阅读说明：本技术 用于检测尼古丁依赖相关的snp位点的引物组、应用、产品及方法 (Primer group, application, product and method for detecting nicotine dependence related SNP site ) 是由 李萌 夭建华 朱洲海 管莹 陆舍铭 徐玉琼 彭琪媛 唐萍 缪明明 陈章玉 李雪梅 于 2020-06-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及用于检测尼古丁依赖相关的SNP位点的引物组、应用、产品及方法,属于生物技术领域。所述的SNP位点位于人基因组第9号染色体的8561542至9916353区间段,位于PTPRD基因的内含子区间。本发明提供了用于检测这些SNP位点的引物对,以及一种鉴定它们等位基因型的简便方法。同时提供了检测上述SNP位点的试剂在制备用于检测尼古丁依赖易感性的检测制剂或检测装置中的应用。本发明对检测中国人群个体的尼古丁依赖易感性具有重要参考价值,在将来开发预防尼古丁依赖的药物过程中也有广阔的应用前景。(The invention relates to a primer group, application, a product and a method for detecting nicotine dependence related SNP sites, and belongs to the technical field of biology. The SNP locus is located in the section from 8561542 to 9916353 of chromosome 9 of the human genome and in the intron section of the PTPRD gene. The present invention provides primer pairs for detecting these SNP sites, and a simple method for identifying their allelic forms. Simultaneously provides the application of the reagent for detecting the SNP locus in the preparation of a detection preparation or a detection device for detecting the nicotine dependence susceptibility. The invention has important reference value for detecting the susceptibility of individual nicotine dependence of Chinese population, and has wide application prospect in the process of developing the medicament for preventing nicotine dependence in the future.)

用于检测尼古丁依赖相关的SNP位点的引物组、应用、产品及 方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于检测尼古丁依赖相关的SNP位点的引物组、应用、产品及方法。

背景技术

吸烟行为不仅与生活环境息息相关，还会受到遗传因素的影响。在遗传上，吸烟行为可能与神经递质系统、代谢酶等多种基因的多态性相关。已有多项研究识别出了多个与吸烟行为相关的基因组区域，这些区域分别位于第3-7、9-11、17、20及22等染色体上。尼古丁作为烟草中存在的一种化学物质，产生尼古丁依赖是影响吸烟者持续吸烟的重要因素。已有研究表明尼古丁依赖受到烟碱乙酰胆碱受体、多巴胺转运体蛋白以及五羟色胺受体等基因的影响。

蛋白质酪氨酸磷酸酶是一种能够调控细胞生长、分化、有丝分裂周期的信号分子。受体型蛋白酪氨酸磷酸酶D(PTPRD)基因对尼古丁依赖的产生有重要影响，例如PTPRD基因上的SNP rs 1975197、rs4626664及rs2381970能够通过改变PTPRD基因的表达进而影响尼古丁依赖的程度。但是，关于PTPRD基因上与尼古丁依赖相关的SNP位点的证据还较少，目前仅有个别SNP有充分的证据支持与尼古丁依赖相关的结论。此外，对如何通过PCR简单高效地获取PTPRD基因上包含与尼古丁依赖相关的SNP位点的序列还没有相关报道。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种用于检测尼古丁依赖相关的SNP位点的引物组、应用、产品及方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

用于检测尼古丁依赖相关的SNP位点的引物组，所述的引物组对应的SNP位点为rs71507664、rs35841018、rs115729775、rs77835962、rs35831393、rs71497118、rs71492010、rs76717037、rs12347862、rs1323791、rs10816208、rs10816209、rs10816210、rs10978037、rs10978038、rs10978039、rs1408117、rs1408118、rs10816211、rs10816212、rs10816213、rs10978042、rs10978043、rs12380595、rs72692730、rs10978078、rs72692731、rs72692733、rs72692735和rs72692736；

所述的引物组包括30对引物对，所述引物对如SEQ ID NO.1-60所示的核苷酸序列。

本发明还提供用于检测尼古丁依赖相关的SNP位点的引物组在制备用于检测尼古丁依赖易感性产品中的应用。

本发明提供一种用于检测尼古丁依赖易感性产品，所述产品包括上述的引物组。所述的产品可以为试剂、试剂盒、检测装置等。

进一步，优选的是，所述产品还包括用于检测上述SNP位点的试剂。

本发明另外提供检测多个单核苷酸多态性位点的试剂在制备用于检测尼古丁依赖易感性的检测制剂或检测装置中的应用，所述多个单核苷酸多态性位点包括以下30个单核苷酸多态性位点：

rs71507664、rs35841018、rs115729775、rs77835962、rs35831393、rs71497118、rs71492010、rs76717037、rs12347862、rs1323791、rs10816208、rs10816209、rs10816210、rs10978037、rs10978038、rs10978039、rs1408117、rs1408118、rs10816211、rs10816212、rs10816213、rs10978042、rs10978043、rs12380595、rs72692730、rs10978078、rs72692731、rs72692733、rs72692735和rs72692736。

进一步，优选的是，rs71507664等位基因型为A、rs35841018等位基因型为T、rs115729775等位基因型为A、rs77835962等位基因型为G、rs35831393等位基因型为C、rs71497118等位基因型为C、rs71492010等位基因型为A、rs76717037等位基因型为G、rs12347862等位基因型为C、rs1323791等位基因型为G、rs10816208等位基因型为C、rs10816209等位基因型为G、rs10816210等位基因型为C、rs10978037等位基因型为A、rs10978038等位基因型为A、rs10978039等位基因型为C、rs1408117等位基因型为C、rs1408118等位基因型为T、rs10816211等位基因型为G、rs10816212等位基因型为G、rs10816213等位基因型为A、rs10978042等位基因型为C、rs10978043等位基因型为C、rs12380595等位基因型为T、rs72692730等位基因型为C、rs10978078等位基因型为T、rs72692731等位基因型为C、rs72692733等位基因型为T、rs72692735等位基因型为A、rs72692736等位基因型为T。

进一步，优选的是，待测样品来自待测个体的血液、尿、唾液、胃液、头发或活组织检查。

本发明最后提供一种检测尼古丁依赖相关的SNP位点基因型的方法，包括以下步骤：

(1)待检测人全基因组DNA为模板，分别采用SEQ ID NO.1-60所示的30对引物对进行PCR扩增，得到扩增片段；

(2)扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳分离目的条带，切胶回收产物，随后用sanger测序法判定尼古丁依赖相关的SNP位点基因型。

进一步，优选的是，PCR扩增体系为：

Taq DNA聚合酶1μL，正向引物10pmol/μL 0.6μL，反向引物10pmol/μL 0.6μL，模板DNA 2μL，10x buffer 2μL，dNTP 2.5mM 1.6mL，ddH₂O 12.2μL，总计20μL。

进一步，优选的是，PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性45s，55℃或采用表1中的退火温度退火45s，72℃延伸45s，共45个循环；72℃最后延伸5min，4℃保存。

本发明对于检测装置的具体结构不做限制，例如，包括检测单元，用于检测待测个体携带多个单核苷酸多态性位点的等位基因情况的检测单元，获得检测结果；还包括数据分析单元，用于对检测单元的检测结果进行分析处理的处理单元，获得待测个体尼古丁依赖易感性。

本发明提供了一系列与尼古丁依赖风险相关的单核苷酸多态性位点(SNP)。本发明在超过1500个中国人群样本中进行基因分型和表型关联分析，得到了30个与中国汉族人群尼古丁依赖相关的SNP。所述SNP位点的物理位置是根据人参考基因组GRCh37/hg19确定的，SNP的编号的来源为dbSNP 151。所述的SNP位点位于人基因组第9号染色体的8561542至9916353区间段，位于PTPRD(受体型蛋白酪氨酸磷酸酶D)基因的内含子区间。

所述的多个单核苷酸多态性位点包括：rs71507664、rs35841018、rs115729775、rs77835962、rs35831393、rs71497118、rs71492010、rs76717037、rs12347862、rs1323791、rs10816208、rs10816209、rs10816210、rs10978037、rs10978038、rs10978039、rs1408117、rs1408118、rs10816211、rs10816212、rs10816213、rs10978042、rs10978043、rs12380595、rs72692730、rs10978078、rs72692731、rs72692733、rs72692735及rs72692736。通过这些单核苷酸多态性位点，可以开展尼古丁依赖的关联分析。

同时，研究发现这些位点的相关基因型分别是：rs71507664等位基因型为A、rs35841018等位基因型为T、rs115729775等位基因型为A、rs77835962等位基因型为G、rs35831393等位基因型为C、rs71497118等位基因型为C、rs71492010等位基因型为A、rs76717037等位基因型为G、rs12347862等位基因型为C、rs1323791等位基因型为G、rs10816208等位基因型为C、rs10816209等位基因型为G、rs10816210等位基因型为C、rs10978037等位基因型为A、rs10978038等位基因型为A、rs10978039等位基因型为C、rs1408117等位基因型为C、rs1408118等位基因型为T、rs10816211等位基因型为G、rs10816212等位基因型为G、rs10816213等位基因型为A、rs10978042等位基因型为C、rs10978043等位基因型为C、rs12380595等位基因型为T、rs72692730等位基因型为C、rs10978078等位基因型为T、rs72692731等位基因型为C、rs72692733等位基因型为T、rs72692735等位基因型为A、rs72692736等位基因型为T。

本发明涉及的上述SNP位点经注释发现位于PTPRD基因的内含子区域。

本发明涉及提供了用于扩增上述位点基因型的引物对，如表1所示。

表1

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

(1)本发明提供的30个SNP位点基于中国人群全基因组测序数据关联分析得到，与中国人群中的尼古丁依赖易感性具有较强的相关性，能够有效提高检测的效率；

(2)本发明开发的用于扩增上述SNP位点的引物对，特异性强，灵敏度高，针对不同个体的适用性较好，整个鉴定流程容易理解，操作简便，结果准确可靠，可以广泛应用于中国人群个体中上述SNP位点的鉴定；

(3)本发明提供了一种鉴定上述SNP位点等位基因型的方法，该方法操作简便，结果准确可靠。

附图说明

图1为Haploview软件检测到的PTPRD基因上SNP位点的单倍型块(haplotypeblock)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1

用于检测尼古丁依赖相关的SNP位点的引物组，所述的引物组对应的SNP位点为rs71507664、rs35841018、rs115729775、rs77835962、rs35831393、rs71497118、rs71492010、rs76717037、rs12347862、rs1323791、rs10816208、rs10816209、rs10816210、rs10978037、rs10978038、rs10978039、rs1408117、rs1408118、rs10816211、rs10816212、rs10816213、rs10978042、rs10978043、rs12380595、rs72692730、rs10978078、rs72692731、rs72692733、rs72692735和rs72692736；

所述的引物组包括30对引物对，所述引物对如SEQ ID NO.1-60所示的核苷酸序列。

实施例2

一种用于检测尼古丁依赖易感性产品，所述产品包括实施例1所述的引物组。

实施例3

一种用于检测尼古丁依赖易感性试剂盒，所述产品包括实施例1所述的引物组，还包括Taq DNA聚合酶、10x buffer、dNTP。

实施例4

1.外周血采集及DNA提取

外周血采血一般采用真空采血管采集，收集好的全血应在5min中内用液氮速冻，保存于-80℃冰箱。加入EDTA抗凝剂后的新鲜血液一般可以在4℃放置12-24小时。务必保证经过速冻后的样本要低温保存，且必须避免反复冻融。

本发明中的外周血DNA提取包括以下步骤：首先向2mL全血中加入5倍体积的1x红细胞裂解液，涡旋并弃上清；然后加入白细胞裂解液0.5mL和20mg/ml蛋白酶K 20μL，37℃水浴裂解白细胞至沉淀溶解；再加入等体积的氯仿待分层后转移上清至新EP管中，加入1/10体积的3M醋酸铵和等体积的冰乙醇沉淀DNA，用1mL的体积浓度为75％乙醇洗涤后自然干燥，加入TE溶解即可得到DNA。为确保后续血液样本的核酸提取质量合格，每个样本应提取1μg以上的全基因组DNA，浓度>12.5ng/μL，OD260/280在1.8～2.0之间。DNA质量检测包括完整性、总量及浓度的检测，可采用Qubit或AGE仪器完成。DNA样品含量检测可采用以下两种方法的一种：荧光定量或琼脂糖凝胶电泳检测。荧光定量主要对样品浓度进行精确定量(如Qubit Fluorometer)，琼脂糖凝胶电泳使用质量浓度为1％的琼脂糖凝胶在150V电压下电泳约40min(缓冲液为1x TAE)，检测样品完整性及是否存在RNA、蛋白和次生代谢物污染。根据DNA总量和浓度对血样给出等级判定。优：DNA总量≥2μg、浓度≥12.5ng/μL且样品没有降解或者轻微降解。良：DNA总量介于1～2μg、浓度≥12.5ng/μL且样品没有降解或者轻微降解。尽量选用质量检测为优的DNA样品进行后续的工作。

2.单核苷酸多态性检测

利用本发明中根据基因多态性区域特征设计的引物对，以上述DNA样品为模板进行PCR扩增得到包含多态性区域的DNA片段。具体如下：

PCR反应20μL体系：Taq DNA聚合酶1μL，正向引物10pmol/μL 0.6μL，反向引物10pmol/μL 0.6μL，模板DNA 2μL，10x buffer 2μL，dNTP 2.5mM 1.6mL，ddH₂O 12.2μL，总计20μL。

PCR反应条件如下：94℃预变性3min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共45个循环；72℃最后延伸5min，4℃保存。

PCR扩增完成后用琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收产物，随后用sanger测序得到样本中上述单核苷酸多态性位点的基因型。

3.本发明涉及的单核苷酸多态性位点与尼古丁依赖的关联性验证

为确定本发明中的单核苷酸多态性位点与尼古丁依赖相关，选取617例吸烟者与441例对照进行验证。采用PLINK(v.1.9)进行单点关联分析，所采用的模型为additivegenetic model。上述实验的结果总结于表2。rs10978078、rs72692730及rs115729775的显著性均达到1×10^-4。

表2

为了进一步验证上述位点与尼古丁依赖的相关性，使用Haploview软件(v.4.2)检测连锁不平衡及单倍型块(haplotype block)，结果见图1。从图1上可以看出，本发明涉及的30个SNP位点总共形成了6个单倍型块。随后使用HaploStats软件包(v.1.7.7)进一步进行单倍型关联分析。分析结果见表3。从结果可以看出，由rs71507664-rs35841018-rs115729775-rs77835962-rs35831393-rs71497118、rs71492010-rs76717037、rs12347862-rs1323791-rs10816208-rs10816209-rs10816210-rs10978037-rs10978038-rs10978039-rs1408117-rs1408118-rs10816211-rs10816212-rs10816213、rs10978042-rs10978043-rs12380595、rs72692730-rs10978078及rs72692731-rs72692733-rs72692735-rs72692736组成的单倍型均与尼古丁依赖存在关联性。

表3

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 云南中烟工业有限责任公司

<120> 用于检测尼古丁依赖相关的SNP位点的引物组、应用、产品及方法

<160> 60

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

gggattacag gcgtgaacca 20

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

cacagattcc agtggcaggt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

gggattacag gtgtgtgcca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

ggtgggtgga tcacttgagg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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tcagctttgg ccgattcagt 20

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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agatgcagaa aaggcctttg a 21

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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tgttgccatt gctttgggtg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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gctgaaactg gatcccttcc t 21

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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tggatcttag cttgctgggc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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ccaagctagc tgcaggagtt 20

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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tccttctggc aagttctcca 20

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<212> DNA

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ggccaaaaga gtcctgagga 20

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<212> DNA

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aaaatagctc tctggccggg 20

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<212> DNA

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cttcgtgatc cacccacctc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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aaattacccg ggcatggtgg 20

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<212> DNA

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catgccattc tcctgcctca 20

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gcagacaaaa actattagat atggaga 27

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actctagaca ctatagcagg tttct 25

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acattcaaaa acctctcttc tagct 25

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<213> 人工序列()

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tggtgatgtt ctgttgcatg g 21

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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ggacccatcc ttttctgcct 20

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<213> 人工序列()

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tggctttact cctcttgcca 20

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atgcccccat ggaaaatggt 20

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tccttgtaca ttcctttctc cttct 25

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ctttgccctc aatgtctggc 20

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cattggaatg gagccctgag t 21

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ccgtgtgcag agagtgactc 20

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gagtcactct ctgcacacgg 20

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ccactagctg taatatggac tcca 24

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agaagctcac aggatgctgg 20

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tgtaaaactt cagcttccac tagc 24

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agtctggttg aagaaagaga aca 23

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tgcattcttc atatcttcac ttttcact 28

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<213> 人工序列()

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tcactcctta acaccaatca gaact 25

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 36

gcctgtggct ctctattcac t 21

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 37

gctagtagca gacaaatgtg gac 23

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 38

gcaggtttga agtcacaggc 20

<210> 39

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 39

gctagtagca gacaaatgtg gac 23

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 40

gcaggtttga agtcacaggc 20

<210> 41

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 41

agagacacaa acacctttcc aga 23

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 42

gcagagaagg ttgaagcagg 20

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 43

acaacaacaa actcctctgg t 21

<210> 44

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 44

tgttcatggc catgtgaatt tt 22

<210> 45

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 45

tgaagaaatg tttggttgtc tgca 24

<210> 46

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 46

tgttttgttt ctccttaccc aca 23

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 47

gagtcttgct ctgtctccca g 21

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 48

aatcgcttga acctgggagg 20

<210> 49

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 49

tttttctgtg ctggttgctt aa 22

<210> 50

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 50

acctagcatt tgtatgagtg cct 23

<210> 51

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 51

tgggaagttt ttgaaaatag gcact 25

<210> 52

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 52

tccaaagaag tgttaccgac ct 22

<210> 53

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 53

ccctaacatg cagctagctg t 21

<210> 54

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 54

ttgtcatttg tatgcatgcc tt 22

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 55

tcagtgctga agcctgacac 20

<210> 56

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 56

tgggttattg gcttctgaca tca 23

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 57

tagaagacac acagccaggc 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 58

acatgctctc ttggctggtc 20

<210> 59

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 59

tcactgatac acacaggaga aaga 24

<210> 60

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 60

gtgaggacgt acacctatca tt 22