通过分子标志物诊断激素性股骨头坏死的系统
阅读说明：本技术 通过分子标志物诊断激素性股骨头坏死的系统 (System for diagnosing hormonal femoral head necrosis through molecular markers ) 是由 陈卫衡 张彦琼 林娜 李泰贤 王荣田 于 2019-02-03 设计创作，主要内容包括：本公开涉及一种通过分子标志物诊断激素性股骨头坏死的系统,其中,所述分子标志物为BIRC3、CBL、CCR5、LYN、PAK1、PTEN、RAF1和TLR4。本公开所提供的系统和用途可以应用于通过检测分子标志物的表达量对SONFH高危人群作出评估和诊断,并协助作出较早期诊断,为指导临床诊疗提供有效依据。(The present disclosure relates to a system for diagnosing hormonal femoral head necrosis by molecular markers, wherein the molecular markers are BIRC3, CBL, CCR5, LYN, PAK1, PTEN, RAF1 and TLR 4. The system and the application provided by the disclosure can be applied to assessment and diagnosis of SONFH high risk groups by detecting the expression quantity of the molecular marker, and assist in making early diagnosis, so as to provide an effective basis for guiding clinical diagnosis and treatment.)
技术领域
本公开涉及临床检测技术领域，具体地，涉及一种通过分子标志物诊断激素性股骨头坏死的系统。
背景技术
股骨头坏死(Osteonecrosis of the Femoral Head,ONFH)作为骨伤科的一种常见病，目前我国的发病人数已超一千万人，每年新增患者为15～30万。根究病因不同股骨头坏死可分为创伤性股骨头坏死与非创伤性股骨头坏死(Nontraumatic Osteonecrosis ofthe Femoral Head,NONFH)，前者多因股骨颈骨折、股骨头脱位等外伤因素引起，后者多因接受糖皮质激素类药物治疗，嗜酒等原因引起。
激素性股骨头坏死(Steroid-induced osteonecrosis of the femoral head,SONFH)是长时间使用激素而引起的一种非创伤性股骨头坏死，其发病率目前已超过了外伤所致的股骨头坏死。
目前诊断股骨头坏死最有效的方法为MRI检查，早期诊断率达到90％以上，然而确诊后却很难阻止坏死进一步发展。因此针对SONFH高危人群，预测骨坏死出现并提前做出预防，显得尤为重要。
发明内容
本公开的目的是提供一种涉及分子标志物在诊断激素性股骨头坏死中的用途和通过分子标志物诊断激素性股骨头坏死的试剂盒和系统。
为了实现上述目的，本公开第一方面：提供一种诊断激素性股骨头坏死的系统，该系统包括计算装置、用于输入股骨头坏死患者个体的分子标志物的表达量的输入装置和用于输出股骨头坏死诊断结果的输出装置；其中，所述分子标志物为BIRC3、CBL、CCR5、LYN、PAK1、PTEN、RAF1和TLR4；所述计算装置包括存储器和处理器；所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现建模算法和如式(1)所示的判别函数的算法；所述建模算法为最小偏二乘算法；
F(c)＝sgn[f1(c1)+f2(c2)+f3(c3)+f4(c4)+f5(c5)+f6(c6)+f7(c7)+f8(c8)-b]式(1)，式(1)中，F(c)表示激素性股骨头坏死诊断结果，F(c)返回值为1表示激素性股骨头坏死成立，返回值为-1时表示激素性股骨头坏死不成立；c1～c8依次分别表示BIRC3、CBL、CCR5、LYN、PAK1、PTEN、RAF1和TLR4的相对表达量；所述相对表达量是指相对于内参的表达量比值；f1(c1)～f8(c8)分别为依据所述建模算法训练得到的核函数，b为依据所述建模算法训练得到的临界打分值。
可选地，该系统还包括分子标志物的表达量的检测装置；所述检测装置包括分子标志物表达量检测芯片和芯片信号读取器，分子标志物表达量检测芯片包括分别检测BIRC3、CBL、CCR5、LYN、PAK1、PTEN、RAF1和TLR4的表达量的探针。
可选地，所述分子标志物表达量检测芯片还包括内参探针，所述内参探针为检测GAPDH或β-Actin的表达量的探针。
可选地，所述检测装置包括实时定量PCR仪和分子标志物的实时定量PCR引物，所述分子标志物的实时定量PCR引物包括分别检测BIRC3、CBL、CCR5、LYN、PAK1、PTEN、RAF1和TLR4的表达量的实时定量PCR引物。
可选地，所述分子标志物的实时定量PCR引物还包括内参引物，所述内参引物为检测GAPDH或β-Actin的实时定量PCR引物。
可选地，式(1)中，所述内参为GAPDH，f1(c1)＝-0.097×c1，f2(c2)＝0.019×c2，f3(c3)＝-0.316×c3，f4(c4)＝0.292×c4，f5(c5)＝0.681×c5，f6(c6)＝0.375×c6，f7(c7)＝0.428×c7，f8(c8)＝0.129×c8，b＝0.040；或者，
所述内参为β-Actin，f1(c1)＝-0.012×c1，f2(c2)＝-0.329×c2，f3(c3)＝-0.254×c3，f4(c4)＝0.332×c4，f5(c5)＝0.561×c5，f6(c6)＝0.422×c6，f7(c7)＝0.469×c7，f8(c8)＝-0.052×c8，b＝0.024。
本公开第二方面：提供一种定量检测分子标志物的试剂在制备用于诊断激素性股骨头坏死的产品中的用途，其中，所述分子标志物为BIRC3、CBL、CCR5、LYN、PAK1、PTEN、RAF1和TLR4。
可选地，定量检测分子标志物是通过以下步骤进行的：
1)获得股骨头坏死患者的血清样本；
2)确定所述血清样本中分子标志物的表达量。
本公开第三方面：提供一种用于诊断激素性股骨头坏死的试剂盒，其中，所述试剂盒包括定量检测分子标志物的试剂，所述分子标志物为BIRC3、CBL、CCR5、LYN、PAK1、PTEN、RAF1和TLR4。
本公开第四方面：提供一种用于诊断激素性股骨头坏死的分子标志物组合，其中，该分子标志物组合包括BIRC3、CBL、CCR5、LYN、PAK1、PTEN、RAF1和TLR4。
通过上述技术方案，本公开所提供的系统和用途可以应用于通过检测分子标志物的表达量对SONFH高危人群作出评估和诊断，并协助作出较早期诊断，为指导临床诊疗提供有效依据。
本公开的其他特征和优点将在随后的
具体实施方式
部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1-2是实施例中采用本公开的分子标志物诊断激素性股骨头坏死得到的ROC曲线图，其中，图1内参为GAPDH，图2内参为β-Actin。
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开第一方面：提供一种诊断激素性股骨头坏死的系统，该系统包括计算装置、用于输入股骨头坏死患者个体的分子标志物的表达量的输入装置和用于输出股骨头坏死诊断结果的输出装置；其中，所述分子标志物为BIRC3、CBL、CCR5、LYN、PAK1、PTEN、RAF1和TLR4；所述计算装置包括存储器和处理器；所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现建模算法和如式(1)所示的判别函数的算法；所述建模算法为最小偏二乘算法；
F(c)＝sgn[f1(c1)+f2(c2)+f3(c3)+f4(c4)+f5(c5)+f6(c6)+f7(c7)+f8(c8)-b] 式(1)，
式(1)中，F(c)表示激素性股骨头坏死诊断结果，F(c)返回值为1表示激素性股骨头坏死成立，返回值为-1时表示激素性股骨头坏死不成立；c1～c8依次分别表示BIRC3、CBL、CCR5、LYN、PAK1、PTEN、RAF1和TLR4的相对表达量；所述相对表达量是指相对于内参的表达量比值；f1(c1)～f8(c8)分别为依据所述建模算法训练得到的核函数，b为依据所述建模算法训练得到的临界打分值。其中，最小偏二乘算法及其运算和训练的方式为已知的常规方式。
根据本公开，BIRC3在NCBI数据库中的参考编号为330；CBL在NCBI数据库中的参考编号为867；CCR5在NCBI数据库中的参考编号为1234；LYN在NCBI数据库中的参考编号为4067；PAK1在NCBI数据库中的参考编号为5058；PTEN在NCBI数据库中的参考编号为5728；RAF1在NCBI数据库中的参考编号为5894；TLR4在NCBI数据库中的参考编号为7099。
根据本公开，该系统还可以包括分子标志物的表达量的检测装置。所述检测装置包括分子标志物表达量检测芯片和芯片信号读取器，分子标志物表达量检测芯片包括分别检测BIRC3、CBL、CCR5、LYN、PAK1、PTEN、RAF1和TLR4的表达量的探针。或者所述检测装置包括实时定量PCR仪和分子标志物的实时定量PCR引物，所述分子标志物的实时定量PCR引物包括分别检测BIRC3、CBL、CCR5、LYN、PAK1、PTEN、RAF1和TLR4的表达量的实时定量PCR引物。
根据本公开，所述分子标志物表达量检测芯片还包括内参探针，所述内参探针为检测GAPDH或β-Actin的表达量的探针。所述分子标志物的实时定量PCR引物还包括内参引物，所述内参引物为检测GAPDH或β-Actin的实时定量PCR引物。
根据本公开，当所述内参为GAPDH时，作为训练得到的一组参考值，式(1)中，f1(c1)＝-0.097×c1，f2(c2)＝0.019×c2，f3(c3)＝-0.316×c3，f4(c4)＝0.292×c4，f5(c5)＝0.681×c5，f6(c6)＝0.375×c6，f7(c7)＝0.428×c7，f8(c8)＝0.129×c8，b＝0.040；也就是说，判别函数可以简化为如式(2)所示：
F(c)＝sgn[-0.097×c1+0.019×c2-0.316×c3+0.292×c4+0.681×c5+0.375×c6+0.428×c7+0.129×c8-0.040] 式(2)。
或者，当所述内参为β-Actin时，作为训练得到的一组参考值，式(1)中，f1(c1)＝-0.012×c1，f2(c2)＝-0.329×c2，f3(c3)＝-0.254×c3，f4(c4)＝0.332×c4，f5(c5)＝0.561×c5，f6(c6)＝0.422×c6，f7(c7)＝0.469×c7，f8(c8)＝-0.052×c8，b＝0.024；也就是说，判别函数可以简化为如式(3)所示：
F(c)＝sgn[-0.012×c1-0.329×c2-0.254×c3+0.332×c4+0.561×c5+0.422×c6+0.469×c7-0.052×c8-0.024] 式(3)。
需要说明的是，f1(c1)～f8(c8)和b可能会随着分子标志物的表达量的检测手段的偏性而发生改变，也可能会随着训练数据集的数据规模大小等因素发生改变。式(2)和式(3)所示的判别函数是本公开的发明人依据实施例中的数据以最小偏二乘的建模算法进行训练得到的，并不限制本公开的范围。
本公开第二方面：提供一种定量检测分子标志物的试剂在制备用于诊断激素性股骨头坏死的产品中的用途，其中，所述分子标志物为BIRC3、CBL、CCR5、LYN、PAK1、PTEN、RAF1和TLR4。
进一步地，定量检测分子标志物是通过以下步骤进行的：
1)获得股骨头坏死患者的血清样本；
2)确定所述血清样本中分子标志物的表达量。
其中，步骤2)的方法可以为qPCR方法。
本公开所提供的系统和用途可以应用于通过检测分子标志物的表达量对SONFH高危人群作出评估和诊断，并协助作出较早期诊断，为指导临床诊疗提供有效依据。
本公开第三方面：提供一种用于诊断激素性股骨头坏死的试剂盒，其中，所述试剂盒包括定量检测分子标志物的试剂，所述分子标志物为BIRC3、CBL、CCR5、LYN、PAK1、PTEN、RAF1和TLR4。
进一步地，所述试剂可以为qPCR试剂。
本公开第四方面：提供一种用于诊断激素性股骨头坏死的分子标志物组合，其中，该分子标志物组合包括BIRC3、CBL、CCR5、LYN、PAK1、PTEN、RAF1和TLR4。
在本公开的一种特别优选的实施方式中，所述分子标志物组合由BIRC3、CBL、CCR5、LYN、PAK1、PTEN、RAF1和TLR4组成。
本公开所提供的试剂盒以及分子标志物组合可以应用于通过检测分子标志物的表达量对SONFH高危人群作出评估和诊断，并协助作出较早期诊断，为指导临床诊疗提供有效依据。
以下对通过实施例对本公开进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
实施例中，采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料用均数±标准差表示。计数资料两组间比较采用χ2检验，计量资料两组间比较采用t检验，ROC曲线用于分析分子标志物的诊断效能，预测准确性通过ROC曲线下面积进行计算，p<0.05为差异有统计学意义。
实施例
本实施例用于说明本公开的生物标志物的发现以及预测模型的建立和验证。
收集2014年1月至2017年10月于中国中医科学院望京医院与郑州中医骨伤病医院诊断为SONFH的患者60例(包括痰瘀阻络证组、经脉痹阻证组、肝肾亏虚证组各20例)作为疾病组；同时收集于中国医学科学院血液病医院接受激素治疗未发生股骨头坏死患者20例为对照组。将80例患者随机分为训练集(n＝40，痰瘀阻络证、经脉痹阻证、肝肾亏虚证、对照组各10例)和验证集(n＝40，疾病组与对照组分组同验证集)。
股骨头坏死的诊断参照文献“Mont MA,HungerfordDS.Non-traumatic avascularnecrosis of the femoral head[J]J Bone Joint Surg(Am),1995,77(3):459-474.”提出的诊断标准，辨证标准参考《北京地区中医常见病证诊疗常规》和文献“陈卫衡,刘道兵,张洪美,等.股骨头坏死的三期四型辨证思路[J].中国中医基础，医学杂志,2003,9(12):51-52”中公开的股骨头坏死的“三期四型”辨证思路。
纳入标准：符合非创伤性股骨头坏死诊断标准的患者；接受激素治疗随访1年未发生股骨头坏死患者。排除标准：原发病病情严重，需其它治疗替代激素治疗者。
按DME要求设计调查表，调查年龄、性别、身高、体重、病程、使用激素时间、临床表现与体征、原发病病史。
训练集与验证集患者性别、体重指数、年龄、使用激素时间等一般临床资料比较见表1，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。
表1
训练集与验证集患者均于治疗前清晨空腹抽取静脉血2.5ml入PAXgene BloodRNA Tubes中，上下颠倒混匀后，放一20℃冰箱保存。
血清：用促凝剂加分离胶试管抽取，3500r/m离心10min分离血清后-80℃保存，备用。
对RNA的提取与质检、芯片检测委托上海伯豪生物技术有限公司完成。
采用GeneChip Scanner 3000图像分析软件与用Command Console Software 4.0(美国Affymetrix公司)对芯片进行扫描并读取原始数据，采用微阵列显著性分析软件(Significance Analysis of Microarrays，SAM)筛选出SONFH不同证型与对照组之间有统计学意义的基因。根据FDR(False Discovery Rate)值来鉴定这些基因的百分率范围。
基于激素性股骨头坏死与对照组样本相比的差异基因的相互作用信息，建立其相互作用网络，并计算网络节点的拓扑特征值包括节点连接度(即网络中某一节点i与其他节点的相互作用数)，节点介度(即所有的节点对之间通过某一节点i的最短路径条数)、节点紧密度(即是网络图中某一节点i的中心性度量，即节点i到其它可达节点的平均距离)。选取上述三个拓扑特征值均大于其中位数的节点作为激素性股骨头坏死网络的关键节点，获得激素性股骨头坏死的候选分子标志物，所述分子标志物为BIRC3、CBL、CCR5、LYN、PAK1、PTEN、RAF1和TLR4。
基于上述分子标志物在SONFH患者外周血中的表达量信息，采用偏最小二乘法建立激素性股骨头坏死的辨证模型，计算各候选分子标志物在模型中的权重值及模型得分卡值。该模型如式(1)所示。
F(c)＝sgn[f1(c1)+f2(c2)+f3(c3)+f4(c4)+f5(c5)+f6(c6)+f7(c7)+f8(c8)-b] 式(1)，
式(1)中，F(c)表示激素性股骨头坏死诊断结果，F(c)返回值为1表示激素性股骨头坏死成立，返回值为-1时表示激素性股骨头坏死不成立；c1～c8依次分别表示BIRC3、CBL、CCR5、LYN、PAK1、PTEN、RAF1和TLR4的相对表达量；所述相对表达量是指相对于内参的表达量比值；f1(c1)～f8(c8)分别为依据所述建模算法训练得到的核函数，b为依据所述建模算法训练得到的临界打分值。具体地，当所述内参为GAPDH时，作为训练得到的一组参考值，式(1)中，f1(c1)＝-0.097×c1，f2(c2)＝0.019×c2，f3(c3)＝-0.316×c3，f4(c4)＝0.292×c4，f5(c5)＝0.681×c5，f6(c6)＝0.375×c6，f7(c7)＝0.428×c7，f8(c8)＝0.129×c8，b＝0.040；也就是说，判别函数可以简化为如式(2)所示：
F(c)＝sgn[-0.097×c1+0.019×c2-0.316×c3+0.292×c4+0.681×c5+0.375×c6+0.428×c7+0.129×c8-0.040] 式(2)。
或者，当所述内参为β-Actin时，作为训练得到的一组参考值，式(1)中，f1(c1)＝-0.012×c1，f2(c2)＝-0.329×c2，f3(c3)＝-0.254×c3，f4(c4)＝0.332×c4，f5(c5)＝0.561×c5，f6(c6)＝0.422×c6，f7(c7)＝0.469×c7，f8(c8)＝-0.052×c8，b＝0.024；也就是说，判别函数可以简化为如式(3)所示：
F(c)＝sgn[-0.012×c1-0.329×c2-0.254×c3+0.332×c4+0.561×c5+0.422×c6+0.469×c7-0.052×c8-0.024] 式(3)。
针对训练集样本，开展qPCR检测。将总RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板行实时定量PCR扩增，同时以β-Actin与GAPDH为参照组。采用Power SYBR Green PCR Master MitKit用ABI 7900HT实时焚光定量PCR仪(美国ABI公司)进行QPCR。反应条件：50℃孵育2min，然后95℃，10min：接着进行40个循环：95℃，15秒；60℃，1min，反应结束后，确认QPCR的扩增曲线和融解曲线
基于独立样本集，采用qPCR法检测BIRC3、CBL、CCR5、LYN、PAK1、PTEN、RAF1和TLR4在患者外周血中的表达量(基于GAPDH和β-Actin两个内参，产出两组表达量数据)。经过随机分组，采用独立测试集验证，重复验证100次，评价指标包括预测准确性(accuracy,ACC)，接受者操作特性曲线(receiver operating characteristic curve，简称ROC曲线)下面积(area under the curve,AUC)，结果见图1-2，ACC结果为91.20％，AUC结果为0.901，表明BIRC3、CBL、CCR5、LYN、PAK1、PTEN、RAF1和TLR4可以用作诊断激素性股骨头坏死的分子标志物。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。