阅读说明：本技术 一种活性污泥碱性磷酸酶活性测定方法 (Method for determining activity of alkaline phosphatase in activated sludge ) 是由 赵林 龙莎 于 2019-10-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种活性污泥碱性磷酸酶活性测定方法,主要步骤为：(1)标准曲线绘制、(2)样品测定和(3)碱性磷酸酶活性计算；所述步骤(2)样品测定分为酶反应和测试分析两部分。酶反应具体步骤为：取5mL活性污泥混合液,加2mL甲苯,37℃下200r/min水浴振荡15min后,加入10mL 0.5％磷酸苯二钠,仔细摇匀后,37℃下140r/min水浴振荡培养16h；测试分析具体步骤为：将酶反应液全部转移至50mL比色管,加蒸馏水定容至50mL,使甲苯在刻度线以上,摇匀并静置5min使液面分层,取下层反应液,亲水PTFE滤膜过滤；吸取3mL滤液于50mL比色管中,每管加入5mL pH9.4硼酸盐缓冲液和200μL氯代二溴对苯醌亚胺试剂,显色后稀释至刻度,摇匀；30min后在分光光度计上610nm处比色。(The invention discloses a method for measuring the activity of alkaline phosphatase in activated sludge, which mainly comprises the following steps: (1) drawing a standard curve, (2) measuring a sample and (3) calculating the activity of alkaline phosphatase; the sample determination in the step (2) is divided into two parts of enzyme reaction and test analysis. The enzyme reaction comprises the following specific steps: taking 5mL of activated sludge mixed solution, adding 2mL of toluene, oscillating in a water bath at 37 ℃ and 200r/min for 15min, adding 10mL of 0.5% disodium phenyl phosphate, carefully shaking up, and oscillating and culturing in a water bath at 37 ℃ and 140r/min for 16 h; the specific steps of the test analysis are as follows: transferring all enzyme reaction liquid to a 50mL colorimetric tube, adding distilled water to a constant volume of 50mL, enabling toluene to be above a scale mark, shaking up and standing for 5min to enable the liquid level to be layered, taking down the reaction liquid at the lower layer, and filtering with a hydrophilic PTFE filter membrane; 3mL of filtrate is sucked into a 50mL colorimetric tube, 5mL of pH9.4 borate buffer solution and 200 mu L of chloro dibromo-p-benzoquinone imine reagent are added into each tube, and the tube is diluted to scale after color development and shaken up; after 30min the colour was taken at 610nm on a spectrophotometer.)

一种活性污泥碱性磷酸酶活性测定方法

技术领域

本发明属于微生物活性测定技术领域，特别涉及废水生物处理工艺中活性污泥碱性磷酸酶活性的测定方法。

背景技术

磷酸酶是一种磷酸酯水解酶，主要形式有碱性磷酸酶、酸性磷酸酶和磷酸二脂酶，广泛存在于自然界中，如人体，动植物，土壤，沉积物，污泥等。碱性磷酸酶是一种非特异性磷酸酯水解酶，在碱性条件下具有较高的活性，能够催化磷酸脂的水解和多聚磷酸盐的降解，并参与蛋白质、多糖、脂质、核酸等有机物的代谢活动，对自然界磷代谢起着重要的作用。

污水生物处理工艺主要以活性污泥为主体。污水中的有机磷化合物经胞外的碱性磷酸酶水解后，可以被微生物吸收和利用。因此，活性污泥碱性磷酸酶活性可用来表示活性污泥分解有机磷能力的高低。了解活性污泥碱性磷酸酶活性有助于深入了解有机物的生物降解过程和生物除磷过程，从而为污水处理工艺的升级改造提供思路。然而，目前的研究大部分是以土壤、水体和沉积物等为研究对象，只有少量研究关注到污水处理过程的碱性磷酸酶活性。碱性磷酸酶活性的测定方法早期是针对土壤样品提出的，然而土壤和活性污泥的性状和组成有差异，目前没有测定活性污泥碱性磷酸酶活性的标准方法。

发明内容

本发明提出一种活性污泥碱性磷酸酶活性测定方法，参考土壤磷酸酶活性的测定方法，但是根据活性污泥的特点加以修改，从而提高活性污泥碱性磷酸酶活性测定的可操作性及精确性。

本发明的技术方案是一种活性污泥碱性磷酸酶活性测定方法包括三个部分，标准曲线绘制、样品测定和碱性磷酸酶活性计算。

(1)标准曲线绘制。称取1g重蒸酚溶于1L蒸馏水中，得1g/L酚原液。取10mL酚原液，用蒸馏水稀释至1L，得10mg/L酚工作液。称取0.125g氯代二溴对苯醌亚胺溶于10mL 96％乙醇溶液，贮于棕色瓶中，4℃保存，保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液，置于50mL比色管中，每管加入5mL pH9.4硼酸盐缓冲液和200μL氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，摇匀。30min后在分光光度计上610nm处比色。以酚浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作图，即得到标准曲线。对标准曲线进行线性回归，即得标准方程。

(2)样品测定。样品测定分为酶反应和测试分析两部分。

其中酶反应具体步骤为：取5mL活性污泥混合液，置于50mL具塞三角瓶中，加2mL甲苯，37℃下200r/min水浴振荡15min后，加入10mL 0.5％磷酸苯二钠(pH9.4硼酸盐缓冲液配制)，仔细摇匀后，37℃下140r/min水浴振荡培养16h。

其中测试分析具体步骤为：将酶反应液全部转移至50mL比色管，加蒸馏水定容至50mL，使甲苯在刻度线以上，摇匀并静置5min使液面分层，取下层反应液，0.45微米亲水PTFE滤膜过滤。吸取3mL滤液于50mL比色管中，每管加入5mL pH9.4硼酸盐缓冲液，和200μL氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，摇匀。30min后在分光光度计上610nm处比色。

(3)碱性磷酸酶活性计算

碱性磷酸酶活性，以16h后1g(干重)活性污泥中释放出的酚的毫克数表示。通过上一步骤样品测定得到610nm处吸光度，将其带入标准方程，得到酚浓度c。将活性污泥样品的酚浓度、污泥浓度及其他指标带入公式(1)，计算得到活性污泥碱性磷酸酶活性。

c－根据标准方程得的酚浓度，mg·mL^-1；

V－显色液体积，50mL；

ts－分取倍数，50/3；

m－污泥干重，g；

m＝5mL×污泥浓度MLSS；

t－16h。

有益效果

本发明参考土壤磷酸酶活性的测定方法，针对活性污泥的特点，提出了一种活性污泥碱性磷酸酶活性测定方法，对酶反应体系，反应条件，反应时间，分析步骤，计算方式提供具体指导，碱性磷酸酶活性测定结果标准偏差≤0.433mg·g^-1·h^-1。

本发明提供的活性污泥碱性磷酸酶活性测定方法易操作，精确性好，可重复性高。

附图说明

图1标准曲线。

具体实施方式

以下结合具体实施例来对本发明做详细的说明。本发明的实施例是为了更好地使本领域的技术人员更好地理解本发明，并不对本发明作任何的限制。具体实施方式包括三个步骤：标准曲线绘制、样品测定和碱性磷酸酶活性计算

(1)标准曲线绘制。称取1g重蒸酚溶于1L蒸馏水中，得1g/L酚原液。取10mL酚原液，用蒸馏水稀释至1L，得10mg/L酚工作液。称取0.125g氯代二溴对苯醌亚胺溶于10mL 96％乙醇溶液，贮于棕色瓶中，4℃保存，保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液，置于50mL比色管中，每管加入5mL pH9.4硼酸盐缓冲液和200μL氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，摇匀。30min后在分光光度计上610nm处比色，结果如表1所示。

表1标准曲线吸光度

以酚浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作图，即得到标准曲线，结果如图1所示：

对标准曲线进行线性回归，即得标准方程:

y＝252.68x+0.0021 (2)

R²＝0.9998

式中，x为酚浓度(mg/mL)，y为吸光度。

(2)样品测定。样品测定分为酶反应和测试分析两部分。

其中酶反应具体步骤为：取5mL活性污泥混合液，置于50mL具塞三角瓶中，加2mL甲苯，37℃下200r/min水浴振荡15min后，加入10mL 0.5％磷酸苯二钠(pH9.4硼酸盐缓冲液配制)，仔细摇匀后，37℃下140r/min水浴振荡培养16h。

其中测试分析具体步骤为：将酶反应液全部转移至50mL比色管，加蒸馏水定容至50mL，使甲苯在刻度线以上，摇匀并静置5min使液面分层，取下层反应液，0.45微米亲水PTFE滤膜过滤。吸取3mL滤液于50mL比色管中，每管加入5mL pH9.4硼酸盐缓冲液，和200μL氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，摇匀。30min后在分光光度计上610nm处比色。

取不同来源的4份活性污泥样品，按上述酶反应和测试分析步骤进行测定，设置两个平行样，结果如表2所示。

(3)碱性磷酸酶活性计算

碱性磷酸酶活性，以16h后1g(干重)活性污泥中释放出的酚的毫克数表示。通过上一步骤样品测定得到610nm处吸光度，将其带入标准方程(2)，得到酚浓度c。将4份活性污泥样品的酚浓度、污泥浓度及其他指标分别带入公式(3)，计算得到4份活性污泥样品各自的碱性磷酸酶活性。

c－根据标准方程得的酚浓度，mg·mL^-1；

V－显色液体积，50mL；

ts－分取倍数，50/3；

m－污泥干重，g；

m＝5mL×污泥浓度MLSS；

t－16h。

计算结果如表2所示，4份活性污泥样品碱性磷酸酶活性分别为5.31、9.65、6.15和5.63mg·g^-1·h^-1，结果标准偏差≤0.433mg·g^-1·h^-1。本发明提供的活性污泥碱性磷酸酶活性测定方法精确性好，可重复性高。

表2活性污泥样品碱性磷酸酶活性

a：平均值±标准偏差；

b:以16h后1g活性污泥中释放出的酚的毫克数表示。

应当理解的是，这里所讨论的实施方案及实例只是为了说明，对本领域技术人员来说，可以加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。