阅读说明：本技术 Ak9作为靶标在检测和治疗原发性弱精子症中的应用 (Application of AK9 as target in detecting and treating primary asthenospermia ) 是由 沙艳伟 苏志英 于 2020-05-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了AK9作为靶标在检测和治疗原发性弱精子症中的应用。本发明中,AK9突变引起AK9功能蛋白缺失,可能破坏细胞内的核苷代谢,抑制糖酵解,引起弱精子症。(The invention discloses application of AK9 as a target in detecting and treating primary asthenospermia. In the invention, AK9 mutation causes AK9 functional protein loss, possibly destroys nucleoside metabolism in cells, inhibits glycolysis and causes asthenospermia.)

AK9作为靶标在检测和治疗原发性弱精子症中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及AK9作为靶标在检测和治疗原发性弱精子症中的应用。

背景技术

近年来，男性不育的发病率显著上升，严重影响了家庭和睦及国家的可持续发展。临床统计结果表明：约70％的不育男性存在不同程度的弱精子症表现，弱精子症是引起男性不育的重要因素。世界卫生组织颁布的精液分析标准指出：弱精子症是指精液中前向运动精子比例低于32％或前向运动与非前向运动精子比例低于40％的病症，主要特征表现为精子的前向运动能力低下。目前，除了年龄、恶性肿瘤、睾丸损伤、男性副腺感染、隐睾症、精索静脉曲张、内分泌不足或紊乱、输精管及射精管发育不全或阻塞、精浆异常、微生物感染和自身免疫缺陷引起的继发性弱精子症，临床上仍有相当比例的原发性弱精子症发病机制不明。因此，探讨临床上原发性弱精子症的发病机制，有助于在临床中精准地解决男性弱精子症引起的不育。

基因突变是指DNA分子上的核苷酸序列或数目发生变化。基因突变可以引起基因结构和功能改变，参与弱精子症等多种疾病的发生。研究表明：TEKT4敲除的小鼠，雄鼠精子电镜的超微结构无明显异常，精子的前进速度急剧降低，并且沿着鞭毛出现不协调的波形运动，表现出显著的弱精子症，小鼠生育能力损坏。Wu等人通过临床研究证明：TEKT4表达降低与人的原发性弱精子症的发生密切相关。多肽N-乙酰半乳糖氨基转移蛋白5(GALNTL5)突变可以导致临床中男性和雄性小鼠弱精子症及不育。此外，环氧酶1(COX1)、环氧酶(COXII)、细胞色素氧化酶III(COIII)等基因突变同样被证明是临床中引起男性精子弱精子症和不育的原因之一。科研人员通过在先前的研究发现并揭示了SPAG17和EIF4G1基因突变和临床原发性弱精子症发生密切相关。因此，基因突变可能是引起原发性弱精子症的重要原因。

发明内容

本发明的目的在于提供AK9作为靶标在检测和治疗原发性弱精子症中的应用。

本发明的技术方案如下：

AK9作为检测靶标在制备诊断原发性弱精子症的试剂盒中的应用。

AK9作为治疗靶标在制备治疗原发性弱精子症的试剂盒中的应用。

AK9突变的拮抗物质在制备防治原发性弱精子症的药物中的应用。

一种诊断原发性弱精子症的试剂盒，包括能够检测AK9是否突变的试剂。

在本发明的一个优选实施方案中，所述能够检测AK9是否突变的试剂包括PCR检测AK9是否突变的试剂。

一种治疗原发性弱精子症的试剂盒，包括能够治疗AK9突变的试剂。

在本发明的一个优选实施方案中，所述能够治疗AK9突变的试剂包括AK9突变的拮抗物质。

一种防治原发性弱精子症的药物，其有效成分包括AK9突变的拮抗物质。

在本发明的一个优选实施方案中，其有效成分为AK9突变的拮抗物质。

进一步优选的，还包括药学上可接受的辅料。

本发明的有益效果是：本发明中，AK9突变引起AK9功能蛋白缺失，可能破坏细胞内的核苷代谢，抑制糖酵解，引起弱精子症。

附图说明

图1为本发明实施例1中4例AK9基因突变原发性弱精子症患者及家系图。其中，携带AK9基因突变的例4原发性弱精子症表型患者的家系分析；黑色方块表示不育的患者；半黑正方形和半黑圆形表示该家族中杂合突变携带者。

图2为本发明实施例1中AK9基因在人体各个组织中的表达丰度图。其中，(A)NCBI数据库中AK9基因在人体各个组织中的表达丰度；(B)HPA数据库中AK9基因在人体各个组织中的表达丰度。

图3为本发明实施例1中4例患者AK9基因突变位点在基因组和蛋白结构域上的位置图。其中，(A)显示了7个AK9突变位点在内基因组中的位置。(B)显示了7个AK9突变位点在AK9的蛋白结构域上的位置。橙色框显示AK(adenylate kinase)结构域；蓝色框表示NMPbind结构域；绿色框显示LID结构域。

图4为本发明实施例1中Sanger测序验证结果图，其中发现：患者R0008是AK9基因突变为c.2005dupT：p.C669fs为纯合突变，父母为c.2005dupT杂合突变携带者，哥哥该位点未突变，且育有一子。患者R0022是AK9基因c.607_615del：p.203_205del和c.1266A＞T：p.X422Y复合杂合突变，父亲为c.607_615del：p.203_205del杂合突变的携带者，母亲为c.1266A＞T杂合突变携带者。患者R0038是AK9基因c.G3391A：p.E1131K和c.C2444T：p.P815L复合杂合突变，父亲为c.G3391A：p.E1131杂合突变的携带者，母亲为c.C2444T：p.P815L杂合突变携带者；患者R0052是AK9基因c.G5074A：p.V1692M和c.3257_3259del：p.E1083del复合杂合突变，父亲为c.G5074A：p.V1692M杂合突变的携带者，母亲为c.3257_3259del：p.E1083del杂合突变携带者；结果表明：基因突变在这些患者家系内共分离，四例患者AK9基因突变遗传自其父亲和母亲(见图4A-D)，突变基因的位置均在编码AK9蛋白的外显子上(见图4E)，突变基因影响的编码蛋白(见图4F)。

图5为本发明实施例1中四例AK9基因突变弱精子症患者副鼻窦、胸部及胸部平扫CT扫描结果图。其中，上颌窦位于鼻腔两侧，左右基本一致，骨壁清楚，粘膜沿窦壁厚度不超过1mm。上额窦位于两眼眶的内上方，上额窦略呈花瓣状。胸廊对称，双肺纹理清晰，肺门影结构正常，心影不大，纵隔居中，双侧膈面光滑，双侧肋膈角锐利，膈上肋骨未见异常。

图6为本发明实施例1中AK9基因突变患者精子的运动能力分析图。其中，(A)与对照组相比，AK9基因突变患者精子的前向运动能力显著性降低；其中***：P＜0.001。(B)加入ATP之后，AK9基因突变患者精子的前向运动能力显著提高。

图7为本发明实施例1中两例AK9基因突变弱精子症患者精子巴氏染色图。其中，A为正常对照的精子，B为R0008患者的精子，C为R0022患者的精子。两例AK9基因突变的患者精子形态与正常对照相比，未见明显异常。

图8为本发明实施例1中两例AK9基因突变弱精子症患者精子透射电镜超微结构图。其中，MP，中段精子的横截面；对照和患者的精子均有完整的“9+2”微管结构，周围均有完整的线粒体鞘(MS)包围；PP，主段精子的横截面；对照和患者的精子均有完整的“9+2”微管结构，周围均有完整的纤维鞘(FS)包围；与正常对照相比，2例弱精子症患者精子的超微结构未见明显异常。

图9为本发明实施例1中患者体内AK9 mRNA的表达和精子中AK9蛋白的表达及定位图。其中，(A)qRT-PCR实验检测患者血液细胞中AK9 mRNA的表达；以2例患者为例，患者R0008D的AK9 mRNA显著性降低；但是，患者R0022的AK9 mRNA表达水平未受到明显影响；(B)Western Blot实验检测患者精子中AK9蛋白的表达。在患者R0008的精子样品中没有AK9的表达；患者R0022的精子样品中AK9的表达水平有降低，但是未受到明显影响；(C)免疫荧光染色实验分析患者精子中AK9蛋白的表达及定位；在正常对照中AK9沿精子鞭毛表达；在患者R0008的精子鞭毛上未观察到AK9的表达；在患者R0022的精子鞭毛中观察到了AK9的表达，但是表达量有所降低。蓝色：DAPI；绿色：α-Tubulin；红色：AK9。

图10为本发明实施例1中小鼠中Ak9基因在各个组织中的表达丰度图。其中，显示NCBI数据库中Ak9基因在小鼠各个组织中的表达丰度。

图11为本发明实施例1中CRISPR-Cas9技术构建Ak9敲除小鼠模型gRNA设计图。其中，显示Ak9敲除小鼠模型gRNA引物位置及序列。

图12为本发明实施例1中Ak9基因敲除小鼠PCR结果图。其中，与对照组相比，Ak9基因敲除小鼠PCR条带位置有明显差异，条带大小有显著降低。

图13为本发明实施例1中AK9基因敲除小鼠体重及生殖系统发育图。其中，Ak9基因敲除的雄性小鼠的体重(A)、睾丸重量(B)、附睾重量(C)及附睾重量与体重比(D)；与对照组相比，Ak9基因敲除成年小鼠体重、睾丸重量、附睾重量、附睾与体重的比值均未见明显异常。

图14为本发明实施例1中Ak9基因敲除小鼠睾丸HE染色图。其中，对照组成年小鼠睾丸曲细精管内有各期生精细胞，包括：精原细胞、各级精母细胞、圆形精子和长形精子；与对照组相比，Ak9基因敲除小鼠睾丸曲细精管内有各期生精细胞，并未见明显异常。

图15为本发明实施例1中Ak9基因敲除小鼠附睾形态及精子数量图。其中，(A)HE染色结果显示，Ak9基因敲除小鼠附睾形态与对照组相比并未见明显异常；(B)统计结果显示，Ak9基因敲除小鼠附睾内精子数量与对照组相比明显降低。其中*：P＜0.05。

图16为本发明实施例1中AK9基因敲除小鼠的精子形态图。其中，巴氏染色结果显示，Ak9基因敲除小鼠精子形态与对照组相比未见明显异常。

图17为本发明实施例1中Ak9基因敲除小鼠的精子超微结构图。其中，MP段透射电镜结果显示，对照和基因敲除小鼠的精子鞭毛轴丝均有完整的“9+2”微管结构，周围均有完整的线粒体鞘(MS)包围；PP段透射电镜结果显示，对照和Ak9基因敲除小鼠的精子均有完整的“9+2”微管结构，周围均有完整的纤维鞘(FS)包围；Ak9基因敲除小鼠精子超微结构与对照组相比未见明显异常；MP，中段精子的横截面。PP，主段精子的横截面。

图18为本发明实施例1中Ak9基因敲除小鼠的精子运动能力分析图。其中，成年小鼠附睾中精子运动能力分析；(A)与对照组相比，Ak9基因敲除小鼠精子的前向运动能力显著性降低。其中***：P＜0.001；(B)加入ATP之后，Ak9基因敲除小鼠精子的前向运动能力显著提高。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1

1)建立弱精子症样本库

通过长达13年累计收集高度疑似基因因素(均排除年龄、恶性肿瘤、睾丸损伤、男性副腺感染、隐睾症、精索静脉曲张、内分泌不足或输精管及射精管不全阻塞、精浆异常等因素)导致的原发性不育弱精子症患者85例(样本编号SHARJZZ0001-0085，简称R0001-0085，均保存精液及血液样本)。这些纳入研究队列的患者均排除女方因素，且男方精液连续检测2次以上，精液指标除精子活力外其他均正常。

2)全外显子测序发现多个弱精子症相关突变基因

对已经排除了染色体核型及AZF区缺失等遗传学问题的原发性弱精子症患者，对其进行全外显子组测序。考虑到弱精子症发病的罕见性，潜在的致病突变应属于罕见变异。因此，通过生物信息学分析，筛选出患者突变频率小于1％的纯合和复合杂合变异(参考了ExAC、gnomAD、1000Genomes、dbSNP、ESP6500等变异数据库)，包括错义突变、移码突变、无义突变、剪接位点处突变等突变类型。然后通过生物信息学分析，筛选出那些在睾丸中特异表达或高表达的基因，并结合突变的致病性预测分析(在线变异预测软件如SIFT，Polyphen2，PROVEAN，Mutation Taster，FATHMM-MKL等)筛选原发性弱精子症患者的潜在致病基因。随后对患者及其家人的潜在致病基因突变位点进行了Sanger测序验证。目前，通过对测序结果进行详细的生物信息学分析和扎实的相关机制研究，已经发现包括SPAG17和EIF4G1等多个弱精子症潜在致病基因突变。

3)进一步分析发现5例独立的AK9基因突变原发性弱精子症患者

对82例未知基因突变的原发性弱精子症患者病例进行了进一步的生物信息学分析和筛选，以寻找与原发性弱精子症相关的新基因突变。在剔除不相关或无意义的突变之后，在来自不同家系的5例原发性弱精子症患者(样本编号R0008、R0022、R0038、R0052；其中R0008出生于父母近亲结婚的家庭)中发现了AK9基因突变符合各种筛选条件(见图1)。

在这4例原发性弱精子症患者所有罕见和潜在致病性变异的患者数据中，只有AK9基因与弱精子症相关，在对照组中均没有发现AK9基因突变。并且AK9基因在人的睾丸组织中特异性高表达(见图2)。因此，推测AK9基因突变可能与这5例患者的原发性弱精子症表型有关。患者R0008为AK9基因纯合突变，另外4例患者为复合杂合突变，共9个突变。各个突变均在在AK9基因组的外显子上且并在所翻译AK9蛋白结构域的重要位置(见图3)。

5例患者的各个突变具体分析如下：

患者R0008的AK9基因纯合移码突变：c.2005dupT：p.C669fs很大可能由于无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated decay，NMD)导致序列异常的mRNA降解，最终无法翻译AK9蛋白。

患者R0022的AK9基因杂合突变c.607_615del：p.203_205del翻译出的蛋白在AK1domain和LID1 domain上缺失三个氨基酸，且这三个氨基酸在不同物种的进化上高度保守，预测会严重影响AK9蛋白的功能；患者R0022的另一个杂合突变c.1266A＞T：p.X422Y在终止密码子上面，是stoploss突变，导致翻译过程无法及时终止，预测该突变会严重影响AK9蛋白的三维结构，进而影响其功能结构域和功能行使，造成功能异常的AK9蛋白最终降解。

患者R0038的AK9基因杂合突变c.C2444T：p.P815L翻译出的蛋白导致815位的氨基酸由人体非必需的亚氨基酸类脯氨酸变成必需的脂肪族类亮氨酸患者R0038的另一个杂合突变c.G3391A：p.E1131K翻译出的蛋白导致1131位的氨基酸由人体非必需的极性中性酰胺类谷氨酸变成必需的碱性氨基酸类赖氨酸。且这两个位点在不同物种的进化上高度保守，预测会严重影响AK9蛋白的功能。

患者R0052的AK9基因杂合突变c.3257_3259del：p.E1083del翻译出的蛋白在AK2domain上缺失一个氨基酸，且这个氨基酸在不同物种的进化上高度保守，预测会严重影响AK9蛋白的功能；患者R0052的另一个杂合突变c.G5074A：p.V1692M翻译出的蛋白导致1692位的氨基酸由非极性疏水性脂肪族类缬氨酸变成极性中性亲水性含硫类蛋氨酸。且这些位点在不同物种的进化上高度保守，预测会严重影响AK9蛋白的功能。

由于患者R0008和R0022发现较早，相关的分析和实验已经取得了初步结果，下面的结果部分主要以这两例患者为例展开描述。

4)4例原发性弱精子症患者及其家人AK9基因突变位点Sanger测序验证

随后对其中发现较早的四例患者及其家人AK9基因的突变位点进行了Sanger测序验证，发现两例患者的父母均是杂合突变的携带者，AK9基因突变在患者家系内共分离，两例患者AK9基因突变很大可能遗传自其父亲和母亲(见图4)。

4)携带AK9基因突变的4例原发性弱精子症患者临床资料

这4例AK9基因突变的原发性弱精子症患者均有正常性生活，但他们夫妻在没有采取任何避孕措施的情况下，多年来一直没有怀孕。随后对这4例AK9基因突变的弱精子症患者进行了详细的临床检查。检测数据表明这两例患者均平素体健，无明显不适。患者均未出现反复咳嗽、咳痰、慢性鼻窦炎、支气管炎、支气管扩张、肺不张、鼻息肉及内脏转位等。患者的副鼻窦、胸部及胸部平扫CT扫描结果显示：上颌窦位于鼻腔两侧，左右基本一致，骨壁清楚，粘膜沿窦壁厚度不超过1mm。上额窦位于两眼眶的内上方，上额窦略呈花瓣状。胸廊对称，双肺纹理清晰，肺门影结构正常，心影不大，纵隔居中，双侧膈面光滑，双侧肋膈角锐利，膈上肋骨未见异常(见图5)。

随后，仔细检查了患者的外生殖器发育和双侧睾丸大小，B超检查结果显示患者四例患者的精囊腺、前列腺、双侧睾丸、附睾、精索静脉均未见异常。对两位患者进行了体检及血液激素含量测量，两位患者的各项指标均正常(见表1)。

表1：携带AK9基因突变两个原发性弱精子症患者的临床数据

5)携带AK9基因突变的患者精子呈现出典型的弱精子症特征

对携带AK9基因突变的这4例患者进行了精液参数分析，结果显示这两位患者精液参数除精子活力外，其他指标均正常；两位患者的精子均表现为典型的弱精子症特征(见表2)。

表2携带AK9基因突变的患者精液参数分析结果

为了进一步探究患者不育的原因，对患者精子进行了运动能力分析。根据统计，与对照组相比，AK9基因突变之后患者的精子运动能力显著降低(见图6A)。加入ATP之后，AK9基因突变患者的精子的前向运动能力显著提高(见图6B)。这表明AK9基因突变之后，可能影响了患者精子ATP的生成，从而严重影响了精子的前向运动能力，造成患者不育。

6)携带AK9基因突变2例弱精子症患者精子的形态无明显缺陷

为了研究携带AK9基因突变的2例患者造成弱精子症的原因，对这2例患者的精子进行了Papanicolaou染色分析。结果显示：两例AK9基因突变的患者精子形态与正常对照相比，未见明显异常(见图7)。

7)携带AK9基因突变2例弱精子症患者精子的超微结构无明显缺陷

为了进一步研究携带AK9基因突变的2例患者造成弱精子症的原因，对这2例患者的精子进行了透射电镜分析。结果显示：两例AK9基因突变的患者精子超微结构在中段(MP)和主段(PP)均有典型的“9+2”轴丝结构。并且MP周围有完整的线粒体鞘(MS)包围，PP周围有完整的纤维鞘(FS)包裹。与正常对照相比，AK9基因突变的2例弱精子症患者精子的超微结构未见明显异常(见图8)。

8)患者体内AK9 mRNA的表达和精子中AK9蛋白的表达及定位分析

患者精子的形态和超微结构正常，提示AK9基因突变未影响到精子的正常结构。为了进一步研究AK9基因突变造成患者原发性弱精子症的原因，接下来分析了患者中AK9mRNA的表达和精子中AK9蛋白的表达及定位。通过qRT-PCR实验，检测提取患者血液细胞中AK9mRNA的表达。结果显示：在患者R0008的血液样品中几乎检测不到AK9 mRNA的表达(见图9A)，表明c.2005dupT：p.C669fs突变之后引起了无义介导的mRNA降解，导致序列异常的AK9mRNA降解，最终无法翻译AK9蛋白。但是，与对照相比R0022患者的血液样品中AK9 mRNA的表达水平未受到明显影响(见图9A)。

随后，用Western Blot实验检测了患者精子中AK9蛋白的表达。Western Blot结果显示，在患者R0008的精子样品中没有AK9的表达(见图9B)，表明突变之后引起了无义介导的mRNA降解，最终没有AK9蛋白被翻译。与对照相比，R0022的精子样品中AK9的表达水平有降低，但是未受到明显影响(见图9B)。

为了分析AK9在精子中的定位，进行了免疫荧光染色。结果发现AK9在正常对照的精子中沿鞭毛表达；在患者R0008的精子鞭毛上未观察到AK9的表达；在患者R0022的精子鞭毛中观察到了AK9的表达，但是表达量有所降低(见图9C)。患者精子中AK9蛋白表达的免疫荧光实验的结果与Western Blot实验结果一致，与qRT-PCR实验的结果也符合(见图9)。

9)构建Ak9基因敲除小鼠并鉴定

在1)-8)的基础上，为了进一步探究AK9基因突变引起患者原发性弱精子症的具体机制，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，构建Ak9基因敲除的小鼠模型。检查了NCBI数据库中Ak9基因在小鼠各个组织中的表达丰度，发现其在成年小鼠的睾丸组织中特异性高表达(见图10)。这就为利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建Ak9基因敲除的小鼠模型来研究Ak9基因的功能提供了条件。

(1)设计并测试gRNA效率：

①gRNA的设计：我们通过网站http：//crispr.mit.edu/进行gRNA的设计，选取了3条评分最高的gRNA，如图11所示，序列如下：

gRNA-1-1：5’-gttccagctgcagtcactgt-3’ (SEQ ID NO.01)

gRNA-2-1：5’-gatttatgccaaagaacttg-3’ (SEQ ID NO.02)

gRNA-3-1：5’-gagtcgcaggagaaagaaga-3’ (SEQ ID NO.03)

②设计gRNA效率的测试：

构建合适抗性的Cas9 gRNA质粒，转染细胞，抗性药杀转染的细胞和未转染的细胞，未转染的细胞死完后取转染Cas9 gRNA的细胞，提取基因组。设计在gRNA切割位点前后各300bp的引物，PCR，回收，连接到载体上，涂板，挑菌16个，送测序，统计16个菌中有KO的比例，选取敲除效率高于50％的进行下步实验。本次实验选取gRNA-1-1和gRNA-2-1。

(2)gRNA的订购：

从Thermo公司订购2OD的引物，序列如下：

gRNA-1-1：

5-gaaattaatacgactcactatagggttccagctgcagtcactgtgttttagagctagaaatagc-3’(SEQ ID NO.04)

gRNA-2-1：

5-gaaattaatacgactcactatagggatttatgccaaagaacttggttttagagctagaaatagc-3’(SEQ ID NO.05)

(3)Cas9的PCR引物订购：

引物序列为：Cas9-F：5’-caccgactgagctccttaag-3’ (SEQ ID NO.06)

Cas9-R：5’-tagtcaagcttccatggctcga-3’ (SEQ ID NO.07)

(4)gRNA和Cas9的体外转录

①sgRNA模板PCR Phusion酶扩增体系及条件

20μL/reaction*10 reactions

*：为了减少非特异条带，质粒稀释到0.5pg/μL.

②Cas9模板PCR Phusion酶扩增体系及条件

20ul/reaction*10 reactions

*：为了减少非特异条带，质粒稀释到0.5ng/μL.

(5)胞浆注射：

按Cas9 100ng/μL和gRNA 50ng/μL比例混合后进行0.5天受精卵的显微注射。共注射240个受精卵，移植了6只ICR假孕母鼠，19天后获得27只仔鼠。

(6)小鼠的鉴定：

根据gRNA的位置设计PCR引物，PCR跑胶并测序检测所得小鼠基因组是否存在缺失(缺失片段比较大直接可以从带型变化看出，缺失片段小则只能通过测序检测)。将这27只小鼠的基因组PCR产物送测序，分析结果后选择其中一只纯合雄鼠进行繁殖，获得可稳定遗传的Ak9基因敲除小鼠F1代杂合子，将F1代小鼠配对，获得F2代野生型小鼠和Ak9敲除的纯合子小鼠(见图12)。

10)Ak9基因敲除小鼠体重及生殖系统发育正常

待Ak9基因敲除小鼠成年后，通过用野生型小鼠与之交配，发现Ak9基因敲除的雌性小鼠能正常繁育后代，但是Ak9基因敲除的雄性小鼠不育。因此，对Ak9基因敲除的雄性小鼠进行了详细观察和分析。统计了Ak9基因敲除的雄性小鼠的体重、睾丸重量、附睾重量及附睾重量与体重比，与对照组相比，这些指标未见明显异常。结果表明：Ak9基因敲除雄鼠体重及生殖系统发育正常(见图13)。

11)Ak9基因敲除小鼠精子发生过程正常

Ak9基因敲除雄鼠体重及生殖系统发育正常，但是雄鼠不育。说明Ak9基因敲除之后可能影响了精子的发生过程或者精子的功能。取Ak9基因敲除成年雄鼠的睾丸进行固定、包埋和切片，之后进行HE染色。结果显示：与对照组相比，Ak9基因敲除小鼠睾丸曲细精管内有包括精原细胞、各级精母细胞、圆形精子和长形精子在内的各期生精细胞(见图14)。这说明Ak9基因敲除不影响小鼠精子发生过程。

12)Ak9基因敲除小鼠附睾形态及精子数量

Ak9基因敲除的小鼠精子能进行正常的精子发生过程，因此对Ak9基因敲除小鼠的附睾进行了HE染色，以观察附睾形态及附睾内精子数量。同时，通过附睾取精，对Ak9基因敲除小鼠附睾内精子的数量进行了统计。HE染色结果显示，Ak9基因敲除小鼠附睾形态与对照组相比并未见明显异常，附睾内有大量精子。进一步的统计结果表明，Ak9基因敲除小鼠附睾内精子数量与对照组相比明显降低(见图15)。

13)Ak9基因敲除小鼠精子形态分析

通对成年小鼠附睾中精子进行巴氏染色后，发现AK9基因敲除小鼠的精子形态与对照组相比未见明显异常(见图16)。

14)Ak9基因敲除小鼠精子超微结构分析

为了检测Ak9基因敲除是否影响了小鼠精子的超微结构，对成年小鼠附睾中精子进行了透射电镜分析。结果显示，在MP段Ak9基因敲除小鼠的精子鞭毛轴丝均有完整的“9+2”微管结构，周围有完整的线粒体鞘(MS)包围。在PP段Ak9基因敲除小鼠的精子也有完整的“9+2”微管结构，周围有完整的纤维鞘(FS)包围。Ak9基因敲除小鼠精子超微结构与对照组相比未见明显异常(见图17)。

15)Ak9基因敲除小鼠精子运动能力分析

Ak9基因敲除之后，雄性小鼠精子的形态和超微结构并没有明显异常。为了进一步探究雄性小鼠不育的原因，对成年小鼠附睾中精子进行了运动能力分析。结果显示：与对照组相比，Ak9基因敲除小鼠精子的前向运动能力显著性降低(见图18A)。加入ATP之后，Ak9基因敲除小鼠精子的前向运动能力显著提高(见图18B)。这表明Ak9基因敲除之后，可能影响了精子ATP的生成，从而严重影响了精子的前向运动能力，造成雄性小鼠不育。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

序列表

<110> 厦门市妇幼保健院（厦门市计划生育服务中心）

<120> AK9作为靶标在检测和治疗原发性弱精子症中的应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gttccagctg cagtcactgt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gatttatgcc aaagaacttg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagtcgcagg agaaagaaga 20

<210> 4

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaattaata cgactcacta tagggttcca gctgcagtca ctgtgtttta gagctagaaa 60

tagc 64

<210> 5

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaattaata cgactcacta tagggattta tgccaaagaa cttggtttta gagctagaaa 60

tagc 64

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caccgactga gctccttaag 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tagtcaagct tccatggctc ga 22