阅读说明：本技术 尿毒症标志物及其应用 (Uremia marker and application thereof ) 是由 戴勇 伍宏伟 汤冬娥 张欣洲 王康 郑凤屏 于 2020-05-11 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种尿毒症标志物及其应用。该尿毒症标志物,包括以下至少一种：ESRRG、TEAD2、HOXC10、TEAD1、FOS、GRHL1、PAX7、PAX3、PBX1、MAFG、GCM2、NR3C1、NR3C2、JUN、PBX2、SCRT2、MYBL2、SPDEF、STAT1、NEUROG2、JDP2、FOSB。发明人借助scATAC-seq技术发现尿毒症患者与正常健康对照组人群的样本中,多个转录因子的表达水平存在显著差异,因此,可以将这些差异表达的转录因子作为标志物用于尿毒症的诊断、预后评估或筛药。(The invention provides a uremia marker and application thereof. The uremia marker comprises at least one of the following substances: ESRRG, TEAD2, HOXC10, TEAD1, FOS, GRHL1, PAX7, PAX3, PBX1, MAFG, GCM2, NR3C1, NR3C2, JUN, PBX2, SCRT2, MYBL2, SPDEF, STAT1, NEUROG2, JDP2, FOSB. The inventor finds that the expression levels of a plurality of transcription factors in samples of uremia patients and normal healthy control group populations have significant difference by means of the scATAC-seq technology, so that the transcription factors with different expression levels can be used as markers for diagnosis, prognosis evaluation or drug screening of uremia.)

尿毒症标志物及其应用

技术领域

本发明涉及肾病技术领域，尤其是涉及一种尿毒症标志物及其应用。

背景技术

尿毒症(uremia)是指各种原因导致的肾脏功能进行性减退，直至肾功能丧失并最终进入终末阶段时所出现的一系列临床表现和代谢紊乱所组成的临床综合征。紊乱的内环境容易引起慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)患者的表观遗传特征发生改变，并通过表观遗传机制影响基因表达，从而加速CKD向尿毒症(终末期肾脏病)发展。现阶段越来越多的研究也证明了这一点。研究显示，CKD患者中均有不同程度的DNA甲基化，同时，DNA甲基化也受到尿毒症成分的影响。CKD5期患者的炎性反应会导致异常的DNA高甲基化，并且与不良预后有关。而在对进行透析的肾脏肿瘤患者和肾功能正常的肾脏肿瘤患者开展表观遗传学检测时发现，前者的各种基因呈现出DNA的高甲基化，这证明CKD和透析可能会促进DNA的高甲基化。上述实验结果表明，尿毒症环境改变了机体表观遗传的特征，进而导致转录水平改变。而与基因突变不同的是，表观遗传改变是动态的，而且可能是可逆的，因此从表观遗传角度分析疾病的发生发展有重大意义。

ATAC-seq(Assay for Transposase-Accessible Chromatin with highthroughput sequencing)是以高通量测序为基础的从表观遗传角度研究染色质开放性(或称染色质可进入性)的新兴科研技术，原理是利用转座酶Tn5容易与开放染色质进行特异结合的特性，对Tn5酶所捕获到的DNA序列片段进行测序，将测序结果与人类基因组信息比对，分析DNA的开放区域，通过进一步的motif分析，在全基因组范围预测转录因子结合位点(Transciption Factor Binding Site，TFBS)。与传统的DNase-Seq及FAIRE-seq等研究开放染色质的方法相比，ATAC-seq以细胞量要求少、低成本、短周期、大数据、无需抗体富集、可以在全基因组范围内检测染色质的开放状态等优势。目前单细胞ATAC-Seq在染色体开放性图谱分析、表观修饰差异研究、胚胎发育表观遗传修饰、肿瘤发生表观机制研究、肿瘤异质性与分型研究、疾病潜在标志物预测等领域已有较为广泛的应用。

目前关于尿毒症及其相关并发症的发生发展机制仍不清楚，其特异性生物标志物目前仍未被发现。因此，有必要借助ATAC-seq技术发现尿毒症特异性生物标志物。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种尿毒症标志物及其应用。

第一方面，本发明的一个实施例提供了一种尿毒症标志物，包括以下至少一种：ESRRG、TEAD2、HOXC10、TEAD1、FOS、GRHL1、PAX7、PAX3、PBX1、MAFG、GCM2、NR3C1、NR3C2、JUN、PBX2、SCRT2、MYBL2、SPDEF、STAT1、NEUROG2、JDP2、FOSB。

本发明实施例的肠道菌群标志物至少具有如下有益效果：

发明人借助scATAC-seq技术发现尿毒症患者与正常健康对照组人群的样本中，多个转录因子的表达水平存在显著差异，因此，可以将这些差异表达的转录因子作为标志物用于尿毒症的诊断、预后评估或筛药。

第二方面，本发明的一个实施例提供了上述尿毒症标志物在制备尿毒症诊断和/或预后试剂中的应用。上述尿毒症标志物在尿毒症患者与正常健康对照组人群中存在差异表达，因此，可以通过定量检测受试者样本中的上述尿毒症标志物来实现对尿毒症的诊断或对其预后的评估。

第三方面，本发明的一个实施例提供了上述的尿毒症标志物在筛选预防和/或治疗尿毒症的药物中的应用。上述尿毒症标志物在尿毒症患者与正常健康对照组人群中存在差异表达，因此，可以通过定量检测用药后的样本中的上述尿毒症标志物来实现对候选药物药效的评估，从而达到筛药的目的。

第四方面，本发明的一个实施例提供了一种试剂盒，该试剂盒包括用于定量检测上述尿毒症标志物的试剂。通过该试剂实现对受试者样本中尿毒症标志物的定量检测，在与预设的阈值进行比较后，得到的结果能够有效地用于诊断尿毒症，或评估尿毒症的预后，或筛选尿毒症药物。

第五方面，本发明的一个实施例提供定量检测上述尿毒症标志物的试剂在制备尿毒症的诊断试剂盒中的应用。利用该试剂得到的尿毒症诊断产品能够对受试者样本中的尿毒症标志物实现定量检测，检测结果在与预设的阈值进行比较后，可以准确地用于诊断尿毒症，或评估尿毒症的预后，或筛选尿毒症药物。

根据本发明的一些实施例，该试剂在基因水平和/或蛋白质水平上定量检测上述的尿毒症标志物。例如，通过PCR定量检测样本中尿毒症标志物的核酸片段的含量，或通过酶联免疫分析、放射免疫分析、Western印迹法、蛋白芯片法等定量检测样本中尿毒症标志物的蛋白质的表达量。

第六方面，本发明的一个实施例提供了一种评估尿毒症风险的方法，该方法包括以下步骤：

(1)获得受试者样本中尿毒症标志物的相对丰度；

(2)将相对丰度与预设阈值进行比较，根据比较结果判断尿毒症风险；

该方法不适用于疾病的诊断和/或治疗。

其中，尿毒症风险是指受试者患有尿毒症的风险，或者指受试者的预后；或者指候选药物对尿毒症的效用。预设阈值是指正常对象的尿毒症标志物的临界值，具体可以是来自正常健康对照组样品测得的尿毒症标志物的相对丰度值，或经标准化后的相对丰度值。

根据本发明的一些实施例的方法，在根据标志物的相对丰度结果直接判断尿毒症风险时，满足以下至少一种条件，可以判断受试者患有尿毒症，或者尿毒症患者的预后较差，或者候选药物不符合筛选条件：

(1)ESRRG的相对丰度比预设阈值高；

(2)TEAD2的相对丰度比预设阈值高；

(3)HOXC10的相对丰度比预设阈值高；

(4)TEAD1的相对丰度比预设阈值高；

(5)FOS的相对丰度比预设阈值高；

(6)GRHL1的相对丰度比预设阈值低；

(7)PAX7的相对丰度比预设阈值高；

(8)PAX3的相对丰度比预设阈值高；

(9)PBX1的相对丰度比预设阈值高；

(10)MAFG的相对丰度比预设阈值高；

(11)GCM2的相对丰度比预设阈值低；

(12)NR3C1的相对丰度比预设阈值高；

(13)NR3C2的相对丰度比预设阈值高；

(14)JUN的相对丰度比预设阈值低；

(15)PBX2的相对丰度比预设阈值低；

(16)SCRT2的相对丰度比预设阈值低；

(17)MYBL2的相对丰度比预设阈值低；

(18)SPDEF的相对丰度比预设阈值低；

(19)STAT1的相对丰度比预设阈值高；

(20)NEUROG2的相对丰度比预设阈值高；

(21)JDP2的相对丰度比预设阈值低；

(22)FOSB的相对丰度比预设阈值低。

第七方面，本发明的一个实施例提供了一种计算机可读存储介质，该计算机可读存储介质存储有计算机可执行指令，用于执行上述的方法。通过执行上述方法，可以准确有效地确定受试者是否患有尿毒症，或尿毒症患者的预后情况，或对候选药物的尿毒症药效。

第八方面，本发明的一个实施例提供了一种评估尿毒症风险的系统，该系统包括：

检测装置，用于确定受试者样本中尿毒症标志物的相对丰度；

比对装置，用于将相对丰度与预设阈值进行比较，根据比较结果判断尿毒症风险。

附图说明

图1是本发明的实施例1的尿毒症PBMC亚群差异转录因子motif鉴定结果。

图2是本发明的实施例1的尿毒症患者的转录因子功能富集和炎症反应分析结果。

图3是本发明的实施例2的用于评估尿毒症风险的系统的组成示意图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1

1.实验对象的选择

选取了20个样本，分别为疾病组：10名尿毒症期患者；正常健康对照组：10名健康对照组志愿者。所有尿毒症患者均为来自深圳市人民医院血液透析中心的病人，病因是慢性肾炎，无高血压、糖尿病、继发性肾病(如系统性红斑狼疮)等疾病的病史。所有的健康对照组志愿者均来自深圳市人民医院体检科，健康对照组与疾病组在种族、年龄、性别上相匹配。在研究期间，所有尿毒症患者和健康对照组志愿者均未使用降脂类药物、激素以及免疫抑制剂等药物。

2.外周血单个核细胞(PBMC)样本的获取

(1)抽取研究对象空腹8h以上的外周静脉血3mL/人，用等倍体积的生理盐水进行稀释，混匀后加入到6mL淋巴细胞分离液中。

(2)2000rpm，20℃离心15min；离心后可见液面由下至上分为：红细胞层、淋巴液层、单个核细胞层和血浆层四层，收集并转移单个核细胞层到无菌离心管中。

(3)加入PBS，2000rpm，20℃离心15min，移除上清液，重复一次。

(4)加入1mL红细胞裂解液，混匀并转移至1.5mL无菌EP管中，4℃冰箱静置40min，1600rpm，20℃离心5min，弃去上清液获细胞沉淀。

(5)加入1mLPBS，1600rpm，20℃离心5min，弃去上清液获细胞沉淀，重复操作共两次。

(6)加入含0.04％BSA的PBS，分别混合10例尿毒症患者和10例对照组的PBMC，各浓缩至1mL，制备PBMC悬液。放置于4℃冰箱保存备用。

3.scATA-seq PBMC悬液处理及上机测序

(1)取20μL PBMC悬液和20μL 2％台盼蓝混匀，并从中吸取20μL加于血细胞计数板中计算计活。用0.04％BSA的PBS稀释PBMC至2×10⁶个/mL，并使用40μm Flowmi细胞过滤器过滤。使用台盼蓝计算计活滤后的PBMC，细胞活性大于85％可进行下一步实验。

(2)转移1×10⁶个PBMC到无菌离心管中，3000g，20℃离心5min，弃去上清液。加入100μL冷的裂解缓冲液，混匀冰浴3min；加入1mL冷的清洗液，500g，20℃离心5min，弃去上清液；加入冷的稀释10倍后的细胞核缓冲液，冰浴保存待用。

(3)使用血细胞计数板及显微镜计数细胞核。取10μL 30％ATAC转座酶和5μL稀释后的细胞核液，混匀后37℃孵育60min，放置于4℃冰箱保存。混匀15μL上述细胞核液和65μL反应混合物，取75μL上述混合样品及凝胶珠至10×Genomics铬芯片(10×Genomics，PN-1000086)，利用微流控技术形成油滴包裹的GEMs；从回收孔中吸取100μL GEMs至PCR-8排管中，使用热循环仪溶解GEMs中的凝胶珠，生成10×barcode标记的单链DNA。

(4)每个样品加入125μL回收试剂，混匀后离心，移去底层125μL红色油层。加入200μL清洁混合物震荡混匀后室温放置10min，移除上清液。用80％的乙醇300μL洗涤沉淀，静置30s后移去乙醇。加入80％的乙醇200μL，静置30s，离心移除乙醇后加入洗脱液I 40.5μL，混匀后室温静置1min，溶液澄清后将40μL样品移至新的排管。使用SPRIselect Reagent Kit纯化样品，将纯化的样品与48μL SPRIselect Reagent混匀，室温反应5min，离心后移除上清液。加入80％乙醇200μL，静置30s，移去乙醇后重复清洗一次。加入40.5μL Buffer EB，混匀后室温静置2min，溶液澄清后将40μL样品移至新排管；-20℃保存(2周)。

(5)混合样本索引扩增试剂和40μL样品，使用热循环仪扩增样品。将样品与40μLSPRIselect Reagent混合，反应5min后将130μL上清液移至新的排管。再将样品与74μLSPRIselect Reagent混合，室温下反应5min后移去上清液。加入80％乙醇200μL，静置30s后移去乙醇并重复清洗一次。加入20.5μL Buffer EB混匀，静置2min后将澄清样品20μL移至新的排管，-20℃冰箱保存。使用Qubit3.0检测文库样本浓度(DNA浓度检测区间参考浓度为：0.2-100ng/μL)，在Agilent 2100芯片上检测1μL样品，测定DNA片段大小来评估文库的分布。使用文库定量试剂盒(KAPALibrary Quantification Kit，KAPABiosystems，KK4824)检测片段范围在150-1000kb的DNA浓度，筛选质检合格的样本在Illumina平台上进行后续的测序。

4.scATAC-seq数据生物信息学分析

原始数据预处理：先用Trimmomatic过滤带接头的序列；去除含有>5％的无法确定碱基信息的序列；过滤低质量序列(质量值≤10的碱基数占整个序列的20％以上)。

数据比对：以人类基因组GRCh38为参考，使用bowtie对上述处理后筛选的有效序列进行比对，分析DNA序列在基因组上的分布。

分析数据：

1)富集峰(peak)识别：利用MACS软件进行峰识别(peak calling)，默认P<10-5，识别基因组上的ATAC富集峰。

2)Peak长度分布：根据ATAC-seq识别开放区域的DNA片段长度，对富集峰的Count数进行统计。

3)分析TSS(Transcription Start Site)富集情况、FRiP(Fraction of Reads incalled Peak)值来评估样本富集效果、计算IDR(Irreproducibility Discovery Rate)值来评估重复样本间peaks一致性。

4)Peak相关基因注释：寻找开放染色质区域的基因，并根据注释信息，绘制富集峰在不同基因组特征上的比例图。

5)通过PCA分析确定不同的细胞亚群，该方法可以将表型非常相近的细胞进行分类。

6)样本间差异peak分析，比较不同时期不同细胞的染色质开放程度差异，揭示尿毒症环境染色质特异的表观遗传特点。

7)根据转录因子motif富集，分析转录起始位点和相关转录因子，探索尿毒症关键的转录因子。

8)差异peak相关基因分析，以及相关基因GO、KEGG富集分析，分析差异基因导致的生物学功能改变，并预测其与尿毒症并发症的相关性。

5.RNA-seq PBMC悬液处理及上机测序

(1)离心步骤3操作所得到的细胞(约1×10⁶个/管)，弃去上清液后加入PBS1 mL，轻轻悬浮细胞沉淀，并转移至2mL旋盖尖底离心管中。离心移除PBS后加入1mL细胞裂解液，反复吹打至清亮不粘稠液体，室温静置5min，-80℃冰箱保存。

(2)常温下解冻上述液体后加入氯仿200μL，混匀后冰上静置3min，12000rpm，4℃离心5min。转移上层水相至新的EP管中，加入等量异丙醇混匀后冰浴10min，离心后移除上清液，加入75％乙醇600μL混匀后离心，移除上清液，室温干燥10min，最后加入无RNA酶的纯水50μL溶解沉淀。利用分光光度法和毛细管电泳结合RNA6000Nano试剂盒评估所提取的RNA质量。

(3)用磁珠富集和纯化mRNA(带polyA尾)。去磷酸和加磷酸处理片段化处理后的mRNA，使磷酸基团加到mRNA5′端，羟基基团加到3′端。利用T4RNA连接酶2分别在mRNA的两端接上一个腺苷化单链DNA3′接头和5′接头。通过反转录合成cDNA。利用brads筛选350-450碱基长度的RT产物。15个循环PCR扩增后建立数据文库。使用Illumina Hiseq 2500进行测序，测序读长为双端2×150bp。

6.RNA-seq数据生物信息学分析

数据筛选：先过滤带接头的序列；去除含有>5％的无法确定碱基信息的序列，过滤低质量序列。以人类基因组GRCh38为参考，使用TopHat2程序进行比对，分析测序数据与GRCh38比对的序列数、区域分布情况等。

数据分析：

1)基因表达水平分析：使用FPKM2分析各基因表达的水平；

2)基因差异表达分析，对不同组别间的基因做差异分析，差异阈值为P＜0.05，筛选显著变化(3-5倍)的候选基因进一步分析；

3)差异基因功能分析，GO富集分析和KEGG信号通路富集性分析。

联合scATAC-seq数据和RNA-seq数据，分析尿毒症内环境下各细胞亚型的染色体开放区域，明确潜在的调控原件目录以及相关转录因子，描绘尿毒症环境PMBC的转录调控网络，结合临床资料，分析尿毒症发生发展的关键调控网络。

结果如图1所示，图1为本发明的实施例1的尿毒症PBMC亚群差异转录因子motif鉴定结果。其中，A、B、C、D、E分别表示PBMCs的CD4+T细胞亚群、CD8+T细胞亚群、T辅助17细胞(Thelper 17cells)亚群、NK细胞亚群和B细胞亚群中尿毒症患者的差异转录因子motif的鉴定结果。图中的左列为聚类分析的火山图，火山图中横坐标-0.1左侧为下调表达、0.1右侧为上调表达；中列为聚类分析的热图，热图中NC_PBMC为正常健康对照组，UR_PBMC为尿毒症患者组；右列为motif的碱基分布图。

从图1中可以看到，与正常健康对照组对比，尿毒症环境下：

(1)CD4+T细胞中，TEAD2 motif、HOXC10 motif、TEAD1 motif、FOS motif上调表达，GRHL1 motif下调表达；

(2)CD8+T细胞中，PAX7 motif、PAX3 motif、PBX1 motif、MAFG motif上调表达，GCM2 motif、MYBL2 motif、NFYA motif下调表达；

(3)T辅助17细胞中，STAT1 motif、NEUROG2 motif、TEAD2 motif上调表达，JDP2motif、FOSB motif下调表达；

(4)NK细胞中，TEAD1 motif、TEAD2 motif、NR3C1 motif、NR3C2 motif上调表达，JUN motif、PBX2 motif、SCRT2 motif、MYBL2 motif、SPDEF motif下调表达；

(5)B细胞中，ESRRG motif上调表达。

由于转录因子在于DNA序列结合时，其结合位点序列的特异性，上述转录因子motif的差异性表达能够反映出，针对这些结合位点序列的转录因子同样在尿毒症患者中出现了明显的差异性表达。因而，可以采用上述鉴定得到的差异转录因子用于尿毒症的诊断、预后或筛药工作。

图2是本发明的一个实施例的尿毒症患者的转录因子功能富集和炎症反应分析结果。其中，A为GO富集分析结果，B和C为KEGG富集分析结果，D为炎症反应分析结果。从图中可以看到，鉴定的差异转录因子在不同程度地激活了机体炎症和免疫相关通路：TNF信号通路、P53信号通路、Wnt信号通路、IL-17炎症通路。

实施例2

本实施例提供一种评估尿毒症风险的系统。图3是本发明的实施例2的用于评估尿毒症风险的系统的组成示意图。参考图3，本实施例提供一种评估尿毒症风险的系统，该系统包括：核酸分离装置100，用于从受试者的粪便样本中分离核酸样本；测序装置110，用于检测核酸样本中尿毒症标志物，用于将标志物的相对丰度与预设阈值进行比较，根据两者的相对大小判断尿毒症风险。

实施例3

本实施例提供一种计算机可读存储介质，该计算机可读存储介质存储有计算机可执行指令，用于执行以下方法：

(1)获得受试者样本中尿毒症标志物的相对丰度；

(2)将相对丰度与预设阈值进行比较，根据比较结果判断受试者是否患有尿毒症、尿毒症患者的预后情况，或者筛选药物。

实施例4

本实施例提供一种蛋白芯片，该蛋白芯片包被有ESRRG、TEAD2、TEAD1、FOS、MAFG的抗体，利用该蛋白芯片和对应的检测试剂可以对受试者血清样本中的上述几种标志物的相对丰度进行检测，将检测结果与预设阈值进行比较，可以有效判断受试者是否患有尿毒症。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所述技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。