变旋酶生产菌；
(3)蔗糖酶生产菌及变旋酶生产菌接种于培养基中，诱导表达，收集菌体；
(4)对步骤(3)所得菌体洗涤、离心、破碎、收集上清液，得粗酶液；
(5)粗酶液纯化，得蔗糖酶及变旋酶酶液。
优选地，蔗糖酶及变旋酶的制备方法包括：
(1)将蔗糖酶以及变旋酶基因序列构建至表达质粒上，得到重组质粒；
(2)将100～300ng重组质粒转化至100～300μL宿主菌，在冰上静置10～50min后于35～55℃热激60～120s；再冰上放置1～5min后加入500～1500μL的LB培养基，于37℃、200rpm条件下培养0.5～3h，取适量培养后的菌液涂布于LB平板上过夜培养，即得到蔗糖酶生产菌及变旋酶生产菌；
(3)蔗糖酶生产菌及变旋酶生产菌接种于LB液体培养基中；再加入0.2～1mM的乳糖或异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达，离心收集菌体；
(4)对步骤(3)所得菌体用PBS缓冲液洗涤、离心、破碎、收集上清液，得粗酶液；
(5)粗酶液纯化，得蔗糖酶及变旋酶酶液。
更优选地，蔗糖酶及变旋酶的制备方法包括：
(1)将蔗糖酶以及变旋酶基因序列由南京金斯瑞公司合成并构建至表达质粒上，得到重组质粒；
(2)将200ng重组质粒转化至200μL宿主菌，在冰上静置30min后于45℃热激90s；再冰上放置2min后加入900μL的LB培养基，于37℃、200rpm条件下培养1h，取适量培养后的菌液涂布于LB平板上过夜培养，即得到蔗糖酶生产菌及变旋酶生产菌；
(3)蔗糖酶生产菌及变旋酶生产菌接种于LB液体培养基中；再加入0.5mM的乳糖诱导表达，离心收集菌体；
(4)对步骤(3)所得菌体用PBS缓冲液洗涤、离心、破碎、收集上清液，得粗酶液；
(5)粗酶液纯化，得蔗糖酶及变旋酶酶液。
在一种实施方式中，表达质粒为pET-29a和\或pET-30a；优选地，表达质粒为pET-29a。
在一种实施方式中，宿主菌为大肠杆菌；优选地，宿主菌为大肠杆菌Escherichiacoli BL21(DE3)。
在一种实施方式中，粗酶液纯化过程为：将粗酶液与Ni柱进行特异性结合，并用咪唑溶液洗脱，得到含有目的蛋白的洗脱液；再将含有目的蛋白的洗脱液通过超滤管离心富集，得到纯化的蔗糖酶及变旋酶酶液。
优选地，粗酶液纯化过程为：将粗酶液与Ni柱进行特异性结合，并用50mM、100mM、200mM、250mM咪唑溶液依次洗脱，得到含有目的蛋白的洗脱液；再将含有目的蛋白的洗脱液通过超滤管离心富集，得到纯化的蔗糖酶及变旋酶酶液。
本发明对葡萄糖氧化酶来源不做特别限制；在一种实施方式中，葡萄糖氧化酶为黑曲霉来源，购于Sigma。
在实验制备过程中可以发现当利用特定的氧化石墨烯与石墨烯量子点可以提高对氧化电流的相应程度，可能由于利用氧化石墨烯与石墨烯量子点粒径不同，交错充分，从而实现在玻碳电极表面的细致、均匀的铺展，提高对电流的相应敏感度；此外，本申请人也意外发现通过调控酶液与壳聚糖溶液在电极表面的滴加顺序可以解决传感器不灵敏的问题，当采用酶液与可聚糖溶液同时滴加时，可以明显提高氧化电流的峰值，调高灵敏度与检测准确性，可能由于在该条件下，酶分子与壳聚糖更好的实现分子级别的接触，从而实现分子级别的固定，对氧化反应敏感度提高，从而提高氧化电流的峰值，且利用本发明制备的酶液以及电极材料实现了对蔗糖检测的特异性检测，不会受其他材料的影响，同时也有较高的检测上限，可能氧化石墨烯与石墨烯量子点在电极表面的紧密结构以及酶液与壳聚糖分子级别的镶嵌与固定有利于减少被测液中杂质组分以及小分子物质的干扰，减少其他蛋白质、氨基酸等的粘附，从而提高特异性与检测上限。
实施例1
本发明的实施例1提供了一种基于氧化石墨烯蔗糖生物传感器的传感电极，其制备方法如下：
I.杂化纳米片的制备：将氧化石墨烯与石墨烯量子点溶于超纯水中，浓度为1.3mg/mL，超声2h；然后将所得溶液在180℃下反应14h；再将反应所得溶液于8000rpm下离心6h；再将其于真空烘箱中60℃下干燥14h；
石墨烯量子点的粒径7nm，氧化石墨烯的片径220nm；氧化石墨烯与石墨烯量子点的重量比为1：1；
II.镜面玻碳电极的制备：
(1)将玻碳电极用氧化铝粉末抛光处理；
(2)对步骤(1)所得材料分别用相同体积的50％(v/v)硝酸溶液、无水乙醇及超纯水进行超声处理2h；
(3)将步骤(1)所得材料于氮气条件下干燥，即得镜面玻碳电极；
氧化铝的直径为0.05μm与0.3μm，0.05μm的氧化铝与0.3μm的氧化铝重量比为1：1；玻碳电极的直径为2mm；
III.镜面玻碳电极的后处理：
A.将杂化纳米片溶于超纯水，浓度为1.0mg/mL，超声2h，然后取15μL浇注于镜面玻碳电极；
B.将蔗糖酶、变旋酶、葡萄糖氧化酶的混合酶液以及壳聚糖溶液混合，再滴定于步骤A所得电极表面；
壳聚糖溶液中的溶剂为冰醋酸，壳聚糖溶液的质量分数为1.25％；
蔗糖酶为0.16U，葡萄糖氧化酶为5.92U，变旋酶含量为0.013mg，壳聚糖浓度为0.23wt％；
蔗糖酶及变旋酶的制备方法包括：
(1)将蔗糖酶以及变旋酶基因序列由南京金斯瑞公司合成并构建至pET-29a上，得到重组质粒；
(2)将200ng重组质粒转化至200μL大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，在冰上静置30min后于45℃热激90s；再冰上放置2min后加入900μL的LB培养基，于37℃、200rpm条件下培养1h，取适量培养后的菌液涂布于LB平板上过夜培养，即得到蔗糖酶生产菌及变旋酶生产菌；
(3)蔗糖酶生产菌及变旋酶生产菌接种于LB液体培养基中；再加入0.5mM的乳糖诱导表达，离心收集菌体；
(4)对步骤(3)所得菌体用PBS缓冲液洗涤、离心、破碎、收集上清液，得粗酶液；
(5)粗酶液纯化：将粗酶液与Ni柱进行特异性结合，并用50mM、100mM、200mM、250mM咪唑溶液依次洗脱，得到含有目的蛋白的洗脱液；再将含有目的蛋白的洗脱液通过超滤管离心富集，得到纯化的蔗糖酶及变旋酶酶液。
实施例2
本发明的实施例2提供了一种基于氧化石墨烯蔗糖生物传感器的传感电极，其制备方法如下：
I.杂化纳米片的制备：将氧化石墨烯与石墨烯量子点溶于超纯水中，浓度为2mg/mL，超声5h；然后将所得溶液在200℃下反应20h；再将反应所得溶液于10000rpm下离心9h；再将其于真空烘箱中75℃下干燥20h；
石墨烯量子点的粒径7nm，氧化石墨烯的片径220nm；氧化石墨烯与石墨烯量子点的重量比为1：1.5；
II.镜面玻碳电极的制备：
(1)将玻碳电极用氧化铝粉末抛光处理；
(2)对步骤(1)所得材料分别用相同体积的50％(v/v)硝酸溶液、无水乙醇及超纯水进行超声处理5h；
(3)将步骤(1)所得材料于氮气条件下干燥，即得镜面玻碳电极；
氧化铝的直径为0.05μm与0.3μm，0.05μm的氧化铝与0.3μm的氧化铝重量比为1：1.5；玻碳电极的直径为2mm；
III.镜面玻碳电极的后处理：
A.将杂化纳米片溶于超纯水，浓度为1.5mg/mL，超声5h，然后取30μL浇注于镜面玻碳电极；
B.将蔗糖酶、变旋酶、葡萄糖氧化酶的混合酶液以及壳聚糖溶液混合，再滴定于步骤A所得电极表面；
壳聚糖溶液中的溶剂为冰醋酸，壳聚糖溶液的质量分数为3％；
蔗糖酶为0.3U，葡萄糖氧化酶为10U，变旋酶含量为0.03mg，壳聚糖浓度为0.35wt％；
蔗糖酶及变旋酶的制备方法包括：
(1)将蔗糖酶以及变旋酶基因序列由南京金斯瑞公司合成并构建至pET-29a上，得到重组质粒；
(2)将200ng重组质粒转化至200μL大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，在冰上静置50min后于55℃热激120s；再冰上放置5min后加入1500μL的LB培养基，于37℃、200rpm条件下培养1h，取适量培养后的菌液涂布于LB平板上过夜培养，即得到蔗糖酶生产菌及变旋酶生产菌；
(3)蔗糖酶生产菌及变旋酶生产菌接种于LB液体培养基中；再加入1mM的乳糖诱导表达，离心收集菌体；
(4)对步骤(3)所得菌体用PBS缓冲液洗涤、离心、破碎、收集上清液，得粗酶液；
(5)粗酶液纯化：将粗酶液与Ni柱进行特异性结合，并用50mM、100mM、200mM、250mM咪唑溶液依次洗脱，得到含有目的蛋白的洗脱液；再将含有目的蛋白的洗脱液通过超滤管离心富集，得到纯化的蔗糖酶及变旋酶酶液。
实施例3
本发明的实施例3提供了一种基于氧化石墨烯蔗糖生物传感器的传感电极，其制备方法如下：
I.杂化纳米片的制备：将氧化石墨烯与石墨烯量子点溶于超纯水中，浓度为0.8mg/mL，超声1h；然后将所得溶液在150℃下反应10h；再将反应所得溶液于6000rpm下离心3h；再将其于真空烘箱中45℃下干燥10h；
石墨烯量子点的粒径7nm，氧化石墨烯的片径220nm；氧化石墨烯与石墨烯量子点的重量比为1：0.5；
II.镜面玻碳电极的制备：
(1)将玻碳电极用氧化铝粉末抛光处理；
(2)对步骤(1)所得材料分别用相同体积的50％(v/v)硝酸溶液、无水乙醇及超纯水进行超声处理1h；
(3)将步骤(1)所得材料于氮气条件下干燥，即得镜面玻碳电极；
氧化铝的直径为0.05μm与0.3μm，0.05μm的氧化铝与0.3μm的氧化铝重量比为1：0.5；玻碳电极的直径为2mm；
III.镜面玻碳电极的后处理：
A.将杂化纳米片溶于超纯水，浓度为0.5mg/mL，超声1h，然后取10μL浇注于镜面玻碳电极；
B.将蔗糖酶、变旋酶、葡萄糖氧化酶的混合酶液以及壳聚糖溶液混合，再滴定于步骤A所得电极表面；
壳聚糖溶液中的溶剂为冰醋酸，壳聚糖溶液的质量分数为1％；
蔗糖酶为0.05U，葡萄糖氧化酶为0.2U，变旋酶含量为0.01mg，壳聚糖浓度为0.15wt％；
蔗糖酶及变旋酶的制备方法包括：
(1)将蔗糖酶以及变旋酶基因序列由南京金斯瑞公司合成并构建至pET-29a上，得到重组质粒；
(2)将200ng重组质粒转化至200μL大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，在冰上静置10min后于35℃热激60s；再冰上放置1min后加入500μL的LB培养基，于37℃、200rpm条件下培养0.5h，取适量培养后的菌液涂布于LB平板上过夜培养，即得到蔗糖酶生产菌及变旋酶生产菌；
(3)蔗糖酶生产菌及变旋酶生产菌接种于LB液体培养基中；再加入0.2mM的乳糖诱导表达，离心收集菌体；
(4)对步骤(3)所得菌体用PBS缓冲液洗涤、离心、破碎、收集上清液，得粗酶液；
(5)粗酶液纯化：将粗酶液与Ni柱进行特异性结合，并用50mM、100mM、200mM、250mM咪唑溶液依次洗脱，得到含有目的蛋白的洗脱液；再将含有目的蛋白的洗脱液通过超滤管离心富集，得到纯化的蔗糖酶及变旋酶酶液。
实施例4
本发明的实施例4提供了一种基于氧化石墨烯蔗糖生物传感器的传感电极，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于，氧化石墨烯与石墨烯量子点含量均为0。
实施例5
本发明的实施例5提供了一种基于氧化石墨烯蔗糖生物传感器的传感电极，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于，蔗糖酶、变旋酶、葡萄糖氧化酶的含量均为0。
实施例6
本发明的实施例6提供了一种基于氧化石墨烯蔗糖生物传感器的传感电极，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于，镜面玻碳电极的后处理：
A.将杂化纳米片溶于超纯水，浓度为1.0mg/mL，超声2h，然后取15μL浇注于镜面玻碳电极；
B.将蔗糖酶、变旋酶、葡萄糖氧化酶的混合酶液滴定于步骤A所得电极表面；再将壳聚糖溶液滴于电极表面。
实施例7
本发明的实施例7提供了一种基于氧化石墨烯蔗糖生物传感器的传感电极，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于，镜面玻碳电极的后处理：
A.将杂化纳米片溶于超纯水，浓度为1.0mg/mL，超声2h，然后取15μL浇注于镜面玻碳电极；
B.将将壳聚糖溶液滴定于步骤A所得电极表面；再将蔗糖酶、变旋酶、葡萄糖氧化酶的混合酶液滴于电极表面。
性能评估：
1.在检测体系中加入蔗糖的水溶液，其浓度为0.12M，对实施例1～6所得电极材料进行循环伏安法研究，在实验过程中发现，实施例1～3在-0.1V电压下形成了较为明显的氧化峰电流；而实施例4～7的电极均显示电阻较大，无明显的氧化峰电流。
本发明的检测体系是基于上海振华CHI650E A15655型号的电化学工作站，在三电极系统上选用50mL 50mM的PBS作为检测环境，并利用软件Chi650e检测电流变化。
2.选用-0.05V为检测电压，利用实施例1所得电极进行计时安培法实验，即在50mMPBS缓冲液(pH＝6.8)中滴加不同量的蔗糖溶液并记录电流的变化，测试结果如图1所示，且由实验结果可以发现随着蔗糖溶液的逐渐滴加，响应电流呈现阶梯式正增长。其中，利用所得的传感电极制备的传感器对蔗糖的响应较快，响应时间为20s，即到达下一次稳态电流95％以上所需时间。
根据不同蔗糖浓度下电流的相应值，计算得出线校准曲线，如图2所示，由图可以看出，响应电流值随着底物浓度的增加随之增长，且该电极呈现出一个0.5到4.5mM的检测曲线范围，线性方程为I(μA)＝0.2826C-0.04029，相关系数R2＝0.996，灵敏度经计算为4mA.M-1.cm-2。
3.选用-0.05V为检测电压，利用实施例1所得电极进行计时安培法实验，研究含有蔗糖生物传感电极的传感器的特异性，在50mM PBS缓冲液(pH＝6.8)中滴加相同量的不同物质溶液并记录电流的变化，结果如图3所示。由图可以看出，向PBS中加入0.5mM蔗糖后，响应电流急剧上升，形成一个明显的响应阶梯，而加入0.5mM的乳糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、柠檬酸及苹果酸，响应电流无明显变化；在检测环境中存在多种杂质的情况下，再加入0.5mM的蔗糖，响应电流仍急剧上升，形成一个明显的响应阶梯，且相应电流的变化值符合线性方程；由此说明，此方法制备的蔗糖生物传感器具有较强的特异性，在实际应用中可单一检测蔗糖。
4.在大肠发酵液中添加不同量的蔗糖，蔗糖浓度分别为0.2g/L、0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L、1.0g/L、1.2g/L，用实施例1所得的蔗糖传感电极对其进行检测，检测结果如表1所示。从测量结果可知，该方法制备的生物传感电极在大肠发酵液中进行检测蔗糖较为准确，测量的相对误差约为1.92％，具有较大的实际应用前景。
表1
前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。