阅读说明：本技术 一种肌少症的肠道菌群标志物及其应用 (Intestinal flora marker for sarcopenia and application thereof ) 是由 康琳 于 2020-04-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种肌少症的肠道菌群标志物及其应用,本发明通过提取样本中的肠道菌群的DNA基因组并测序从而获得肠道菌群的种类和丰度特征,并基于肠道菌群的丰度特征进行肌少症的诊断。(The invention discloses a sarcopenia intestinal flora marker and application thereof.)

一种肌少症的肠道菌群标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种肌少症的肠道菌群标志物及其应用。

背景技术

肌肉衰减综合症(Sarcopenia)，简称肌少症，是老龄化进程中骨骼肌量流失、肌强度和功能下降引起的退行性综合症。肌少症会导致人的活动能力下降、蛋白质营养不良、静息代谢率降低并由此引发情绪障碍。此外，骨骼肌的收缩能力下降导致骨骼承受的负荷下降，使骨骼长期处于相对废用状态，易诱发骨质疏松症(Buckwalter JA.Osteoarthritisand Articular-Cartilage Use,Disuse,and Abuse-Experimental Studies.JRheumatol.1995；22:13-15.)。Rong Hai等人对中国西安地区的肌少症流行病学调查研究显示，60-70岁人群年龄组中，男性患病率为8.2％，女性为6.7％；在80岁以上年龄组中，肌少症患病率则超过40％(Hai R,Liu XG etal.An epidemiological investigation ofsarcopenia in the Chinese population.Bone.2010；47:S437-S437.)。肌少症引起的一系列不良影响导致患者身体素质下降和死亡率上升。同其他老年性疾病一样，肌少症威胁着老年人的健康，给社会带来较大的负担。

作为一种多病因所致综合征，肌少症确切的发病机制还尚不明确。目前研究显示，骨骼肌废用、激素水平变化、炎症反应、胰岛素抵抗和营养缺乏以及一些慢性消耗性疾病等因素均与肌少症的发生有关(Zembron-Lacny A,Dziubek W etal，Sarcopenia:monitoring,molecular mechanisms,and physical intervention.Physiol Res.2014；63(6):683-691.)。有研究表明，肠道菌群在肌少症的发生发展中起着重要作用，但是目前有关研究尚少。研究肠道菌群与肌少症的关系，对于揭示肌少症的发病机制以及实现肌少症的无创诊断具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种诊断肌少症的肠道菌群标志物。

本发明的目的之二在于提供一种诊断肌少症的产品。

本发明的目的之三在于提供一种预测肌少症的系统。

本发明的的目的之四在于提供一种治疗肌少症的药物组合物。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种肌少症的肠道菌群标志物，所述肠道菌群标志物为Anaerofilum。

本发明的第二方面提供了本发明的第一方面所述的肠道菌群标志物在制备诊断肌少症的产品中的应用，所述产品包含检测肠道菌群标志物的试剂。

进一步，所述试剂是对所述肠道菌群标志物具有特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。

进一步，所述引物是特异性扩增所述肠道菌群标志物的16SrRNA的引物。

本发明的第三方面提供了本发明的第一方面所述的肠道菌群标志物预测肌少症的系统，包括：

核酸样本分离单元，用于从检测对象中分离肠道菌群核酸样本；

测序单元，用于对分离的肠道菌群核酸样本进行测序，以获得测序结果；

数据处理单元，用于根据测序结果，对肠道菌群中的所述微生物标志物的相对丰度进行检测，将所得到的相对丰度值进行分析，得出上述微生物标志物的临界值；

结果判定单元，用于将数据处理单元得到的微生物标志物的临界值与设定诊断值进行比较。

利用该系统，可以确定本发明的生物标志物在肠道菌群中的相对丰度。因此，可以通过所得到的相对丰度值与预定的临界值进行比较，从而提高确定对象个体为肌少症个体或者为健康个体的概率。

本发明的第四方面提供了一种诊断肌少症的产品，所述产品包括检测本发明的第一方面所述的肠道菌群标志物丰度的试剂。

进一步，所述试剂包括检测所述肠道菌群标志物的特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。

进一步，所述特异性的引物是能够检测所述肠道菌群标志物16SrRNA的引物。

进一步，所述产品还包括提取微生物基因组DNA、微生物蛋白、菌体成分的试剂。

本发明的第五方面提供了本发明的第一方面所述的肠道菌群标志物在构建预测肌少症的计算模型中的应用。

本发明的第六方面提供了本发明的第一方面所述的肠道菌群标志物在制备治疗肌少症的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括降低所述的肠道菌群标志物丰度的试剂。

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了Anaerofilum与肌少症相关，其丰度在肌少症患者和健康人群中呈现显著性差异，ROC曲线分析其作为检测变量具有较高的特异性和敏感性，因此，可以将Anaerofilum作为检测标志物应用于肌少症患者的诊断。以Anaerofilum作为检测标志物，完全无创，准确性高。

附图说明

图1是Rank-Abundance曲线图；

图2是Anaerofilum的差异情况图；

图3是以Anaerofilum作为检测变量的ROC曲线图。

具体实施方式

为了评估肠道共生菌群组成能否作为肌少症的预测因子，本发明通过收集肌少症患者和健康人的样本，进行16S rRNA测序以及使用生物信息学进行测序数据的统计，发现与疾病相关的肠道菌群，将肠道菌群与疾病信息整合，最大程度预测肌少症患者。本发明通过16S rRNA测序，首次发现了Anaerofilum在肌少症患者和健康人中呈现显著性差异，说明Anaerofilum可作为肌少症的预测因子。

下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。

本文中使用的术语“扩增”表示现有技术已知的用于复制目标核酸且由此增大所选择的核酸序列的拷贝的数量的一种或多种方法。扩增可以是以指数的或线性的。目标核酸可以是DNA或RNA。以此方式扩增的序列形成“扩增子”。尽管下文描述的示例性方法涉及利用聚合酶链反应(“PCR”)进行扩增，但在现有技术中已知用于扩增核酸的很多其他方法(例如，等温法、滚环法等)也包括在本发明中。本领域的技术人员将理解，这些其他的方法可以替代PCR方法使用或者可以与PCR方法一起使用。

本文中使用的术语“诊断”指的是区分或确定疾病、综合征或病症，或者指的是区分或确定患有特定的疾病、综合征或病症的人。在本发明的说明性实施方式中，基于分析样本中的菌群标志物来诊断对象中的肌少症。

本文中使用的术语“杂交”或“特异性杂交”指的是两个互补的核酸链在适当严格的条件下彼此退火结合。通常利用探针长度的核酸分子来进行杂交。核酸杂交技术在现有技术中是公知的。本领域的技术人员了解如何估计和调整杂交条件的严格度，使得具有至少所需程度的互补性的序列将稳定地杂交，而具有较低互补性的序列将不能稳定地杂交。

本文中使用的术语“严格性”用来指进行核酸杂交的温度、离子强度和其他化合物的存在的条件。在高严格性条件下，将仅在具有含高频率的互补碱基序列的足够长的片段的核酸之间发生核酸碱基配对。示例性的杂交条件如下。高严格性通常指的是这样的条件：在65℃下且在0.018M的NaCl中，仅允许那些形成稳定的杂交产物的核酸杂交。例如，可以通过以下来提供高严格性条件：在50％的甲酰胺、5×Denhardt溶液、5×SSC(盐水柠檬酸钠)、0.2％的SDS(十二烷基硫酸钠)中且在42℃下杂交，之后在0.1×SSC和0.1％SDS中且在65℃下洗涤。中度严格性指的是等效于以下的条件：在50％的甲酰胺、5×Denhardt溶液、5×SSC、0.2％的SDS中且在42℃下杂交，之后在0.2×SSC和0.2％的SDS中且在65℃下洗涤。低严格性指的是等效于以下的条件：在50℃下，在10％的甲酰胺、5×Denhardt溶液、6×SSC、0.2％的SDS中杂交，之后在1×SSC和0.2％的SDS中洗涤。

本文中使用的用于扩增的“引物”是特异性地退火结合至目标核苷酸序列或标记核苷酸序列的寡核苷酸。该引物的3’核苷酸应当与相对应的核苷酸位置的目标序列或标记序列相同以通过聚合酶实现最佳的引物延伸。

在本发明中，术语“抗体”以最广义使用，而且具体涵盖例如单克隆抗体，多克隆抗体，具有多表位特异性的抗体，单链抗体，多特异性抗体和抗体片段。此类抗体可以是嵌合的，人源化的，人的和合成的。

本文中使用的术语“样本”或“测试样本”指的是含核酸的任何液体材料或固体材料。在合适的实施方式中，测试样本从生物源获取(即，“生物样本”)，比如培养中的细胞，或者是来自动物且最优选地来自人类的组织样本。在示例性实施方式中，所述样本是粪便。

本发明的方法和组合物可以用来利用获取自个体的生物样本来检测与各种细菌有关的核酸。可以根据本领域的技术人员所熟知的任何方法将该核酸(DNA或RNA)从所述样本中分离出来。可以通过标准步骤来获取生物样本并且可以立即使用所述生物样本，或者可以在适于该类型的生物样本的条件下储存该生物样本以备后续使用。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例1筛选与肌少症相关的肠道菌群

1、研究对象和样本收集

收集11例肌少症以及60例健康人的粪便样本。患者资料统计如表1所示。

表1患者资料

2、16S rRNA测序

2.1DNA的提取

使用基因组DNA提取试剂盒自样本中提取基因组DNA，操作步骤按说明书进行。

2.2DNA样本纯度及浓度测定

利用1％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA。

2.3PCR扩增及产物纯化

按指定测序区域，合成带有barcode的特异引物，或合成带有错位碱基的融合引物。

PCR采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase；全部样本按照正式实验条件进行，每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后用2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris-HCl洗脱；2％琼脂糖电泳检测。

2.4Miseq文库构建

连接“Y”字形接头，使用磁珠筛选去除接头自连片段，利用PCR扩增进行文库模板的富集，氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。

2.5Miseq测序

将DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上，另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥(bridge)”，PCR扩增，产生DNA簇，将DNA扩增子线性化成为单链，加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只合成一个碱基；用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸；统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。

3、数据分析

3.1数据预处理

Miseq测序得到的是Pair-End(PE)双端序列数据，对测得的Fastq数据进行质控处理，最终得到优质的Fasta数据。

使用FLASH、Trimmomatic等软件对Miseq测序得到的PE reads根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤；使用Vearch软件进行聚类操作，将序列按照彼此的相似性归为许多OUT，采用RDP classifier贝叶斯算法在97％的相似水平下的OTU进行生物信息统计分析，并使用Silva数据库进行比对。

3.2肠道菌群物种差异分析

使用mothur软件的Metastats分析组间显著性差异，找出两组中具有显著差异的微生物类型，使用R及其qvalue包的Kruskal-Wallis秩和检验计算多组独立数据均值之间的差异，使用R及其stats包的Wilcoxon检验比较两个配对组之间的差异并分析这些差异，同时使用R的pROC分析绘制ROC曲线并计算其AUC面积。

4、结果

测序数据及OUT信息如表2所示，Case代表肌少症患者，CON代表健康对照。

物种多样性分析结果如图1所示，在水平方向，物种的丰度由曲线的宽度来反映，物种的丰度越高，曲线在横轴上的范围越大；曲线的形状(平滑程度)反映了样本中物种的均度，曲线越平缓，物种分布越均匀。

物种差异性分析结果显示Anaerofilum丰度水平显著增加(P＝0.000693)，差异情况如图2所示，ROC曲线分析显示，AUC为0.705，提示Anaerofilum可作为检测标志物应用于肌少症的诊断。

表2测序数据以及OUT数目统计

实施例2验证Anaerofilum与肌少症之间的相关性

1、研究对象和样本收集

按照实施例1的方式收集肌少症的样本11例以及健康人的样本72例。患者资料统计如表3所示。

表3患者信息

2、16S rRNA测序及数据分析同实施例1。

3、结果

检测结果显示，Anaerofilum丰度水平显著增加(P＝1.25773E-05)，上调约7.43倍。ROC曲线结果显示，AUC值为0.783，最佳临界值的特异性为0.889，敏感性为0.6369(图3)，提示将Anaerofilum应用于肌少症的诊断具有较高的诊断效能。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。