一种检测肥厚型心肌病基因突变的引物组、试剂盒和方法

文档序号：1320929 发布日期：2020-07-14 浏览：6次 >En<

阅读说明：本技术 一种检测肥厚型心肌病基因突变的引物组、试剂盒和方法 (Primer group, kit and method for detecting gene mutation of hypertrophic cardiomyopathy ) 是由张惠丹戴敬李阳赵洪玉于 2019-12-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种检测肥厚型心肌病基因突变的引物组,包括用于检测肥厚型心肌病基因突变的扩增引物组和延伸引物组。本发明还公开了一种检测肥厚型心肌病基因突变的试剂盒,该试剂盒含有用于检测肥厚型心肌病基因突变的扩增引物组和延伸引物组。此外,本发明还公开了一种检测肥厚型心肌病基因突变的方法。采用本发明的引物组进行检测肥厚型心肌病基因突变的方法,检测结果准确,检测速度快,无需荧光标记,且操作便利,检测灵敏度高,节省时间,检测成本大大降低,一天内可以完成对上百个样本的快速检测,适合批量筛查。(The invention discloses a primer group for detecting gene mutation of hypertrophic cardiomyopathy, which comprises an amplification primer group and an extension primer group for detecting gene mutation of hypertrophic cardiomyopathy. The invention also discloses a kit for detecting the gene mutation of the hypertrophic cardiomyopathy, which contains an amplification primer group and an extension primer group for detecting the gene mutation of the hypertrophic cardiomyopathy. In addition, the invention also discloses a method for detecting gene mutation of hypertrophic cardiomyopathy. The method for detecting gene mutation of hypertrophic cardiomyopathy by using the primer group has the advantages of accurate detection result, high detection speed, no need of fluorescent markers, convenience in operation, high detection sensitivity, time saving, great reduction in detection cost, capability of quickly detecting hundreds of samples in one day and suitability for batch screening.)

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，特别涉及一种检测肥厚型心肌病基因突变的引物组、试剂盒和方法。

背景技术

肥厚型心肌病(HCM)是最常见的遗传性心血管疾病，是青少年、年轻竞技运动员发生心源性猝死(SCD)的首要原因。肥厚型心肌病的发病率为1/500,发病趋势呈逐年上升，目前国内有100万～200万的肥厚型心肌病患者。随着对肥厚型心肌病认识的逐步加深，HCM被认为是可以检测、干预和治疗且大多数患者预后较好的疾病。

目前人们已发现多个HCM致病基因，并提出了多种基因治疗策略来消除遗传缺陷以实现HCM的对因治疗，其中包括基因组编辑、外显子跳跃、等位基因特异性沉默、RNA反式剪接和基因替代等，这些技术中的大部分已经在动物或人诱导的HCM多能干细胞模型中进行了有效性及安全性测试。

HCM因不同致病基因而表现出临床异质性，目前已发现近40种基因与HCM的发生发展有关，以肌小节结构蛋白的编码基因为主。B肌球蛋白重链(betamyosinheavy chain，MYH7)、肌球蛋白结合蛋白C(myosin binding protein C，MYBPC3)和肌钙蛋白T(cardiactroponin-T，TNNT2)是最常见的三种致病基因型。

依赖科学技术的发展，目前单基因病的诊断以二代测序为主，但其操作步骤繁复、检测时间长、对技术人员操作及分析能力要求较高，这些容易对检测结果的可靠性产生影响，同时二代测序检测试剂及分析耗材昂贵，较高的成本给其在二代测序疾病分子诊断及人群筛查中的应用带来诸多挑战，影响了应用的普及。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种检测肥厚型心肌病基因突变的引物组、试剂盒和方法；利用该引物组的检测方法所得检测结果准确，检测速度快，无需荧光标记，检测成本大大降低，一天内可以完成对上百个样本的快速检测，适合批量筛查。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种检测肥厚型心肌病基因突变的引物组，包括用于检测肥厚型心肌病基因突变的扩增引物组和延伸引物组，其中，所述扩增引物组包括核苷酸序列如Seq ID NO.1～176所示的一对或多对扩增引物，所述延伸引物组包括核苷酸序列如Seq ID NO.177～264所示的一个延伸引物或多个延伸引物。

进一步地，上述引物组包括用于检测肥厚型心肌病检测肥厚型心肌病致病基因的88个突变位点的扩增引物组和延伸引物组，其中，所述扩增引物组包括核苷酸序列如SeqID NO.1～176所示的全部的88对扩增引物，所述延伸引物组包括核苷酸序列如Seq IDNO.177～264所示的全部的88个延伸引物。

本发明还提供了一种检测肥厚型心肌病基因突变的试剂盒，该试剂盒含有用于检测肥厚型心肌病基因突变的扩增引物组和延伸引物组，该扩增引物组包括核苷酸序列如Seq ID NO.1～176所示的一对或多对扩增引物，该延伸引物组包括核苷酸序列如Seq IDNO.177～264所示的一个延伸引物或多个延伸引物。

进一步地，该试剂盒含有的扩增引物组和延伸引物组用于检测肥厚型心肌病致病基因的的88个突变位点，其中，所述扩增引物组包括核苷酸序列如Seq ID NO.1～176所示的全部的88对扩增引物，所述延伸引物组包括核苷酸序列如Seq ID NO.177～264所示的全部的88个延伸引物。

进一步地，该试剂盒还包括PCR反应Taq酶和PCR缓冲液，PCR反应Taq酶、PCR缓冲液与所述扩增引物用于制备多重PCR扩增反应体系。

进一步地，该试剂盒还包括SAP酶和SAP缓冲液，所述SAP酶和SAP缓冲液用于制备碱性磷酸酶处理反应体系。

进一步地，该试剂盒还包括iPLEX酶和iPLEX缓冲液，该iPLEX酶、i PLEX缓冲液与所述延伸引物用于制备延伸反应体系。

进一步地，该试剂盒还包括MassARRAY芯片。

本发明还提供了一种检测肥厚型心肌病基因突变的方法，包括以下步骤：

(1)获得用于检测肥厚型心肌病基因突变的扩增引物和延伸引物；

(2)提取待检测样本的DNA；

(3)以步骤(2)提取的DNA为模板，使用步骤(1)获得的扩增引物通过PCR扩增，获得目标序列扩增产物；

(4)利用SAP酶除去步骤(3)获得的扩增产物中含有的游离的dNTPs；

(5)以步骤(3)获得的目标序列扩增产物为模板，利用步骤(1)获得的延伸引物进行单碱基延伸反应，得到延伸产物；

(6)纯化步骤(5)获得的延伸产物；

(7)将纯化后的延伸产物采用飞行时间质谱基因分型系统进行检测和分型。

本发明的有益效果是：

本发明采用不同的引物设计软件，并结合agilent earray design探针设计系统，通过不断优化引物序列，最终将这88个突变位点的多重PCR扩增压缩至3个well(孔)中进行，使用384孔板一次试验最多可完成对120例患者的检测，大大提高了一次检测的通量。

采用本发明的引物组进行检测肥厚型心肌病基因突变的方法，检测结果准确，检测速度快，无需荧光标记，且操作便利，检测灵敏度高，节省时间，检测成本大大降低，一天内可以完成对上百个样本的快速检测，适合批量筛查。

具体实施方式

下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

实施例

一、引物设计

本发明依据OMIM、clinvar等专业遗传数据库，并查阅相关数据库收集了中国人所常见的突变，共收集肥厚型心肌病单基因病突变位点88个，分别为：rs397515965、rs727504276、rs397515889、rs397515894、rs397515896、rs397515926、rs727503186、rs752670374、rs397516351、rs730880686、rs727503203、rs1331475170、rs730880714、rs730880652、rs397515977、rs730880656、rs397516030、rs730880640、rs727504248、rs863224209、rs1060501484、rs886041320、rs397515933、rs730880642、rs727503172、rs727504390、rs727503217、rs397515952、rs397516047、rs727504366、rs397515931、rs397515934、rs727503182、rs863225271、rs876657705、rs876657706、rs730880718、rs397516023、rs864622224、rs863225272、rs730880650、rs397515973、rs397515947、rs730880651、rs587776643、rs397516001、rs397516007、rs730880336、rs753602229、rs878853830、rs397515948、rs397518449、rs397515970、rs869320746、rs397516019、rs1057517939、rs727503209、rs397515960、rs397515944、rs397516049、rs397515963、rs1064793202、rs267606628、rs267606629、rs397516101、rs121913630、rs104894504、rs121908988、rs139794067、rs121909375、rs397515895、rs267606907、rs397516005、rs28939711、rs104894204、rs727504241、rs2069544、rs397516353、rs397516357、rs727503261、rs730880735、rs397515920、rs730880586、rs267607128、rs730881077、rs121909280、rs397516161、rs727504289。

针对MassArray技术，如果将88个基因突变位点放在尽量少的well中，就需要考虑通过实验条件不断优化引物。我们采用不同的引物设计软件，如Primr premier、Oligo、Vector NTI Suit、Dnasis、Omiga、Dnastar等，并结合agilent earray design探针设计系统，通过不断优化引物序列，得到核苷酸序列如Seq ID NO.1～176所示的88对扩增引物，以及核苷酸序列如Seq ID NO.177～264所示的88个延伸引物，最终将这88个基因突变位点的检测压缩至3个孔中进行，即将88个基因突变位点的检测分为3组；针对该88个基因突变位点的扩增引物序列和延伸引物序列，以及每个基因突变位点的孔分布设计如表1所示。

表1

本发明提供的试剂盒包含了表1中所示的扩增引物和延伸引物；进一步的，该试剂盒还包含PCR反应Taq酶、PCR缓冲液、SAP酶、SAP缓冲液、iPLEX酶、iPLEX缓冲液以及MassARRAY芯片；本发明的实施例利用该试剂盒进行基因突变检测。

二、基因突变检测

本发明实施例收集了10例疑似扩张性心肌病患者的血液样品(均已签署知情同意书)，具体基因检测过程如下：

2.1 DNA提取

使用Wizard Genomic DNA purification Kit(Promega)或NucleoSpin Tissue(MN)等试剂盒或类似产品，提取10例血样中的DNA。用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检，基因组DNA电泳条带通常不小于20kb。质检合格的DNA将浓度调整到50ng/μl，转移至384孔板，-20℃储存备用。

2.2 PCR扩增

PCR扩增采用多重PCR技术，在384孔板中进行，每个PCR扩增反应体系的总体积为5μl。

在一个新的1.5ml EP管中按照表2配制PCR master mix溶液。

表2 PCR master mix溶液

使用24通道加样器，调节加样体积为4μL，在384孔板的每个加样孔中加入PCRmaster mix溶液，该384孔板即为PCR反应板。

取出已经制备好的DNA样品384孔板，使用24通道加样器，调节加样体积为1μL，在上述PCR反应板的加样孔中加入提取的DNA，得到PCR扩增反应体系；每个5μl的PCR扩增反应体系中包含模板DNA50ng，热启动Taq酶0.5U，每条扩增引物0.5pmol，0.1μl的25mM dNTPs。

在兼容384孔板的PCR仪上设定PCR反应条件为：

94℃预变性4分钟；94℃变性20秒,56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，45个循环；72℃延伸3分钟；4℃保持。

将384孔PCR反应板放置于PCR仪上，启动PCR反应。反应结束后，得到PCR扩增产物。

2.3 PCR扩增产物碱性磷酸酶处理

在PCR反应结束后，将PCR扩增产物用SAP(shrimp alkaline phosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs，具体过程如下：

按照表3配制碱性磷酸酶处理反应液。

表3 碱性磷酸酶处理反应液

使用24通道加样器，调节加样体积为2μL，将碱性磷酸酶处理反应液加入到384孔PCR反应板中。对于每个碱性磷酸酶处理反应孔，碱性磷酸酶处理反应体系总体积为7μL，其中包含PCR扩增产物5μL，碱性磷酸酶处理反应液2μL。

将上述384孔PCR反应板放置在兼容384孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件：37℃，40分钟；85℃，5分钟；4℃维持，启动PCR仪进行碱性磷酸酶处理。

2.4 单碱基延伸

在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，单碱基延伸反应体系总体积为9μL。

按照表4配制单碱基延伸反应液。

表4 单碱基延伸反应液

试剂	对每个反应的体积，μL
		水	0.619
延伸引物混合物	0.94
		iPLEX缓冲液	0.2
iPLEX terminator	0.2
		iPLEX酶	0.041
总体积	2

使用24通道加样器，调节加样体积为2μL，将单碱基延伸反应液对应加入到384孔PCR反应板中。对于每个反应孔，单碱基延伸反应体系包含碱性磷酸酶处理后的PCR扩增产物7μL及单碱基延伸反应液2μL。

将384孔PCR反应板放置在兼容384孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件如下：

I.94℃预变性30秒；

II.94℃变性5秒；

III.52℃退火5秒；

IV.80℃延伸5秒；

V.GOTO III，4个循环；

VI.GOTO II，39个循环；

VII.72℃延伸3分钟；

VIII.4℃保持。

启动PCR仪进行单碱基延伸反应；在该过程中，以获得的扩增产物为模板，采用延伸引物通过单碱基延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基，从而得到延伸产物。

2.5 树脂纯化

将Clean Resin树脂平铺到6mg的树脂板中；

加16μL水到延伸产物的对应孔内；

将干燥后的树脂倒入带有延伸产物的反应板中，封膜，低速垂直旋转30分钟，使树脂与延伸产物充分接触；

离心使树脂沉入孔底部。

2.6 芯片点样

启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上。

2.7 质谱检测

将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF(matrix-assisted laserdesorption/ionization–time of fligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)分析，检测结果使用TYPER 4.0软件(sequenom)分型并输出结果。

2.8 查看结果

根据质谱检测结果分析得到，10例样品中，8例样品中检测到了肥厚性心肌病相关的致病性突变，其他2例样品未得到阳性结果。具体结果如表5所示。

表5 样品检测结果

样品编号	检测结果	突变位点
			1	阳性	rs397515926
2	阳性	rs752670374
			3	阳性	rs886041320
4	阳性	rs727504390
			5	阳性	rs863225271
6	阴性	-
			7	阳性	rs397516047
8	阳性	rs397516005
			9	阴性	-
10	阳性	rs863225272

2.9 结果验证

我们采用WES方法对8例阳性样品和2例阴性样品进行试验。WES方法检测结果与本发明实施例的检测方法所得结果一致性为90％。验证结果如表6所示。

表6 验证结果

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 苏州恩科金生物科技有限公司

<120> 一种检测肥厚型心肌病基因突变的引物组、试剂盒和方法

<130> 2019

<160> 132

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> DNA