阅读说明：本技术 判断肠道内肠碱性磷酸酶活性水平的检测方法及相关应用 (Detection method for judging activity level of intestinal alkaline phosphatase in intestinal tract and related application ) 是由 高辰哲 李傲辰 徐庆 李鑫荣 韩建春 惠觅宙 于 2020-02-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种判断肠道内肠碱性磷酸酶活性水平的检测方法及相关应用,属于检测领域。本发明通过尿液pH检测来间接判断胃肠道酸碱负荷水平和肠道内pH相关肠碱性磷酸酶活性水平,胃肠道酸碱负荷和尿液pH呈正相关的关系,肠道内碱负荷时与肠碱性磷酸酶活性水平呈正相关,并可判断通过服用肠碱化制剂在治疗肠道碱性磷酸酶活性相关疾病的食用剂量和疗效。本研究还表明通过服用肠碱化制剂(例如：含有微胶囊包膜丁酸钠的肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质爆膨颗粒)治疗后尿液pH达到6.4或以上时的剂量有利于治疗肠道碱性磷酸酶活性相关疾病(高血糖、高血脂和结肠炎)的治疗。本发明通过尿液pH检测快捷、简单有效。(The invention discloses a detection method for judging the activity level of intestinal alkaline phosphatase in an intestinal tract and related application, and belongs to the field of detection. According to the invention, the acid-base load level of the gastrointestinal tract and the pH-related intestinal alkaline phosphatase activity level in the intestinal tract are indirectly judged through urine pH detection, the acid-base load of the gastrointestinal tract and the urine pH are in a positive correlation, the alkali load in the intestinal tract and the intestinal alkaline phosphatase activity level are in a positive correlation, and the edible dosage and the curative effect of treating the intestinal alkaline phosphatase activity-related diseases by taking the intestinal alkalizing preparation can be judged. The study also shows that the dose at which the urine pH reaches 6.4 or above after treatment by taking an enteroalkalizing agent (e.g., enteroalkalizing and fat absorption blocking mineral bursting pellets containing microcapsule-coated sodium butyrate) is beneficial for treating diseases related to the intestinal alkaline phosphatase activity (hyperglycemia, hyperlipidemia and colitis). The invention is fast, simple and effective in urine pH detection.)

判断肠道内肠碱性磷酸酶活性水平的检测方法及相关应用

技术领域

本发明涉及检测领域，特别是涉及一种判断肠道内肠碱性磷酸酶活性 水平的检测方法及相关应用。

背景技术

2型糖尿病是当组织不能产生足够的胰岛素和不能有效地使用胰岛素 (胰岛素抵抗)时而发生的慢性代谢性疾病。组织胰岛素抵抗和胰岛素的产 生不足导致长期血糖水平升高，对眼睛、心脏、肾脏和足部产生不利影响 称之为糖尿病并发症(1)。2型糖尿病经常伴发高血脂、高血压和肥胖，称 之为代谢综合症。因此，2型糖尿病一般是代谢综合症的一部分(2)。

近年来的大样本人类研临床究表明代谢综合征(高血压、高血脂、高 血糖)患者的尿pH普遍小于5.5，提示酸性尿是采用尿样本诊断代谢综合 征和“肠漏”可靠方法(3、4)；还有文献表明肠道碱性磷酸酶活性降低是高 血糖、高血脂和结肠炎的发病原因(5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23)。肠道碱性磷酸酶的活性主要取决 于pH水平，在碱性pH条件下，肠道碱性磷酸酶才有活性。而传统检测碱 性磷酸酶的方法，是通过粪便取样检测，检测试剂和检测方法费用相对较 高，不利于推广。

参考文献

1.Type 2Diabetes Mellitus:A Review of Current TrendsType 2DiabetesMellitus:A Review of Current Trends.Abdulfatai B.Olokoba,1,*OlusegunA.Obateru,2and Lateefat B. Olokoba3

2.A Comprehensive Review on Metabolic Syndrome.Jaspinder Kaur*Authorinformation Article notes Copyright and License information Disclaimer

3.Shimodaira M,Okaniwa S,Nakayama T.Fasting Single-Spot Urine pH IsAssociated with Metabolic Syndrome in the Japanese Population[J].MedicalPrinciples and Practice, 2017,26(5):433-437.

4.Cho Y H,Lee S Y,Jeong D W,et al.The Association between a Low UrinepH and the Components of Metabolic Syndrome in the Korean Population:FindingsBased on the 2010 Korea National Health and Nutrition Examination Survey[J].Journal of Research in Medical Sciences,2014,19(7):599-604.

5.Kaooru Geddes and Dana J Philpott(2008),Anew role for intestinalalkaline phosphatase in gut barrier maintenance,Gastroenterology,135:8-12.

6.Jean-Paul Lalles(2014),Luminal ATP:the missing link betweenintestinal alkaline phosphatase,the gut microbiota,and inflammation？Am JPhysiol Gastrointest Liver Physiol, 306:G824-G825.

7.Jean-Paul Lalles(2016),Intestinal alkaline phosphatase:novelfunctions andprotective effects,Nutrition Reviews,72(2):82-94.

8.Mehrbodet al(2014),interplay between intestinal alkalinephosphatase,diet,gut microbes and immunity,World Journal of Gastroenterology,20(42):15650-15656.

9.Cani et al(2007),metabolic endotoxemia initiates obesity andinsulin resistance, Diabetes,56:1761-1772.

10.Jason Fawley and David M.Gourlay(2016),Intestinal alkalinephosphatase:a summary of its role in clinical disease,Journal of SurgicalResearch,202(1):1225-1234.

11.Kiffe-Moreira and Milan et al(2014),Catalytic signature of a heat-stable,chimeric human alkaline phosphatase with therapeutic potential,PlosOne，9(2):e89374.

12.Takanari Nakano,Ikuo Inoue,Iwao Koyama,Kenta Kanazawa,Koh-ichiNakamura,Sonoko Narisawa and Al(2007),Disruption of the murine intestinalalkaline phosphatase gene Akp3 impairs lipid transcytosis and inducesvisceral fat accumulation and hepatic steatosis.Am J Physiol GastrointestLiver Physiol 292:G1439-G1449.

13.Jean-Paul Lalles(2015),Intestinal alkaline phosphatase in stool:Anovel biomarker for metabolic diseases,EBioMedicine,2:1866.

14.Sonoko Narisawa,Lei Huang,Arata Iwasaki,Hideaki Hasegawa,David H.Alpers,and Jose Luis Millan(2003),Accelerated Fat Absorption in IntestinalAlkaline Phosphatase Knockout Mice.MOLECULAR AND CELLULAR

BIOLOGY,23(21):7525–7530.

15.Kanakaraju Kaliannan,Sulaiman R.Hamarneh,KonstantinosP.Economopoulos,Sayeda Nasrin Alam,Omeed Moaven,Palak Patel,Nondita S.Malo,Madhury Ray,M.Abtahi,Nur Muhammad,Atri Raychowdhury,Abeba Teshager,MussaM.Rafat Mohamed,Angela K.Rizwan Ahmed,Shahrad Hakimian,Sonoko Narisawa,JoseLuis Millan, Elizabeth Hohmann,H.Shaw Warren,Atul K.Bhan,Madhu S.Malo,andRichard A.Hodin(2013),Intestinal alkaline phosphatase prevents metabolicsyndrome in mice, PNAS,110(17):7003-7008.

16.Malo M S.AHigh Level of Intestinal Alkaline Phosphatase IsProtective against Type 2Diabetes Mellitus Irrespective of Obesity[J].Ebiomedicine,2015,2(12):2016-2023.

17.Poelstra K,BakkerWW,Klok PA,Hardonk MJ,Meijer DK(1997),Aphysiologic function for alkaline phosphatase:endotoxin detoxification.LabInvest,76:319–327.

18.Poelstra K,Bakker WW,Klok PA,Kamps JA,Hardonk MJ,Meijer DK(1997),Dephosphorylation of endotoxin by alkaline phosphatase in vivo,Am JPathol.151(4):1163-9.

19.Bentala H,Verweij WR,Huizinga-Van der Vlag A,van Loenen-WeemaesAM, Meijer DK,Poelstra K(2002),Removal of phosphate from lipid A as astrategy to detoxify lipopolysaccharide,Shock,18(6):561-6.

20.Jennifer et al(2007),Intestinal alkaline phosphatase detoxifieslipopolysaccharide and prevents inflammation in response to the gutmicrobiota,Cell Host Microbe, 2(6):371-382.

21.Beumer et al(2003)Calf intestinal alkaline phosphatase,a noveltherapeutic drug for lipopolysaccharide(LPS)-mediated diseases,attenuates LPStoxicity in mice and piglets, 307(2):737-744.

22.Esther et al(2016),Pharmacokinatic modeling and dose selection inarandomized,double-blind,placebo-controled trial of a human recombinantalkaline phosphatase in healthy volunteers,Clin Pharmacokinet,55:1227-1237.

23.Milanet al(2010),Exogenous alkaline phosphatase for the treatmentof patients with moderate to severe ulcerative colitis,Inflamm Bowel Dis,16(7):1180-1186.

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能够快速判断肠道内肠碱性磷酸 酶活性水平的检测方法及相关应用，并通过检测尿液pH变化，判断肠碱化 制剂(含有微胶囊包膜丁酸钠(或联合使用胶囊或肠溶胶囊或肠溶包片包 裹的微胶囊包膜丁酸钠)的肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质爆膨颗粒在)治 疗与碱性磷酸酶相关的代谢疾病过程中的效果检验方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种判断肠道内肠碱性磷酸酶活性水平的检测方 法，通过尿液pH检测来间接判断胃肠道酸碱负荷水平和肠道内pH相关肠 碱性磷酸酶活性水平，胃肠道酸碱负荷和尿液pH呈正相关的关系，肠道内 碱负荷时与肠碱性磷酸酶活性水平呈正相关。

通过尿液pH检测来判断胃肠道酸碱负荷，并判断碱性磷酸酶活性水 平：尿液pH为碱性时的肠道内的碱性磷酸酶活性水平大于pH为酸性时的 碱性磷酸酶活性水平。

本发明的发明人先假说代谢综合征(高血压、高血脂、高血糖)患者 酸性尿pH(4.5-5.5)可能是由于胃肠道酸性负荷过高造成，既食用过多促 进胃酸分泌的高脂和高蛋白食物造成。为了研究酸性和碱性食物与肠道酸 碱负荷和尿pH的相关性，发现采用尿pH测定判断肠道酸碱负荷和肠道碱 性磷酸酶活性水平的方法，通过尿pH判断肠道酸碱负荷，在尿pH为碱性 时，说明肠道碱负荷较高，从而间接说明肠道内的碱性磷酸酶活性处于较 高水平，这对治疗一些肠道碱性磷酸酶活性相关疾病，例如高血糖、高血 脂和结肠炎等，具有重要的指导作用，例如通过服用肠碱化制剂(含有微 胶囊包膜丁酸钠(或联合使用胶囊或肠溶胶囊或肠溶包片包裹的微胶囊包 膜丁酸钠)的肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质爆膨颗粒)提高肠道内的碱负 荷，使碱性磷酸酶处于较高的活性水平，从而起到治疗肠道碱性磷酸酶活 性相关疾病的作用。

进一步地，所述肠碱性磷酸酶活性是灭活内毒素、抑制人血白细胞和 血管内皮细胞分泌炎症因子TNF-ɑ和抑制人白细胞移走的活性。即通过尿 液pH来判断碱性磷酸酶的活性，从而判断其灭活内毒素、抑制人血白细胞 和血管内皮细胞分泌炎症因子TNF-ɑ和抑制人白细胞移走的活性。

进一步地，所述肠碱性磷酸酶活性通过能改变尿液pH的肠碱化制剂来 诱导和增强。

进一步地，所述肠碱化制剂为含有微胶囊包膜丁酸钠的肠碱化和脂肪 吸收阻断矿物质爆膨颗粒制剂。

进一步地，所述肠碱化制剂为肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质爆膨颗粒 制剂和胶囊或肠溶胶囊或肠溶包片包裹的微胶囊包膜丁酸钠。

进一步地，所述肠碱化制剂为含有微胶囊包膜丁酸钠的肠碱化和脂肪 吸收阻断矿物质药物或肠道碱化矿物质食品。

进一步地，所述肠碱化制剂为肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质药物或肠 道碱化矿物质食品和胶囊或肠溶胶囊或肠溶包片包裹的微胶囊包膜丁酸 钠。。

通过尿液pH判断肠碱性磷酸酶活性水平，从而可以判断通过食用肠碱 化制剂增加肠道碱负荷提高碱性磷酸酶活性，使尿液pH升高，从而判断通 过服用肠碱化制剂治疗碱性磷酸酶活性降低的相关疾病的食用剂量和疗 效。

另一方面，提供一种判断用于治疗肠道碱性磷酸酶活性降低的相关疾 病的肠碱化制剂的使用剂量和疗效的检验方法，通过尿液pH检测判断肠碱 化制剂在治疗肠道碱性磷酸酶活性降低的相关疾病的使用剂量和疗效。

进一步地，通过对服用所述肠碱化制剂的肠道碱性磷酸酶活性降低的 相关疾病患者的晨尿pH进行检测：尿液pH≦5.5时，需要使用肠碱化制剂 来治疗肠道碱性磷酸酶活性降低的相关疾病；若尿液pH≧6.5，则判断所述 肠碱化制剂能起到治疗肠道碱性磷酸酶活性降低的相关疾病的作用。

进一步地，所述肠道碱性磷酸酶活性降低的相关疾病包括高血压、高 血脂和/或高血糖，该类疾病也属于代谢综合征。

进一步地，所述肠碱化制剂为含有微胶囊包膜丁酸钠的肠碱化和脂肪 吸收阻断矿物质爆膨颗粒制剂。

进一步地，所述肠碱化制剂为肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质爆膨颗粒 制剂和胶囊或肠溶胶囊或肠溶包片包裹的微胶囊包膜丁酸钠。

进一步地，所述肠碱化制剂为含有微胶囊包膜丁酸钠的肠碱化和脂肪 吸收阻断矿物质药物或肠道碱化矿物质食品。

进一步地，所述肠碱化制剂为肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质药物或肠 道碱化矿物质食品和胶囊或肠溶胶囊或肠溶包片包裹的微胶囊包膜丁酸 钠。

服用剂量可以为33g。

再一方面，提供一种判断用于治疗肠道粘膜人白细胞TNF-α分泌增多 相关疾病的肠碱化制剂的使用剂量和疗效的检验方法，通过尿液pH检测判 断肠碱化制剂在治疗肠道粘膜人白细胞TNF-α分泌增多相关疾病的使用剂 量和疗效。

进一步地，通过对服用所述肠碱化制剂的肠道粘膜人白细胞TNF-α分 泌增多相关疾病患者的晨尿pH进行检测，若尿液pH≧6.5，则判断所述肠 碱化制剂能起到治疗肠道粘膜人白细胞TNF-α分泌增多相关疾病的作用。

进一步地，所述肠道粘膜人白细胞TNF-α分泌增多相关疾病包括但不 限于结肠炎。

进一步地，所述肠碱化制剂为含有微胶囊包膜丁酸钠的肠碱化和脂肪 吸收阻断矿物质爆膨颗粒制剂。

进一步地，所述肠碱化制剂为肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质爆膨颗粒 制剂和胶囊或肠溶胶囊或肠溶包片包裹的微胶囊包膜丁酸钠。

进一步地，所述肠碱化制剂为含有微胶囊包膜丁酸钠的肠碱化和脂肪 吸收阻断矿物质药物或肠道碱化矿物质食品。

进一步地，所述肠碱化制剂为肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质药物或肠 道碱化矿物质食品和胶囊或肠溶胶囊或肠溶包片包裹的微胶囊包膜丁酸 钠。。

肠碱化制剂的服用剂量可以为33g。

上述的脂肪吸收阻断矿物质可以为蒙脱石散，也可以配合使用水滑石、 燕麦粉和调味剂等。

由于微胶囊包膜丁酸钠味道不佳，通过胶囊或肠溶胶囊或肠溶包片包 裹微胶囊包膜丁酸钠可提高口感。

再一方面，本发明还提供一种治疗肠道碱性磷酸酶活性降低的相关疾 病的方法，通过服用含有微胶囊包膜丁酸钠(或联合使用胶囊或肠溶胶囊 或肠溶包片包裹的微胶囊包膜丁酸钠)的肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质爆 膨颗粒治疗糖尿病，提高尿液pH，进行治疗肠道碱性磷酸酶活性降低的相 关疾病的方法。

采用这样的设计后，本发明至少具有以下优点：

本发明通过尿液pH检测来判断肠道酸碱度和肠碱性磷酸酶活性水平， 快捷简单有效，特别强调的是可以通过尿液pH判断肠道酸碱度来判断肠道 碱性磷酸酶活性水平，进一步判断肠道碱化药物和食品增强肠碱性磷酸酶 活性的效果，以及肠碱化制剂(例如，含有微胶囊包膜丁酸钠(或联合使 用胶囊或肠溶胶囊或肠溶包片包裹的微胶囊包膜丁酸钠)的肠碱化和脂肪 吸收阻断矿物质爆膨颗粒)在治疗肠碱性磷酸酶活性相关疾病高血糖、高血脂和结肠炎的疗效检测及应用。

附图说明

上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术 手段，以下结合附图与

具体实施方式

对本发明作进一步的详细说明。

图1是本发明研究健康参与者吃酸性食物、碱性食物后尿液pH值比较 实施例示意图；

图2是本发明研究非健康代谢综合征参与者吃酸性食物、碱性食物后 尿液pH值比较实施例示意图；

图3是本发明研究不同pH对重组肠碱性磷酸酶灭活LPS效果的影响实 施例示意图；

图4是本发明研究不同内毒素剂量诱导人外周血白细胞和HUVECs释放 TNF-α的效果实施例示意图；

图5是本发明研究肠碱性磷酸酶抑制人中性粒细胞从胶滴内向胶滴外 培养液中移走结果示意图；

图6是本发明研究肠碱性磷酸酶抑制人单个核细胞从胶滴内向胶滴外 培养液中移走结果示意图。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然附图中显 示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明 而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更 透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域技术人 员。

实施例1

目的：研究代谢手术对2型糖尿病和肥胖症患者的治疗

方法：本研究对长春嘉和外科医院2015-2019年收治的104例重度肥 胖患者和66例肥胖伴有2型糖尿病患者进行调查研究。重度肥胖患者男性 21例，女性83例，年龄15-50岁，平均年龄30.61岁。肥胖伴有2型糖尿 病患者男女各33例，年龄17-68岁，平均年龄41.91岁。通过临床实验室 检测代谢手术治疗前后患者尿pH、血糖、血脂和体重的变化。注：临床研 究经长春嘉和外科医院伦理委员会审批同意。

结果:

代谢手术明显的降低了2型糖尿病患者和肥胖病人的血糖和血脂，显 著升高了糖尿病人和肥胖病人的尿pH水平(表1、2、3、4、5、6、7、8)。

表1.代谢手术降低2型糖尿病患者血糖的效果

表2.代谢手术降低2型糖尿病患者血脂的效果

表3.代谢手术降低2型糖尿病患者体重的效果

表4.代谢手术降低2型糖尿病人的尿pH效果

表5.代谢手术手术降低肥胖病人血糖的效果

表6.代谢手术手术降低肥胖病人血脂的效果

表7.代谢手术降低肥胖病人的体重效果

表8.代谢手术降低肥胖病人的尿pH效果

讨论：微创代谢手术降低了2型糖尿病患者的血糖和血脂(表1、2、3)。 微创代谢手术降低了肥胖病人的血糖、血脂和体重(表5、6、7)。微创代 谢手术(表4、8)意外地升高了糖尿病人和肥胖病人的尿pH水平(p<0.01)。

结论：微创代谢手术能够显著升高尿pH，并能够有效治疗高血糖和高 血脂，治疗高血糖和高血脂的效果可能与尿pH值的升高相关。

实施例2

本发明的发明人假说代谢综合征(高血压、高血脂、高血糖)患者酸 性尿pH(4.5-5.5)可能是由于胃肠道酸性负荷过高造成，既食用过多促进 胃酸分泌的高脂和高蛋白食物造成。为了进一步研究尿和肠道pH水平是否 有关联，进行如下试验方法：

1.健康者与非健康者吃酸吃碱后尿液pH值的比较研究

试验参与者共30人，根据尿液pH是否>6分为2组，分别是健康者组 与非健康者组。两组试验参与者分别于试验第1天至试验第4天晚饭时间 以及睡觉前口服500ml雪碧、8片碳酸氢钠片(0.5g/片)、180g红烧肉(熟)、 180g高温低油低盐炒包菜(熟)。并要求试验参与者从试验第1天至第5天 每天清晨取晨尿检测尿液pH。注：临床研究经长春嘉和外科医院伦理委员 会审批同意。

2.小鼠酸碱饮食后胃、小肠道和尿pH测定

选取20只SPF级C57BL/6小鼠，体重18-22g，适应性喂养一周后将小 鼠随机分为2组，分别是酸性饮食组和碱性饮食组，每组10只。酸性饮食 组每天灌胃1ml雪碧+普通饲料，碱性饮食组每天灌胃0.03g碳酸氢钠水溶 液+普通饲料，试验期间自由饮水，并将动物分开放置在自然光线下，环境 温度(23±1℃)，12小时明亮和黑暗循环。试验期限定为一个月。处死小 鼠之前收集每只小鼠尿液，测定pH值。收集尿液之后，处死小鼠，解剖， 取胃液上清液测定胃液pH，截取小肠，刮取肠道内容物，测定pH。注：动 物实验经东北农业大学食品学院伦理委员会审批同意。

表9.小鼠使用酸碱食物后胃、小肠道和尿pH测定

	食物	胃	小肠	尿	样本数
						pH	酸性食物	2.5±0.2	6.0±0.2	5.0±0.2	10
pH	碱性食物	4.5±0.4	7.5±0.3	7.0±0.3	10

结果：

健康参与者与非健康参与者胃肠道酸负荷过多时，尿液呈酸性，胃肠 道碱负荷过多时，尿液呈碱性，如图1、2所示。

增加小鼠的胃酸负荷降低了小鼠胃和小肠的pH，同时使尿pH呈酸性。 增加小鼠的胃碱性负荷增加了小鼠胃和小肠的pH，同时使尿pH呈碱性(表 9)。试验结果表明胃、小肠道和尿液pH值呈正相关关系，提示尿液pH能 够反映胃肠pH水平，可能是肠道pH的间接测定方法。

讨论：大样本研究表明代谢综合症病人的尿pH水平普遍呈酸性 (pH4.5-5.5)，提示酸性尿pH 4.5-5.5反应了代谢综合征病人(既高血糖 和高血脂病人)胃肠道酸负荷过多，与食用过多刺激胃酸分泌的高脂肪高 蛋白食物有关。本实施例研究结果表明健康人胃肠道酸负荷过多时，尿液 呈酸性，胃肠道碱负荷过多时，尿液呈碱性(图1)。本实施例研究结果还 表明高血糖和高血脂病人尿液呈酸性，使用碱性食物能增加胃肠道碱负荷 使尿液呈碱性(图2)。本实施例的结果还表明给健康人和高血糖和高血脂 病人吃高脂饮食(可以诱导胃酸分泌)和增加胃肠道酸负荷一样，诱导尿 液呈酸性(图1、2)。本实施例研究结果还表明增加小鼠的胃酸负荷和给予 诱导胃酸增多的高脂饮食降低了胃和小肠的pH，同时使尿pH呈酸性(表9)。 增加小鼠的胃碱性负荷，增加了小肠的pH，同时使尿pH呈碱性(表9)。

结论：小鼠实验表明胃、小肠道和尿液pH值呈正相关关系，因此，可 判断尿pH可以间接反应肠道内pH的变化，当食用碱性食物时，能提高胃 肠道碱负荷，使尿液pH呈碱性。

实施例3

目的：人血浆、小肠以及大便内碱性磷酸酶活性测定

方法：分别抽取试验参与者全血至含有肝素钠的无热源采血管中，4℃ 离心(3500g/min，8min)，取血浆；取打碎小肠组织1.00g，添加Tris-Hcl 缓冲液(50mmol/L，pH8.0)10mL；取试验参与者粪便1.00g，添加Tris-Hcl 缓冲液(50mmol/L，pH8.0)10mL，充分震荡混匀，4℃离心(12000g/min， 10min)，取上清液，稀释，利用碱性磷酸酶试剂盒(LeageneBiological Ltd, catalogue#TE0005)，在波长为510nm下测定其活性。

结果：

人小肠含有高浓度的碱性磷酸酶，大量释放进入粪便，累积成更高浓 度的碱性磷酸酶(表10)。

表10.人血浆、大便和小肠碱性磷酸酶活性测定

注：血液中碱性磷酸酶为组织非特异性碱性磷酸酶，主要来源于小肠，肝脏，血管内皮，骨头与中性粒细胞。

讨论：碱性磷酸酶的主要功能是通过脱磷使肠道内大肠杆菌的内毒素 活性降低。大便中碱性磷酸酶活性可以直接反映出肠道碱性磷酸酶活性， Madhu S.Malo等人研究发现代谢综合征患者粪便碱性磷酸酶活性较低，健 康人粪便中碱性磷酸酶活性较高。以上的研究结果表明人小肠含有高浓度 的碱性磷酸酶，大量释放进入粪便，累积成更高浓度的碱性磷酸酶。

结论：人小肠含有高浓度的碱性磷酸酶，大量释放进入粪便，累积成 更高浓度的碱性磷酸酶。

实施例4

目的：不同pH对重组肠碱性磷酸酶灭活LPS效果的影响

方法：将LPS(大肠杆菌0111:B4，sigma)稀释为0.1mg/ml；使用Tris-Hcl(50mmol/L，pH5.0-8.0)缓冲液将重组IAP酶(酶活性为 430.00U/ml)稀释为43.00U/ml。试验分为两组，分别是空白对照组与IAP 酶处理组。空白对照组取0.99ml不同pH的灭活IAP酶稀释液，IAP酶处理 组取0.99ml不同pH的IAP稀释液，两组均添加0.01ml相同pH的LPS溶 液，混合均匀37℃孵育180min。利用内毒素检测鲎试剂盒(试管定量显色 基质法，EC32545S，厦门鲎试剂生物科技股份有限公司)测定内毒素活性。

结果：

碱性磷酸酶灭活LPS活性与酸碱度有关，重组肠碱性磷酸酶recIAP只 在高pH(7.0-8.0)对LPS有显著灭活效果，在pH6.5时灭活LPS效果不 显著(图3)。

讨论：pH 7.0和7.5时LPS活力降低了60％左右；pH 8.0时LPS活力 降低了76.85％。肠碱性磷酸酶可以在pH 7.0-8.0的范围内有效灭活LPS(图 3)。

结论：碱性磷酸酶灭活LPS活性与酸碱度有关：重组肠碱性磷酸酶只 在高pH(7.0-8.0)对LPS有灭活效果(图3)。

因此，本发明的发明人认为通过服用含有微胶囊包膜丁酸钠(或联合 使用胶囊或肠溶胶囊或肠溶包片包裹的微胶囊包膜丁酸钠)的肠碱化和脂 肪吸收阻断矿物质爆膨颗粒后，通过检测尿液pH,间接判断肠道内的酸碱负 荷，当尿液pH为碱性时，代表胃肠道内碱负荷较多，使碱性磷酸酶的活性 处于较高水平，从而指导服用含有微胶囊包膜丁酸钠(或联合使用胶囊或 肠溶胶囊或肠溶包片包裹的微胶囊包膜丁酸钠)的肠碱化和脂肪吸收阻断 矿物质爆膨颗粒来治疗代谢综合征(高血压、高血脂、高血糖)。

实施例5

目的：不同内毒素剂量诱导人外周血白细胞和HUVECs释放TNF-α的效 果。

方法：用培养基培养对照细胞，将人外周血白细胞和HUVECs接种于96 孔板，1×10⁵个/ml，每孔100ul，37℃培养24h。用不同浓度的LPS(0.05、 0.50、1.00、10.00、100.00ng/ml)刺激新鲜提取的人外周血白细胞和 HUVECs，24h后收集细胞上清液。用酶联免疫法(ELISA)测定TNF-α的产 生。

结果：

1.LPS刺激新鲜提取的人外周血白细胞和HUVECs分泌TNF-α。

2.本研究表明0-0.5ng/ml浓度的LPS在人外周血白细胞和HUVECs存 在条件下呈剂量依赖型促进TNF-α分泌。

讨论：与空白对照组相比，0.05ng/ml的LPS可使TNF-α的分泌增加 20％；0.5、1.0、10.0、100.0ng/ml的LPS均能使TNF-α的分泌增加超过 1.9倍并趋于稳定(图4)。该结果表明LPS能刺激新鲜提取的人外周血白 细胞和HUVECs分泌TNF-α，并且LPS以剂量依赖性的方式增加了TNF-α 的释放。

结论：成功建立人肠道粘膜小血管内和炎症区的炎症反应模型。

实施例6

目的：recIAP对脂多糖诱导的体外炎症反应的影响

方法：将recIAP(5、10、20U/ml)和LPS(0.5ng/ml)以两种不同的 方式与新鲜提取的人外周血白细胞和HUVECs孵育24h。第一种是将recIAP (5、10、20U/ml)和LPS(0.5ng/ml)同时加入刺激，24h后收集培养液上 清，用ELISA测定上清液中TNF-α的含量；第二种是在pH7.4的情况下， recIAP(5、10、20U/ml)和LPS(0.5ng/ml)在37℃下提前孵育3h后， 将产物与外周血白细胞和HUVECs孵育24h，用ELISA测定上清液中TNF-α 的含量。

结果：与LPS组相比，recIAP(5U/ml)与LPS提前孵育或共同加入两 种方式均能使TNF-α的含量降低80％(P<0.0001)，且随着recIAP含量的 增加，TNF-α的释放持续降低(表11)。该结果表明，recIAP与LPS同时 加入刺激和recIAP与LPS提前孵育3h再加入刺激这两种方式均能大大减 少TNF-α的释放，recIAP能对LPS诱导的TNF-α的释放有明显的抑制作用， 且这种作用具有剂量依赖性。

表11.recIAP对脂多糖诱导的体外炎症反应的影响

讨论：重组肠碱性磷酸酶在有和无内毒素存在情况下都抑制人白细胞 TNF-α的分泌，是一种非内毒素依赖人白细胞TNF-α分泌抑制剂。因此， 所述的肠碱性磷酸酶制剂或肠碱性磷酸酶活性增强剂可用于治疗肠道粘膜 人白细胞TNF-α分泌增多相关疾病，包括但不限于肠道炎症性疾病结肠炎。

结论：重组肠碱性磷酸酶制剂和肠碱性磷酸酶活性增强剂可用于治疗 肠道粘膜人白细胞TNF-α分泌增多相关疾病。通过服用含有微胶囊包膜丁 酸钠(或联合使用胶囊或肠溶胶囊或肠溶包片包裹的微胶囊包膜丁酸钠) 的肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质爆膨颗粒，提高尿液pH的同时，提高碱性 磷酸酶的活性水平，从而达到治疗肠道粘膜人白细胞TNF-α分泌增多相关 疾病的目的。

实施例7

目的：肠碱性磷酸酶抑制人中性粒和单个核细胞移走研究

方法：新鲜提取的人中性粒细胞和单个核细胞移走研究：(1)称取0.08g 琼脂糖粉溶于10ml蒸馏水中，高压灭菌，放置恒温烘箱备用。(2)本研究 采用糖密度梯度离心法，即人静脉血中性粒细胞分离试剂盒(内毒素 <0.1EU，天津灏洋华科生物科技有限公司)，分离静脉血。常温下采集人静 脉血520g离心20min，分别吸取单个核细胞层(淋巴细胞和少部分单核细 胞)和多核细胞层(中性粒细胞为主)，充***解红细胞，反复清洗两次， 新鲜提取的中性粒细胞和单个核细胞分别用少量PBS培养基重悬，计数， 染色看细胞形态。用1×R1640重悬调整细胞密度至3×108个/ml备用。(3) 将0.8％琼脂糖胶放入37℃水中保温，取500ul琼脂糖与等量2×R1640 (20％FBS+1％P/S)混合；(4)分别取100ul上述混合液与100ul中性粒细 胞悬液和单个核细胞混悬液混合，置37℃水浴；(5)取两个预冷的96孔板，向其中一个冷却的96孔板各孔加入2ul中性粒细胞琼脂糖混合液，另外一 个冷却的96孔板各孔加入2ul单个核细胞琼脂糖混合液，要求在孔底中心 形成直径为2mm的微滴；(6)将铺好胶滴的96孔板放置4℃，15min；(7) 配制含10％FBS、1.0ng/ml LPS+10％FBS、1.0ng/mlLPS+2.5U/ml+10％FBS、 2.5U/ml recIAP+10％FBS的R1640培养基；(8)待孔内琼脂糖微滴凝固后， 将100ul上述试剂分别加入各孔，每组4个平行；(9)加盖后放入37℃恒温 培养箱3h；(10)取出96孔板，置倒置显微镜下观察迁移距离并拍照记录， 运用Image j软件计算细胞运动面积。

结果：

1.肠碱性磷酸酶抑制人中性粒细胞移走研究中

肠碱性磷酸酶抑制人中性粒细胞从胶滴内向胶滴外培养液中移走(胶 滴内含有5％FBS。胶滴外含有10％FBS)。结果表明肠碱性磷酸酶在有和没有 LPS的情况下均抑制人中性粒细胞从胶滴内向胶滴外培养液中移走。使用不 同健康志愿者的中性粒细胞重复本研究两次获得基本相同结果。

肠碱性磷酸酶抑制人单个核细胞从胶滴内向胶滴外培养液中移走(胶 滴内含有5％FBS。胶滴外含有10％FBS)。结果表明肠碱性磷酸酶在有和没有 LPS的情况下均抑制人单个核细胞从胶滴内向胶滴外培养液中移走。使用不 同健康志愿者的中性粒细胞重复本研究两次获得类似结果。

结论：本研究发现肠碱性磷酸酶在有和无内毒素的情况下均抑制人中 性粒细胞和单个核细胞移走和吞噬功能。

实施例8

目的：丁酸钠对人结肠癌细胞HT-29产生人肠碱性磷酸酶IAP活性水 平的研究。

方法：每孔100uL接种1×10⁵个/ml的HT-29细胞(ATCC)于96孔板， 37℃培养24hr。实验当天细胞吸附后，试验组加入终浓度2mM的丁酸钠刺 激HT-29细胞，对照组接入相同体积缓冲液。48h后后收集培养液上清，利 用碱性磷酸酶活性试剂盒(Leagene BiologicalLtd,catalogue#TE0005) 检测其中的IAP活性水平(U/mg细胞总蛋白)。

结果如表3。

表12.丁酸钠对于HT-29产生IAP活性水平的影响

人结肠癌细胞HT-29产生的肠碱性磷酸酶的活性水平极低，丁酸钠明 显增加了肠碱性磷酸酶的活性水平(p<0.001)，

结论：丁酸钠可显著增加HT-29产生IAPd1活性水平,是人IAP诱导剂。

实例9

目的：1、使用含有微胶囊包膜丁酸钠(或联合使用胶囊或肠溶胶囊或 肠溶包片包裹的微胶囊包膜丁酸钠)的肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质爆膨 颗粒口服治疗高血糖、高血脂、高血压；2、通过尿pH检测判断是否口服 含有微胶囊包膜丁酸钠(或联合使用胶囊或肠溶胶囊或肠溶包片包裹的微 胶囊包膜丁酸钠)的肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质爆膨颗粒产生作用并调 整口服剂量。

方法：经长春嘉和外科医院的医学伦理委员会批准，招募患有轻度高 血糖、高血脂与高血压的受试者128名，男59名，女69名，年龄60.7±13.1 岁，记录受试者的相关数据(即治疗前)。不停用胰岛素或口服降糖药或改 变药物剂量下，每日早晚两餐前两次口服含有微胶囊包膜丁酸钠的肠碱化 和脂肪吸收阻断矿物质爆膨颗粒33克(肠道碱化矿物质水滑石9.11克结合 脂肪(包括脂溶性内毒素)吸收阻断矿物质蒙脱石粉3.64克、3克丁酸钠和保护剂膨化燕麦粉颗粒12.75克、木糖醇4.50g)，连续4周后(30d)，记 录受试者的相关数据，并比较治疗前后、空腹及餐后血糖、糖化血红蛋白、 体重、甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、舒张压、收缩 压、尿pH变化。

患者参与服用药物统计为128人：只服用二甲双胍44人，只服用消渴 丸32人，二甲双胍+胰岛素23人，二甲双胍+消渴丸12人，二甲双胍+格 列齐特6人，二甲双胍+降糖宁3人，二甲双胍+糖适平4人，二甲双胍+ 阿卡波糖+胰岛素1人，不服用药物为3人。

结果：

使用含有微胶囊包膜丁酸钠(或联合使用胶囊或肠溶胶囊或肠溶包片 包裹的微胶囊包膜丁酸钠)的肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质爆膨颗粒治疗 糖尿病人的高血糖水平的研究。

不停用胰岛素或口服降糖药或改变药物剂量，只观察治疗前后血糖的 降低情况。

表13治疗前后血糖变化水平。

从表13可知，服用含有微胶囊包膜丁酸钠(或联合使用胶囊或肠溶胶 囊或肠溶包片包裹的微胶囊包膜丁酸钠)的肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质 爆膨颗粒治疗前，代表糖尿病的糖化血红蛋白(％)平均高达9.2％,而在服 用含有微胶囊包膜丁酸钠(或联合使用胶囊或肠溶胶囊或肠溶包片包裹的 微胶囊包膜丁酸钠)的肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质爆膨颗粒治疗后，代 表糖尿病的糖化血红蛋白(％)平均降为8.1％，说明含有微胶囊包膜丁酸 钠(或联合使用胶囊或肠溶胶囊或肠溶包片包裹的微胶囊包膜丁酸钠)的 肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质爆膨颗粒有改善糖尿病患者的糖化血红蛋白 的水平，改善了患者的体质。

不停用胰岛素或口服降糖药或改变药物剂量，只观察治疗前后血脂的 降低情况。

表14治疗前后血脂变化水平。

从表14可知，服用含有微胶囊包膜丁酸钠(或联合使用胶囊或肠溶胶 囊或肠溶包片包裹的微胶囊包膜丁酸钠)的肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质 爆膨颗粒治疗前后，代表高血脂与高血压的甘油三脂、胆固醇、低密度脂 蛋白均有明显下降，说明含有微胶囊包膜丁酸钠(或联合使用胶囊或肠溶 胶囊或肠溶包片包裹的微胶囊包膜丁酸钠)的肠碱化和脂肪吸收阻断矿物 质爆膨颗粒有改善高血脂与高血压患者的甘油三脂、胆固醇、低密度脂蛋白的水平，改善了患者的体质。

不停用胰岛素或口服降糖药或改变药物剂量，只观察治疗前后血压的 降低情况。

表15治疗前后血压与体重变化水平。

从表15可知，服用含有微胶囊包膜丁酸钠(或联合使用胶囊或肠溶胶 囊或肠溶包片包裹的微胶囊包膜丁酸钠)的肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质 爆膨颗粒治疗前后，代表舒张压与收缩压均有明显下降，说明含有微胶囊 包膜丁酸钠(或联合使用胶囊或肠溶胶囊或肠溶包片包裹的微胶囊包膜丁 酸钠)的肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质爆膨颗粒有改善高血压患者的血压 水平，改善了患者的体质。

结论：4周口服含有微胶囊包膜丁酸钠(或联合使用胶囊或肠溶胶囊或 肠溶包片包裹的微胶囊包膜丁酸钠)的肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质爆膨 颗粒有效减少糖尿病人的血糖水平(p<0.01)；4周口服含有微胶囊包膜丁 酸钠(或联合使用胶囊或肠溶胶囊或肠溶包片包裹的微胶囊包膜丁酸钠) 的肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质爆膨颗粒明显降低了胆固醇、甘油三酯和 低密度脂蛋白(p<0.01),对于高密度脂蛋白的提升不明显(p>0.05)；4周 口服含有微胶囊包膜丁酸钠(或联合使用胶囊或肠溶胶囊或肠溶包片包裹 的微胶囊包膜丁酸钠)的肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质爆膨颗粒有效治疗 还缓解了高血压(p<0.05)。本研究发现治疗前后体重无显著性变化 (p>0.05)，提示以上治疗效果与体重无关。

使用尿pH试纸测定含有微胶囊包膜丁酸钠(或联合使用胶囊或肠溶胶 囊或肠溶包片包裹的微胶囊包膜丁酸钠)的肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质 爆膨颗粒治疗糖尿病人的尿pH水平的研究。

表16治疗前后测定尿pH变化水平。

从表16可知，服用含有微胶囊包膜丁酸钠(或联合使用胶囊或肠溶胶 囊或肠溶包片包裹的微胶囊包膜丁酸钠)的肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质 爆膨颗粒治疗前后，糖尿病人尿pH明显上升，说明含有微胶囊包膜丁酸钠 (或联合使用胶囊或肠溶胶囊或肠溶包片包裹的微胶囊包膜丁酸钠)的肠碱 化和脂肪吸收阻断矿物质爆膨颗粒有改善糖尿病患者尿pH，改善了患者的 体质，说明通过尿液pH能够间接判断服用肠碱化制剂在治疗糖尿病人疗效，具有指导意义。

结论：本研究还发现含有微胶囊包膜丁酸钠(或联合使用胶囊或肠溶 胶囊或肠溶包片包裹的微胶囊包膜丁酸钠)的肠碱化和脂肪吸收阻断矿物 质爆膨颗粒治疗后尿pH明显升高，提示小肠碱负荷增加和肠道pH升高， 进一步增加肠碱性磷酸酶活性和灭活LPS效果。4周口服含有微胶囊包膜 丁酸钠(或联合使用胶囊或肠溶胶囊或肠溶包片包裹的微胶囊包膜丁酸钠) 的肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质爆膨颗粒有效增强了肠道pH水平 (p<0.01)。

实例10

目的：研究低剂量含有微胶囊包膜丁酸钠(或联合使用胶囊或肠溶胶 囊或肠溶包片包裹的微胶囊包膜丁酸钠)的肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质 爆膨颗粒口服治疗结肠炎的临床效果。

方法：使用低剂量含有微胶囊包膜丁酸钠(或联合使用胶囊或肠溶胶 囊或肠溶包片包裹的微胶囊包膜丁酸钠)的肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质 爆膨颗粒(见实施例3)口服治疗患有轻度结肠炎(偶有脓血便，大便次数>3 次/天，轻度腹部不适)的受试者15例。受试者每次口服含有微胶囊包膜丁 酸钠的肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质爆膨颗粒33克，每日两次，共治疗4 周；观察受试者治疗前后脓血便，大便次数，腹部不适的改善情况(见表22)。注：可以使用商业化获得胶囊或肠溶胶囊或肠溶包片与混合物一起服 用。

结果：

表17显示15例患有轻度结肠炎的受试者治疗4周前后脓血便，大便次 数，腹部不适的改善情况。

表17.每日两次每次33克口服含有微胶囊包膜丁酸钠(或联合使用胶 囊或肠溶胶囊或肠溶包片包裹的含有3g微胶囊包膜丁酸钠)的肠碱化和脂 肪吸收阻断矿物质爆膨颗粒治疗4周前后患有结肠炎的受试者的症状和体 征情况。

结论：口服含有微胶囊包膜丁酸钠(或联合使用胶囊或肠溶胶囊或肠 溶包片包裹的微胶囊包膜丁酸钠)的肠碱化和脂肪吸收阻断矿物质爆膨颗 粒有效治疗结肠炎。

综上所述，本发明通过尿液pH可以间接判断肠道酸碱负荷和肠碱性磷 酸酶的活性水平，并可以此判断服用肠碱化制剂在治疗肠碱性磷酸酶活性 降低的相关疾病(高血糖、高血脂和/或结肠炎)的食用剂量和疗效，同时 能够判断服用肠碱化制剂在治疗肠道粘膜人白细胞TNF-α分泌增多相关疾 病(包括但不限于结肠炎)的食用剂量和疗效。通过尿液pH检测提供一种 新的治疗相关疾病的思路和方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式 上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、 等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。