阅读说明：本技术 诊断肌少症的肠道菌群及其应用 (Intestinal flora for diagnosing sarcopenia and application thereof ) 是由 康琳 于 2020-04-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了诊断肌少症的肠道菌群及其应用,所述肠道菌群为Eisenbergiella。本发明通过16S核糖体核糖核酸测序首次发现了Eisenbergiella在肌少症中呈现显著性上调,进一步发现了使用Eisenbergiella作为检测变量区分肌少症和健康群体具有较高的特异性和敏感性,基于此,可以将Eisenbergiella应用于肌少症的无创诊断。(The invention discloses an intestinal flora for diagnosing sarcopenia and application thereof, wherein the intestinal flora is Eisenbergiella. According to the invention, the fact that Eisenbergiella is remarkably up-regulated in sarcopenia is firstly discovered through 16S ribosomal ribonucleic acid sequencing, and the fact that Eisenbergiella is used as a detection variable to distinguish sarcopenia from healthy groups is further discovered to have higher specificity and sensitivity, so that Eisenbergiella can be applied to noninvasive diagnosis of sarcopenia.)

诊断肌少症的肠道菌群及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及诊断肌少症的肠道菌群及其应用。

背景技术

肌肉衰减综合症(Sarcopenia)，简称肌少症，最早由Evans WJ和Rosenberg IR于1991年提出，目前已受到越来越广泛的重视。2010年，欧洲肌少症工作组提出了这样的定义：肌少症是一种进行性的肌肉质量和力量的丢失，可能会导致肢体残疾、生活质量降低甚至死亡(Cruz-Jentoft AJ,Baeyens JP,Bauer JM,et al.Sarcopenia:Europeanconsensus on definition and diagnosis:report of the European working group onsarcopenia in older people[J].Age Ageing,2010,39(4):412-423.)。有关肌少症的诊断，很多研究指出，可以通过握力、步数等的测量来诊断，但目前尚无统一标准(Yu S,Umapathysivam K,Visvanathan R.Sarcopenia in older people[J].Int J Evid BasedHealthc,2014,12(4):227-243)。随着人们对肌少症研究的不断深入，发现肌少症与跌倒、骨折、虚弱、死亡率等均有关(Dennison EM,Sayer AA,Cooper C.Epidemiology ofsarcopenia and insight into possible therapeutic targets[J].Nature ReviewsRheumatology,2017,13(6):340-347.)，身体活动功能受损也是死亡率的预测指标(LandiF,Calvani R,Tosato M,et al.Impact of physical function impairment andmultimorbidity on mortality among communityliving older persons withsarcopaenia:results from the ilSIRENTE prospective cohort study[J].BMJ Open,2016,6(7):e008281.)。

目前已知的微生物数目远超过人类细胞数目，人体内的大部分微生物都寄居在肠道，这些肠道微生物通过介导各种各样的宿主反应起着肠道屏障、免疫和内分泌功能(Bindels LB,Delzenne NM.Muscle wasting:the gut microbiota as a newtherapeutic target？[J]Int J Biochem Cell Biol,2013,45(10):2186-2190.)。肠道微生态的组成随着年龄的不同而有所改变(Odamaki T,Kato K,Sugahara H,et al.Age-related changes in gut microbiota composition from newborn to centenarian:acrosssectional study[J].BMC Microbiol,2016,16:90.)。已有动物实验发现，肠道微生物的变化与骨骼肌功能的生理衰退有关(Siddharth J,Chakrabarti A,Pannérec A,etal.Aging and sarcopenia associate with specific interactions between gutmicrobes,serum biomarkers and host physiology in rats[J].Aging(Albany NY),2017,9(7):1698-1720.)。可见肠道微生态在肌少症的发病过程中可能发挥着一定的作用。肌少症严重影响了老年人的生活质量，而且增加了社会负担，研究与肌少症相关的肠道菌群，探究其在肌少症发生发展过程中的作用，对于加深肌少症的认知以及实现肌少症的诊断和治疗具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供与肌少症发生发展相关的肠道菌群及其在诊断和治疗肌少症中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了用于检测肠道菌群丰度的一种或多种试剂在制备用于预测肌少症的产品中的用途，所述肠道菌群至少包括肠道菌属Eisenbergiella。

进一步，所述试剂包括与来自Eisenbergiella的靶核苷酸序列能够特异性杂交的一种或多种寡核苷酸。

进一步，所述产品还包括从样本中分离核酸的试剂。

进一步，所述寡核苷酸被可检测地标记。

进一步，Eisenbergiella的靶核苷酸序列是16S核糖体核糖核酸基因的片段。

本发明提供了一种预测肌少症的试剂盒，所述试剂盒包括检测肠道菌群Eisenbergiella丰度的试剂。

进一步，所述试剂包括与来自Eisenbergiella的靶核苷酸序列能够特异性杂交的一种或多种寡核苷酸。

进一步，所述寡核苷酸包括特异性识别Eisenbergiella的靶核苷酸序列的探针或特异性扩增Eisenbergiella的靶核苷酸序列的引物。

进一步，所述扩增是PCR或RT-PCR，优选的，所述扩增利用可检测的被标记的引物。

本发明提供了一种组合物及其在制备治疗肌少症的药物中的应用，所述组合物包括降低Eisenbergiella丰度的试剂。

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

附图说明

图1是Rank-Abundance曲线图；

图2是Eisenbergiella的差异情况图；

图3是以Eisenbergiella作为检测变量的ROC曲线图。

具体实施方式

为了评估肠道共生菌群组成能否作为肌少症的预测因子，本发明通过收集肌少症患者和健康人的样本，进行16S rRNA测序以及使用生物信息学进行测序数据的统计，从中筛选出与肌少症相关的肠道菌群，将肠道菌群与疾病信息整合，最大程度预测肌少症患者。本发明通过16S rRNA测序，首次发现了Eisenbergiella在肌少症患者和健康人中呈现显著性差异，说明Eisenbergiella可作为肌少症的预测因子。

在本发明的实施方式中，本发明通过以下步骤来诊断肌少症：在来自个体的核酸样本中，检测与肌少症的诊断相关的菌种所对应的一个或多个核酸片段。在特定的实施方式中，检测对应于Eisenbergiella的核酸片段。在实施本文描述的方法中，使用分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、免疫学、微生物学和重组DNA方面的很多传统技术，这些技术是公知的。

下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。

本文中使用的术语“诊断”指的是区分或确定疾病、综合征或病症，或者指的是区分或确定患有特定的疾病、综合征或病症的人。在本发明的说明性实施方式中，基于分析样本中的菌群标志物来诊断对象中的肌少症。

本文中使用的术语“片段”表示长度至少为约15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、200、300、400、500、1000个核苷酸或更多核苷酸的多核苷酸。

本文中使用的术语“核酸”泛指：染色体的段；DNA、cDNA和/或RNA的段或部分。核酸可以自最初与任何源分离的核酸样本(例如，与样本DNA或RNA分离、从样本DNA或RNA纯化、扩增、克隆或逆转录)获取或获得。

本文中使用的术语“寡核苷酸”表示由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其任意组合构成的短聚合物。寡核苷酸的长度通常在大10个核苷酸和大约100个核苷酸之间。寡核苷酸优选地长度为15个核苷酸到70个核苷酸，最通常的是20个核苷酸到26个核苷酸。寡核苷酸可以用作引物或探针。

当寡核苷酸和核酸对齐时，如果该寡核苷酸与该核酸的一部分具有至少50％的序列同源性，则该寡核苷酸对该核酸为“特异”的。对一核酸特异的寡核苷酸是这样的寡核苷酸：在合适的杂交条件或洗涤条件下，其能够与所关注的目标杂交且基本上不与未关注的核酸杂交。较高程度的序列同源性是优选的且包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同源性。

本文中使用的术语“杂交”或“特异性杂交”指的是两个互补的核酸链在适当严格的条件下彼此退火结合。通常利用探针长度的核酸分子来进行杂交。核酸杂交技术在现有技术中是公知的。本领域的技术人员了解如何估计和调整杂交条件的严格度，使得具有至少所需程度的互补性的序列将稳定地杂交，而具有较低互补性的序列将不能稳定地杂交。

本文中使用的术语“扩增”表示现有技术已知的用于复制目标核酸且由此增大所选择的核酸序列的拷贝的数量的一种或多种方法。扩增可以是以指数的或线性的。目标核酸可以是DNA或RNA。以此方式扩增的序列形成“扩增子”。尽管下文描述的示例性方法涉及利用聚合酶链反应(“PCR”)进行扩增，但在现有技术中已知用于扩增核酸的很多其他方法(例如，等温法、滚环法等)。本领域的技术人员将理解，这些其他的方法可以替代PCR方法使用或者可以与PCR方法一起使用。

本文中使用的术语“目标核酸”或“靶核苷酸”指的是针对其设计探针或引物的染色体的片段、具有或者不具有基因间序列的完整基因、具有或不具有基因间序列的基因的片段或部分或者核酸序列。目标核酸可以包括：野生型序列；含突变、删除或复制的核酸序列；串联重复；所关注的基因；所关注的基因的区域或者其任何上游区域或下游区域。目标核酸可以表示特定基因的替代序列或等位基因。目标核酸可以从基因组DNA、cDNA或RNA获得。本文中使用的目标核酸可以是天然DNA或经PCR扩增的产物。在一个实施方式中，目标核酸是来自细菌种群的16S核糖体RNA基因的片段。

本文中使用的术语“样本”或“测试样本”指的是含核酸的任何液体材料或固体材料。在合适的实施方式中，测试样本从生物源获取(即，“生物样本”)，比如培养中的细胞，或者是来自动物且最优选地来自人类的组织样本。在示例性实施方式中，所述样本是粪便。

本发明的方法和组合物可以用来利用获取自个体的生物样本来检测与各种细菌有关的核酸。可以根据本领域的技术人员所熟知的任何方法将该核酸(DNA或RNA)从所述样本中分离出来。可以通过标准步骤来获取生物样本并且可以立即使用所述生物样本，或者可以在适于该类型的生物样本的条件下储存该生物样本以备后续使用。

用于检测测定的起始材料通常为怀疑包括Eisenbergiella的临床样本。临床样本的示例为粪便。接着，可以将核酸与原始样本中存在的蛋白质和糖类分离。在本发明的背景下可以使用本领域中已知的任何提纯方法。样本中的核酸序列可以利用体外扩增而成功地扩增，比如PCR。通常，可以将抑制聚合酶的任何化合物从该核酸中移除。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例1筛选与肌少症相关的肠道菌群

1、研究对象和样本收集

收集11例肌少症以及60例健康人的粪便样本。患者资料统计如表1所示。

表1患者资料

2、16S rRNA测序

2.1 DNA的提取

使用基因组DNA提取试剂盒自样本中提取基因组DNA，操作步骤按说明书进行。

2.2 DNA样本纯度及浓度测定

利用1％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA。

2.3 PCR扩增及产物纯化

按指定测序区域，合成带有barcode的特异引物，或合成带有错位碱基的融合引物。

PCR采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase；全部样本按照正式实验条件进行，每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后用2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris-HCl洗脱；2％琼脂糖电泳检测。

2.4 Miseq文库构建

连接“Y”字形接头，使用磁珠筛选去除接头自连片段，利用PCR扩增进行文库模板的富集，氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。

2.5 Miseq测序

将DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上，另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥(bridge)”，PCR扩增，产生DNA簇，将DNA扩增子线性化成为单链，加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只合成一个碱基；用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸；统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。

3、数据分析

3.1数据预处理

Miseq测序得到的是Pair-End(PE)双端序列数据，对测得的Fastq数据进行质控处理，最终得到优质的Fasta数据。

使用FLASH、Trimmomatic等软件对Miseq测序得到的PE reads根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤；使用Vearch软件进行聚类操作，将序列按照彼此的相似性归为许多OUT，采用RDP classifier贝叶斯算法在97％的相似水平下的OTU进行生物信息统计分析，并使用Silva数据库进行比对。

3.2肠道菌群物种差异分析

使用mothur软件的Metastats分析组间显著性差异，找出两组中具有显著差异的微生物类型，使用R及其qvalue包的Kruskal-Wallis秩和检验计算多组独立数据均值之间的差异，使用R及其stats包的Wilcoxon检验比较两个配对组之间的差异并分析这些差异，同时使用R的pROC分析绘制ROC曲线并计算其AUC面积。

4、结果

测序数据及OUT信息如表2所示，Case代表肌少症患者，CON代表健康对照。

物种多样性分析结果如图1所示，在水平方向，物种的丰度由曲线的宽度来反映，物种的丰度越高，曲线在横轴上的范围越大；曲线的形状(平滑程度)反映了样本中物种的均度，曲线越平缓，物种分布越均匀。

物种差异性分析结果显示，与健康人相比，肌少症患者中的Eisenbergiella丰度水平显著增加(P＝0.011814)，增加约10.8倍，差异情况如图2所示。

表2测序数据以及OUT数目统计

实施例2验证Eisenbergiella与肌少症之间的相关性

1、研究对象和样本收集

按照实施例1的方式收集肌少症的样本11例以及健康人的样本72例。患者资料统计如表3所示。

表3患者信息

2、16S rRNA测序及数据分析同实施例1。

3、结果

检测结果显示，Eisenbergiella丰度水平显著增加(P＝3.72E-05)。ROC曲线结果显示，AUC值为0.799，最佳临界值的特异性为0.764，敏感性为0.818(图3)，提示将Eisenbergiella应用于肌少症的诊断具有较高的诊断效能。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。