阅读说明：本技术 Pgam5作为少弱精症诊断标志物及治疗靶点的应用 (Application of PGAM5 as diagnosis marker and treatment target of oligoasthenospermia ) 是由 黄宁 董锡阳 张亚卓 张曼玉 孙胜楠 于 2020-06-23 设计创作，主要内容包括：本发明属于少弱精诊断技术领域,具体涉及PGAM5作为少弱精症诊断标志物及治疗靶点的应用。本发明基于蛋白质组学方法,对正常和少弱精患者样本中的蛋白数据进行分析,以BSA蛋白信号强度为标准,检测上述样本中的蛋白丰度获得正常与患病样本中的差异蛋白。本发明通过该方法检测确认PGAM5在重度少弱精样本中显著下调,作为诊断生物标志物具有良好的可信度,应用于相关检测试剂及试剂盒的开发。同时,上述研究结果有助于明确少弱精症的发病机制,有助于少弱精症靶点药物的开发,具有重要的临床意义。(The invention belongs to the technical field of oligozoospermia diagnosis, and particularly relates to application of PGAM5 as an oligozoospermia diagnosis marker and a treatment target. The invention is based on a proteomics method, analyzes protein data in normal and oligozoospermia patient samples, detects protein abundance in the samples by taking BSA protein signal intensity as a standard, and obtains differential protein in normal and diseased samples. The method provided by the invention is used for detecting and confirming that PGAM5 is obviously reduced in severe asthenospermia samples, has good reliability as a diagnosis biomarker, and is applied to development of related detection reagents and kits. Meanwhile, the research result is helpful for determining the pathogenesis of oligospermia and developing a target drug for the oligospermia, and has important clinical significance.)

PGAM5作为少弱精症诊断标志物及治疗靶点的应用

技术领域

本发明属于少弱精诊断标志物领域，具体涉及PGAM5作为少精、弱精甚至重度少弱精症诊断标志物或治疗靶点，在制备诊断试剂或治疗少精、弱精及重度少弱精症药物中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

据世界卫生组织调查，15％的育龄夫妇存在不育问题，不育症已成为影响人类健康与社会发展的一个全球性医学和社会问题(Turner,T.T.and J.J.Lysiak,Oxidativestress:a common factor in testicular dysfunction.J Androl,2008.29(5):p.488-98)。根据世界卫生组织的定义，弱精子症是指精液中前向运动的精子少于32％。弱精子症是男性不育的主要原因之一。弱精子症约占男性不育的19％，而少精弱精或畸形弱精子症占男性不育的63％。尽管许多因素如生活方式、环境污染、精索静脉曲张以及感染等可能会导致弱精子症，严重影响人们的生活质量。

弱精症是指精液参数中前向运动的精子(a和b级)小于50％或a级运动的精子小于25％的病症，弱精症又称精子活力低下。少精症是指每毫升精液中精子数目低于2000万的异常表现，当精子密度≦1×10/mL时，则诊断为重度少精症。少精症和弱精症概念不同，在诊断标准上具有差异，但都属于精子的质量问题，发病原因较为相似。目前针对少弱精症的诱发因素及发展机制没有统一的认识，一般认为与感染、基因突变、缺乏维生素等因素相关。针对少弱精症的治疗，尚没有有效的药物，临床治疗多采用滋阴补肾的中药，或采用中西医结合的方式进行治疗，治疗方式以补充维生素及补益肾精气血亏虚为主。为了攻克该医学难题，开展相关机制研究有益于明确少弱精症的发病机制，对应的研发相应的靶点药物。

PGAM5(The protein phosphoglycerate mutase 5)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，PGAM5的激活可以导致成串排列的线粒体发生线性断裂，与线粒体的凋亡、坏死和自噬相关，并且，PGAM5在多种原因造成的细胞坏死通路中占据枢纽的作用，参与例如氧自由基的过量增长和钙离子的过度渗漏等引起的细胞坏死，但目前针对PGAM5导致细胞坏死的机制了解甚少。

发明内容

基于上述研究背景，本发明的目的在于基于精子蛋白质组学对与少弱精症相关靶点及通路进行筛选及研究，为重度少弱精症的诊断和治疗提供相关机制的依据。根据本发明筛选结果，在少弱精样本中，PGAM5的蛋白含量显著降低，即PGAM5在健康与少弱精子样本中的相对丰度存在差异，预示着PGAM5有望作为一种少弱精诊断和治疗靶点。

基于上述研究结果，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供PGAM5作为生物标志物在制备少精症、弱精症或重度少弱精症诊断产品中的应用。

本发明通过蛋白质组学方法对正常和重度少弱精患者精子样本中的蛋白相对丰度进行检测，其中PGAM5在正常样本和患者样本中的表达差异显著，患者样本中PGAM5的表达含量下调四倍，证明PGAM5与患病情况具有显著的相关性。

上述诊断产品包括诊断试剂或诊断试剂盒；所述诊断试剂包括但不限于通过免疫印迹法、酶联免疫吸附测定方法、色谱分析方法或基因工程方法对样本中PGAM5含量进行测定的试剂；所述诊断试剂盒包含上述用于检测样本中PGAM5含量的试剂。

本发明第二方面，提供PGAM5作为生物标志物在制备少精症、弱精症及重度少弱精症治疗药物中的应用。

在一些具体的实施方式中，所述应用方式包括将调节PGAM5含量的活性物质用于制备少精症、弱精症及重度少弱精症治疗药物。具体的，所述调节PGAM5含量的活性物质为PGAM5的激动剂。

本发明第三方面，提供一种用于少弱精症诊断的试剂盒，所述试剂盒中包括检测精子样本中PGAM5含量的试剂。

本发明第四方面，提供一种用于治疗少弱精症的药物，所述药物包括调节PGAM5表达含量的活性成分。

优选的，所述活性成分为PGAM5激动剂。

本发明第五方面，提供一种少弱精症的诊断方法，所述诊断方法包括如下的步骤：提取待检测对象的精子样本，检测所述精子中的PGAM5蛋白的检验丰度，所述检验丰度小于0.00591时，判定为少弱精患者。

以上一个或多个技术方案的有益效果是：

本发明以少弱精症的精子样本作为研究对象，对正常样本与患者样本中蛋白的相对丰度进行检测，通过筛选获得具有较高检测价值的差异蛋白。通过质谱数据分析，PGAM5在患者样本中表达含量显著下调4.1倍，ROC分析结果显示采用PGAM5作为诊断标志物具有良好的诊断效果，应用于个体检测的假阳性概率为12.7％，证明该蛋白是一种具有较高的准确性和诊断价值的标志物。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为实施例1中PGAM5蛋白检测相对丰度的ROC曲线图。

图2为实施例1中健康和少弱精样本中PGAM5蛋白检测强度比较图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，针对现有技术中存在的不足，本发明提供了PGAM5作为重度少弱精症诊断标志物和治疗靶点的应用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

一、检测方法

本实施例中，提供了基于精子蛋白质组学对少弱精标志物进行检测的方法，以下实施例中所用样本全部来源于山东大学附属生殖医院，少弱精子症患者样本精子前向运动在7.8％-17.3之间，精子浓度在3.8-14.8百万/mL之间，所述检测方法包括如下步骤：

(1)提取精子细胞全蛋白：将精子样本采用DPBS洗涤，加入RIPA裂解液超声1～2min，置于冰上孵育30min裂解，14,000g离心20min，取上层蛋白质清液，利用Bradford法测定清液中蛋白浓度。

(2)利用基于超滤辅助样品制备(FASP)方法对蛋白进行酶解：在10KD的超滤管中加入300μg蛋白溶液，600RPM震荡1min,14000g，20min离心，加入100μL 8M Urea，600RPM震荡1min，并14000g，20min离心，并重复一次；加入100μL 50mM NH₄HCO₃，600RPM震荡1min，并14000g，20min离心，并重复两次；更换超滤管套管，加入1fmol/μg BSA(300μg蛋白应加入19.929ng BSA)，并加入50mM NH₄HCO₃溶液，使总溶液体积保持在50-60uL，加入胰蛋白酶3-6μg，37℃过夜消化。

(3)对酶解后的肽段进行ziptip法脱盐，制备得到样品混合肽段；

(4)混合肽段的高效液相色谱(HPLC)分离：

A相：2％CH₃CN，98％H₂O，NH₃H₂O调pH 10.0；

B相：98％CH₃CN，2％H₂O。

300μg的混合肽段用80μL A相溶解，样品进样量为80μL。混合肽段溶液于C18XBridge BEH-130柱子上根据其亲水性进行分离，流动相梯度设置为：0-3min，100％A相，3-25min，流速始终保持为0.7mL/min。紫外检测器UV设置为214nm，根据样品分离的色谱图，在大约10min时用1.5mL离心管收集液相分离馏分，每管收集1min，即0.7mL，最终收集90个组分，并按照收集的时间顺序对90个组分编号1～90。将90个组分于SpeedVac中真空干燥。用乙腈水混合液(50％乙腈，50％水)溶解90个组分交叉合并为20个组分，即1,21,41,61和81号五个组分合并为1号组分，2,22,42,62和82号五个组分合并为2号组分，以此类推，最终得到1～20号组分。将最终得到的20个组分于SpeedVac中真空干燥，于-80℃贮存。

(5)纳流液相色谱-串联质谱分析

纳流液相色谱分离：A相：10％CH₃CN,90％H₂O，1％甲酸；B相：1％甲酸溶解在90％CH₃CN,10％H₂O中。

每个样品分别用13.5μL A相溶解，样品进样量为4μL，纳流液相质谱分析系统为Orbitrap Elite(Thermo Scientific)。样品分离之前分别用4μL A相平衡自制的预柱和分析柱。预柱和分析柱的规格分别为：预柱(4cm×150μm I.D.,C18填料粒径5μm,)，分析柱(30cm×75μm I.D.,C18填料填充，粒径3μm, Dr.Maisch GmbH,Germany)。平衡之后样品在A相的带动下首先载样于预柱，然后在不同梯度下进行液相分离。150min色谱梯度变化如下：5-32％流动相B100min,32-80％流动相B，20min,80％流动相B，30min.流速始终保持在300nL/min。经过纳流液相分离的样品直接进入ESI离子喷雾源并进入Orbitrap Elite质谱仪中进行质谱检测。

质谱数据采集：350-1800m/z的全扫描，分辨率为60,000(m/z 200)。二级图谱扫描时，活化时间为10ms，隔离宽度为2m/z。碎裂方式为诱导碰撞解离(collision-induceddissociation,CID)，归一化碰撞能量设定为35％，动态排出时间为90s。

(6)质谱数据分析

利用Proteome Discoverer软件把得到的质谱RAW数据转换成MGF文件，并利用Mascot和Maxquant进行Uniprot Human数据库搜索。

Maxquant搜库参数为，蛋白酶：胰蛋白酶(Trypsin)；最多允许遗漏酶切位点：2个；固定修饰：半胱氨酸的烷基化；一级谱搜索误差：20ppm；最小肽段长度：7个氨基酸；肽段、蛋白和蛋白修饰FDR设置为1％。

Maxquant得到的蛋白数据过滤掉污染蛋白和反库蛋白信息进行如下分析：Maxquant搜库得到的蛋白数据以检测特异肽段数(unique peptides>3)进行初筛，然后以BSA蛋白信号强度为标准，计算每个样本中蛋白的相对检测丰度。将正常与患病组的蛋白按照其相对检测丰度的T检验(p<0.05)和比值(ratio>2)进行筛选，从而得到差异蛋白。然后利用SPSS软件作出差异蛋白ROC曲线，并计算其曲线下面积(AUC)，进而判断其诊断价值。

二、实验结果分析

经过质谱数据分析，PGAM5蛋白检测特异肽段数11条，蛋白可信度高，经比较发现这一蛋白在少弱精样本中显著下调4.1倍，p值为7.0E-11<<0.05.

图1中ROC分析显示PGAM5蛋白的AUC为0.940>0.7，说明具有较好的诊断效果，在相对检验丰度为0.00591时，灵敏度为85.7％，特异度为87.3％。当进行个体检测时，相对检验丰度小于0.00591时，被判为少弱精患者(假阳性率为12.7％)。

下面比较了PGAM5蛋白在健康和少弱精样本的检测相对丰度(图2)，可以看出这一蛋白在健康人样本中相对检测丰度为0.013而在病理样本中为0.003(图中实线)，并且其中位数(虚线)相差较远，说明在少弱精样本中这一蛋白有较大程度地增加。

鉴于上述结果，PGAM5蛋白可以作为少弱精子症的潜在特异蛋白标志物，从而对这一病症进行预测。

实施例2临床检测验证

根据实例1的方法首先对收集到的10组少弱精子症患者精子进行蛋白提取和纳流液相色谱-串联质谱分析，每组数据进行三次重复，然后对质谱数据进行分析。表1示出了分析结果，利用上述方法10人被检测出少弱精子症。本组数据准确率高达100％。

表1

续表

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以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。