阅读说明：本技术 一种一管式aldh2基因分型试剂盒及其检测方法 (One-tube type A L DH2 genotyping kit and detection method thereof ) 是由 王继国 陈普 于 2019-01-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种简单经济的一管式ALDH2基因分型试剂盒,包括如下组分：含三条引物组的直扩染料法qPCR预混液,阳性质粒对照及阴性对照,其特征在于所述三条引物组：ALDH2-F上游引物如SEQ ID NO：1所示；ALDH2-R下游引物如SEQ ID NO：2所示；ALDH2-MR突变型下游引物如SEQ ID NO：3所示。本发明所示试剂盒采取了一管式qPCR反应,省去了样品的抽提步骤,这不仅极大的节省了测试成本,而且避免了抽提过程中的污染风险。本试剂盒由于准确、快速、成本低廉,特别适合用于饮酒行为、酒精型肝硬化、肝癌等遗传因素的危险性分析,也是临床硝酸甘油指导用药的参考方法。(The invention discloses a simple and economical one-tube type A L DH2 gene typing kit, which comprises a direct dye amplification method qPCR premixed solution containing three primer groups, a positive plasmid control and a negative control, and is characterized in that the three primer groups are A L DH2-F upstream primer shown as SEQ ID NO: 1, A L DH2-R downstream primer shown as SEQ ID NO: 2 and A L DH2-MR mutant downstream primer shown as SEQ ID NO: 3.)

一种一管式ALDH2基因分型试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于医学检测领域，具体涉及一种简单经济的一管式ALDH2基因分型试剂盒及其检测方法。

背景技术

ALDH2全称aldehyde dehydrogenase 2family(mitochondrial)，中文名乙醛脱氢酶2。ALDH2基因位于第12号染色体的12q24.2位置，，它的主要多态性是rs671，即位于外显子12的G1510A。该位置发生由G突变为A的单碱基突变，使得Glu504突变为Lys504，该位点与ALDH2蛋白的空间结构有关，因此影响该酶的活性。正常的等位基因记为ALDH2*1，单碱基突变的等位基因记为ALDH2*2。Glu504纯合子(ALDH2*1/1)显示正常的酶活性；Glu504/Lys504杂合子(ALDH2*1/2)只有大约其正常活性的6％；而Lys504纯合子(ALDH2*2/2)对于乙醛降解基本上不具备酶活性。

ALDH2基因是编码线粒体乙醛脱氢酶的基因，具有脱氢酶活性，对人体内乙醛的氧化发挥主要的作用(即与体内代谢酒精的能力直接相关)。目前ALDH2基因分型检测特别适合用于饮酒行为、酒精型肝硬化、肝癌等遗传因素的危险性分析，同时ALDH2还有酯酶活性，可以催化硝酸甘油水解产生NO。硝酸甘油用于治疗心绞痛和心力衰竭已有130年的历史，舌下含服硝酸甘油片是抗冠心病心绞痛急性发作的常规首选药方，但其临床有效性受ALDH2基因型影响，目前ALDH2基因分型试剂盒用于临床硝酸甘油用药指导的主要方法。

目前临床使用及已发明专利的ALDH2基因分型试剂盒一般包括DNA微阵列芯片法、PCR毛细管电泳法、PCR荧光探针法、PCR-高分辨率熔解曲线法等方法。但是这些方法所有必须对样品基因组DNA提取，使得步骤繁琐，成本高昂，很难成为一种普查的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单经济的一管式ALDH2基因分型试剂盒，以便于为今后用于临床硝酸甘油用药指导的主要方法。

本发明的目的之二在于提供一种ALDH2基因分型的检测方法。

本发明在于根据等位特异性基因PCR方法设计和筛选的一套专门用于ALDH2基因分型的引物，使用该引物组可以通过荧光定量PCR熔解曲线对ALDH2基因分型。

本发明构建了一个直扩染料法qPCR反应液体系，通过该体系使得无需基因组DNA提取即可进行QPCR定量。

本发明构建了一种通过染料法定量PCR法熔解曲线中退火温度不同，区分三种基因型的方法。

为此，本发明公开了一种简单经济的一管式ALDH2基因分型试剂盒，包括：含三条引物组的直扩染料法qPCR预混液，阳性质粒对照及阴性对照，其特征在于所述三条引物组：

ALDH2-F上游引物：GTACGGGCTGCAGGCATAC；

ALDH2-R下游引物：GCCGCCCTGCCCGCCACACTCACAGTTTTC

ACTGCA；

ALDH2-MR突变型下游引物CCCACACTCACAGTTTTCACTATA。

进一步地，所述直扩染料法qPCR预混液的配方为：10份体积SYBR Green qPCRMaster Mix或EvaGreen qPCR Master Mix；3份体积引物组混合物，每条引物反应体系终浓度控制0.2uM左右；最后用无菌水补足到15份体积。

进一步地，所述直扩染料法qPCR预混液的配方为：10份体积KOD SYBR qPCR Mix；3份体积引物组混合物，每条引物反应体系终浓度控制0.2uM左右；0.04～0.4份体积的50×ROX；最后用无菌水补足到15份体积。

进一步地，所述直扩染料法qPCR预混液的配方为：0.5份体积5U/ul热启动TthDNAPolymerase或5U/ul TTX DNA Polymerase；10份体积的2×Reaction Buffer(含dUTP)；3份体积引物组混合物，每条引物反应体系终浓度控制0.2uM左右，0.04～0.4份体积的50×ROX；0.4份体积1U/ul UDG酶；0.4体积的50×Super EvaGreen；最后用无菌水补足到15份体积。

进一步地，所述阳性质粒对照为通过全基因合成的方式构建阳性对照质粒，ALDH2*1的阳性质粒中的基因序列

CGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACC，ALDH2*2阳性质粒中的基因序列：

CGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTAAAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACC。

进一步地，所述阴性对照为无菌水。

另一方面，本发明还公开了一种ALDH2基因分型的检测方法，包括下列步骤：

a)采取人口腔上皮细胞或外周血细胞样品；

b)将采集后的人口腔上皮细胞或外周血细胞并稀释好样品的5ul加入到15ul“直扩染料法qPCR预混液”中，进行在定量PCR上进行扩增，同时对两种基因型的阳性对照及阴性对照进行扩增；

c)熔解曲线分析：阴性对照扩增来排除“直扩染料法qPCR预混液”污染，两种阳性对照来的退火温度来确定两种基因型，同一批次反应可以采取一次阳性对照及阴性对照。

本发明的主要创新点在于：

本发明利用人口腔上皮细胞或外周血细胞直接加入到荧光定量PCR扩增体系中，利用优化的等位基因特异性PCR引物使得两种不同的基因型产生不同的退火温度，通过定量PCR溶解曲线能灵敏地区分两种ALDH2基因型。不同于目前所有的专利描述的方法，该试剂盒采取了一管式qPCR反应，省去了样品的抽提步骤，这不仅极大的节省了测试成本，而且避免了抽提过程中的污染风险。本试剂盒由于准确、快速、成本低廉，特别适合用于饮酒行为、酒精型肝硬化、肝癌等遗传因素的危险性分析，也是临床硝酸甘油指导用药的参考方法。

附图说明

图1阳性质粒ALDH2*1的熔解曲线。

图2阳性质粒ALDH2*2的熔解曲线。

图3 Glu504纯合子(ALDH2*1/1)的熔解曲线。

图4 Glu504/Lys504杂合子(ALDH2*1/2)的熔解曲线。

图5 Lys504纯合子(ALDH2*2/2)的熔解曲线。

具体实施方式

乙醛脱氢酶2(ALDH2)是NAD+依赖的乙醛脱氢酶超家族成员之一，目前已发现有19个乙醛脱氢酶家族成员，乙醛脱氢酶2是定位在线粒体内一种重要的醛类氧化酶，能将乙醇代谢中间产物乙醛氧化成乙酸。同时乙醛脱氢酶2可分解乙醛代谢产物4-羟壬烯醛,减轻乙醛及其代谢产物对细胞的氧化损伤。它是一个四聚体酶，大量表达在肝、肾和肺等组织，在线粒体功能活跃的心、脑组织等也有表达。近期有研究表明，该酶的激活对于心肌缺血再灌注导致的心肌细胞死亡有显著的保护作用。乙醛脱氢酶2基因具有多态性，其表达产物的487位氨基酸残基可以是谷氨酸(Glu487)或赖氨酸(Lys487)，因此该基因可以有Glu487纯合子(乙醛脱氢酶2*1/1)、Glu487/Lys487杂合子(乙醛脱氢酶2*1/2)和Lys504纯合子(乙醛脱氢酶2*2/2)等几种等位基因。其中，乙醛脱氢酶2*1/2活性为正常的10％～45％，乙醛脱氢酶2*2/2活性为正常的1％～5％。东方亚洲人群中该基因突变率为40％以上。目前关于乙醛脱氢酶2与癌症关系方面的研究很少，基本都集中在统计学方面，有多项统计数据显示，携带ALDH2突变基因型者大量饮酒将显著增加患多种癌的危险性，包括肝癌，食道癌等。

乙醛脱氢酶2基因多态性的主要检测方法：限制性片段长度多态性(RestrictionFragment Length Polymorphism)、单链构象多态性、PCR-ASO探针法、PCR-SSO法、PCR-SSP法、PCR-荧光法、PCR指纹图法、基因芯片法、AFLP(Amplication Fragment LengthPolymorphism)法：DGGE(denaturing gradinent electrophoresis)法、RAPD(Randomamplified polymorphic DNA)法，包括但不限于如CN105177159A、CN102758008A、CN103184268A、CN104120180A所示方法和检测试剂盒。

本发明在于一种无需提取人类人口腔上皮细胞或外周血细胞样品直接进行染料法定量PCR的方法，样品不限于如上来源。

本发明中直扩染料法qPCR反应液的配制成分采取多种抗抑制能力强的PCR配制好的一管型预混液，试剂形式以液体或冻干粉任何一种形式出现。

本发明中使用的抗抑制力强的PCR酶不限于KOD系列及rTth系列，也包括以Taq酶为基础抗抑制力强PCR Mix。

本发明使用的染料法qPCR法不限于使用SYBR Green及Super EvaGreen，也包括其它用于定量PCR的染料法。

以下通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步说明。

1.引物设计：根据等位基因特异性PCR原理设计的三条引物组，ALDH2两种基因型即便扩增片段长度相同，通过在特定的引物5’端添加高GC含量的尾巴序列(GC tail)，可将特定扩增产物的Tm值提高5℃以上，故通过染料法定量PCR的熔解曲线分析，可以区分两种基因型。因此根据ASP-PCR原理和ALDH2基因序列设计如下四种引物组：

经过比较SNP基因分型位点为rs671突变引物的位点附近的两个碱基设计的四组引物中，其它Set I、II、III引物组不能产生熔解曲线的温度的明显差异性，所以筛选如下Set IV引物组为最优的引物序列：

ALDH2-F上游引物：GTACGGGCTGCAGGCATAC，如SEQ ID NO：1所示；

ALDH2-R下游引物：GCCGCCCTGCCCGCCACACTCACAGTTTTCACTGCA，如SEQ ID NO：2所示；

ALDH2-MR突变型下游引物：CCCACACTCACAGTTTTCACTATA，如SEQ ID NO：3所示；

2.阳性质粒合成：

阳性对照质粒的基因序列是NCBI数据库中https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/671的参考SNP序列：ALDH2*1的阳性质粒中的基因序列CGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACC，如SEQ ID NO：4所示，SNP基因分型位点为rs671，ALDH2*2阳性质粒中的基因序列：CGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTAAAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACC，如SEQ IDNO：5所示；

本质粒通过全基因合成的方式构建阳性对照质粒。

同时使用无菌水作为阴性对照，来排除反应体系的污染。

3.样品采集：采取人口腔上皮细胞或外周血细胞样品的方法如下，人口腔上皮细胞采样：用棉棒或医用口腔拭子采取口腔黏膜，在200ul无菌水中悬浊。

人外周血细胞采样：从采血针从指尖或耳垂采血2ul左右，用48ul无菌水稀释混合。

4.直扩染料法qPCR预混液配方：

直扩染料法qPCR预混液方案一：

10份体积SYBR Green qPCR Master Mix(QST-100,TOROIVD配方组成为：100-500mM Tris-HCl,pH 8.0-9.0，0.1％Tween20，100-200mM(NH4)2SO4,50-80mM MgCl2，5Mbetaine,1.5M trehalose，0.66umSYBR GreenI，热启动Taq酶100U/ml，2mMdNTPs)

)或EvaGreen qPCR Master Mix(QET-100,TOROIVD，配方组成为：100-500mMTris-HCl,pH 8.0-9.0，0.1％Tween20，100-200mM(NH4)2SO4,50-80mM MgCl2，5M betaine,1.5M trehalose，2.66um Eva Green，热启动Taq酶100U/ml，2mMdNTPs)，3份体积引物组混合物(每条引物反应体系终浓度控制0.2uM左右)，最后用无菌水补足到15份体积。

直扩染料法qPCR预混液方案二：

10份体积KOD SYBR qPCR Mix(QKD-201,TOYOBO，100-500mM Tris-HCl,pH 8.0-9.0，0.1％Tween20，100-200mM(NH4)2SO4,50-80mM MgCl2，5M betaine,1.5M trehalose，0.66umSYBR GreenI，热启动KOD酶100U/ml，2mMdNTPs)、3份体积引物组混合物(每条引物反应体系终浓度控制0.2uM左右)、0.4份体积的50×ROX(有些定量PCR仪器需要0.04份体积)、最后用无菌水补足到15份体积。

直扩染料法qPCR预混液配方三：

以防污染及饱和型核酸染料为特色；0.5份体积热启动TthDNA Polymerase(5U/ul)或TTX DNA Polymerase(5U/ul)(TOYOBO)、10份体积的2×Reaction Buffer(含dUTP)(配方组成为100-500mM Tris-HCl,pH8.0-9.0，0.1％Tween20，100-200mM(NH4)2SO4,50-80mM MgCl2，5M betaine,1.5M trehalose，2mMdNTPs及dUTP)、3份体积引物组混合物(每条引物反应体系终浓度控制0.2uM左右)、0.4份体积的50×ROX(有些定量PCR仪器需要0.04份体积)、0.4份体积UDG酶(浓度为1U/ul)(TOYOBO)、0.4体积的50×Super EvaGreen(USEverBright)，最后用无菌水补足到15份体积。

5.PCR反应体系配置：

染料法定量PCR反应，将采集后的人口腔上皮细胞或外周血细胞并稀释好样品的5ul加入到15ul“直扩染料法qPCR反应液”中，进行在定量PCR上进行扩增，同时对两种基因型的阳性对照及阴性对照进行扩增。

6.PCR反应条件设置：

针对于配方一，PCR反应条件如下：

PCR循环条件：95℃,2分钟→(95℃,15秒；60℃,45秒)50个循环→熔解曲线分析

针对于配方二，PCR反应条件如下：

PCR循环条件：95℃,2分钟→(98℃,10秒；60℃,10秒；68℃,30秒)50个循环→熔解曲线分析

针对于配方三，PCR反应条件如下：

PCR循环条件：95℃,2分钟→(95℃,15秒；60℃,45秒)50个循环→熔解曲线分析

7.熔解曲线分析：

阴性对照扩增来排除“直扩染料法qPCR反应液”污染，两种阳性对照来的退火温度来确定两种基因型，同一批次反应可以采取一次阳性对照及阴性对照。通过熔解曲线中退火温度不同来区分ALDH2的两种基因型，本专利中使用的仪器是ABI公司的step One Plus。结果如附件图。

附图1：阳性质粒ALDH2*1的熔解曲线，退火温度在81.5℃左右；附图2：阳性质粒ALDH2*2的熔解曲线，退火温度在74.7℃左右；附图3：Glu504纯合子(ALDH2*1/1)，退火温度在81.5℃左右；附图4：Glu504/Lys504杂合子(ALDH2*1/2)，退火温度在81.5℃左右和74.7℃左右各有一个峰出现；附图5：Lys504纯合子(ALDH2*2/2)，退火温度在74.7℃左右有一个主峰出现。

结果分析：对于PCR扩增在同一台机器及同一反应体系的同一样品的退火温度相近。相对两种阳性对照质粒只在81.5℃(或其它温度，因酶反应体系不同)左右具有主峰出现的为Glu504纯合子(ALDH2*1/1)；当在81.5℃(因酶反应体系不同或其它温度)左右和74.7℃(因酶反应体系不同或其它温度)左右各有一个峰出现的为Glu504/Lys504杂合子(ALDH2*1/2)，此时74.7℃峰明显但比81.5℃的峰要低很多。本专利中因仪器及试剂体系不同，三种基因型的退火温度和本专利中有差异，但突变型和野生型有明显差异，实际实行应在同一反应体系中进行比较，不影响本专利的权利诉求。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。

序列表

<110> 天筛（上海）科技有限公司

<120> 一种一管式ALDH2基因分型试剂盒及其检测方法

<130> 20190107

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

gtacgggctg caggcatac 19

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gccgccctgc ccgccacact cacagttttc actaca 36

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

cccacactca cagttttcac tgta 24

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

gtacgggctg caggcatac 19

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

gccgccctgc ccgccacact cacagttttc actaca 36

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

cccacactca cagttttcac tata 24

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

gtacgggctg caggcatac 19

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

gccgccctgc ccgccacact cacagttttc actgca 36

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

cccacactca cagttttcac tgta 24

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

gtacgggctg caggcatac 19

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

gccgccctgc ccgccacact cacagttttc actgca 36

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 12

cccacactca cagttttcac tata 24